關(guān)于高等動物基因哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)基因治療轉(zhuǎn)基因動物與動物反應(yīng)器哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)高等動物基因工程的基本概念第七章高等動物基因工程第2頁,共86頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)高等動物基因工程的基本概念高等動物基因工程哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)高等動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物個(gè)體動物工程細(xì)胞哺乳動物品種改良疾病模型用于藥物篩選研究基因治療蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研究評價(jià)模型第3頁,共86頁，2024年2月25日，星期天D哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移方法第二節(jié)哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)C哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的載體系統(tǒng)B哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的受體系統(tǒng)A哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)E提高哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白的方法及應(yīng)用第4頁,共86頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)的蛋白與天然蛋白在結(jié)構(gòu)、糖基化、磷酸化、寡聚體類型和方式上幾乎相同，且能正確組裝成多亞基蛋白。如EPO（促紅細(xì)胞生成素）缺點(diǎn)：哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)水平低；獲得高表達(dá)細(xì)胞株所需的時(shí)間長；細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的成本高；哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)類藥物的成本較高；（一）哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)：第5頁,共86頁，2024年2月25日，星期天哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成受體系統(tǒng)載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)第6頁,共86頁，2024年2月25日，星期天（1）正常的哺乳類動物細(xì)胞具有四大生物學(xué)特征:

（二）哺乳動物宿主系統(tǒng)錨地依賴性：細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長因子才能生長接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長便受到抑制形態(tài)依賴性：細(xì)胞扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)第7頁,共86頁，2024年2月25日，星期天（2）高效表達(dá)外源基因受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件：細(xì)胞系特征

喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大規(guī)模培養(yǎng)合適的標(biāo)記

便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持遺傳穩(wěn)定性

外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存生長快且齊

分裂周期短，生長均一，便于控制安全性能好

不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌第8頁,共86頁，2024年2月25日，星期天(3)常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞1.迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動物受體細(xì)胞主要是中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）其優(yōu)勢有如下幾個(gè)方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞（GRAS）第9頁,共86頁，2024年2月25日，星期天2.1981年，Gluzman用編碼野生型T抗原但復(fù)制起點(diǎn)缺失的SV40，轉(zhuǎn)化允許SV40裂解性生長的非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1，獲得了三個(gè)細(xì)胞系：COS1、COS3、COS7。這三個(gè)細(xì)胞系均含有T抗原，保留完全的允許SV40裂解性生長的能力（被廣泛地用于瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)）。T抗原作用：當(dāng)表達(dá)產(chǎn)生的T抗原結(jié)合到SV40的復(fù)制點(diǎn)的DNA調(diào)控區(qū)，病毒DNA的復(fù)制即被啟動。

思考：COS細(xì)胞作宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)勢？第10頁,共86頁，2024年2月25日，星期天3.

BHK-21：1961年從地鼠幼鼠的腎臟分離而來成果：用它表達(dá)的重組凝血因子VIII已獲準(zhǔn)投放市場。4.C127細(xì)胞：來自RIII小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞，特別適用于帶有牛乳頭瘤病毒（BPV）載體的轉(zhuǎn)染：用C127細(xì)胞生產(chǎn)的重組人生長激素（hGH）已獲準(zhǔn)投放市場，用于治療生長激素缺乏癥。5.MDCK細(xì)胞：1958年從成年雌性的西班牙長耳狗的腎臟分離獲得的，是貼壁生長的上皮樣細(xì)胞：有報(bào)道用該細(xì)胞結(jié)合人巨細(xì)胞病毒早早期啟動子可高效表達(dá)分泌蛋白，表達(dá)量占細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)總量的15%～20%。第11頁,共86頁，2024年2月25日，星期天(4)高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP次黃嘌呤（H）GMPAMP）尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途徑嘧啶核苷酸生物合成途徑次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK）氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）從頭合成途徑補(bǔ)救合成途徑氨基喋呤（AP）第12頁,共86頁，2024年2月25日，星期天二氫葉酸還原酶（DHR）第13頁,共86頁，2024年2月25日，星期天黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）第14頁,共86頁，2024年2月25日，星期天高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的（tk-）受體細(xì)胞不能在含有次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補(bǔ)含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的不能在含有次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補(bǔ)（hprt-）受體細(xì)胞第15頁,共86頁，2024年2月25日，星期天高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記哺乳動物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機(jī)理APH

氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 G418 APH滅活G418DHFR-

二氫葉酸還原酶 氨甲喋呤 DHFR變體抗氨甲喋呤

HPH-

潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素B HPH滅活潮霉素B

TK-

胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK合成TMPXGPRT-

黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMPADA-

腺嘌呤核苷脫氨酶 腺嘌呤木酮糖苷ADA滅活Xyl-A第16頁,共86頁，2024年2月25日，星期天（三）哺乳動物細(xì)胞載體系統(tǒng)(1)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體應(yīng)具備的條件：①基本的元件：增強(qiáng)子、終止信號和poly(A)信號、多克隆位點(diǎn)、剪接信號、篩選標(biāo)記等；②易于擴(kuò)增至足夠數(shù)量，能夠在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在、不丟失：哺乳動物細(xì)胞無天然質(zhì)粒；③能夠在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的強(qiáng)啟動子：一般細(xì)胞不過量表達(dá)蛋白第17頁,共86頁，2024年2月25日，星期天（1）病毒類載體人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA第18頁,共86頁，2024年2月25日，星期天1.人腺病毒DNA腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個(gè)成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個(gè)屬。目前已鑒定的人腺病毒腺病毒的生物學(xué)特性有6個(gè)亞屬，其中常用來構(gòu)建載體的主要是C亞屬的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒感染人細(xì)胞時(shí)呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。第19頁,共86頁，2024年2月25日，星期天201.腺病毒結(jié)構(gòu)第20頁,共86頁，2024年2月25日，星期天腺病毒感染細(xì)胞過程第21頁,共86頁，2024年2月25日，星期天人腺病毒DNA腺病毒的基因組DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5腺病毒基因組DNA全長36kb，其包裝上限為原基因組的105%，DNA兩端各有一個(gè)反向重復(fù)序列（ITR）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子，L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因；IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。E3區(qū)缺失只會影響病毒顆粒的成熟，不影響基因組的復(fù)制功能，因而在構(gòu)建載體時(shí)往往除去這個(gè)2.2kb的片段，使得載體的裝載量提高到4kb以上。第22頁,共86頁，2024年2月25日，星期天重組腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建原理1)腺病毒載體第23頁,共86頁，2024年2月25日，星期天2)轉(zhuǎn)移載體第24頁,共86頁，2024年2月25日，星期天3)構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體第25頁,共86頁，2024年2月25日，星期天(續(xù))第26頁,共86頁，2024年2月25日，星期天人腺病毒DNA基因重排低外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個(gè)周期腺病毒DNA載體的特點(diǎn)安全性能好不整合人的染色體DNA，不會導(dǎo)致惡性腫瘤宿主范圍廣對受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格使用效果好外源基因在載體上容易高效表達(dá)第27頁,共86頁，2024年2月25日，星期天2.猴多瘤病毒DNA（SV40）

SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNASV40的生物學(xué)特性SV40可以與所有哺乳動物宿主細(xì)胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。

SV40感染猴細(xì)胞時(shí)呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。第28頁,共86頁，2024年2月25日，星期天猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的基因組DNAt/T基因編碼病毒的小抗原和大SV40DNAoriVP2TVP3VP1t抗原與病毒的致癌作用密切相關(guān)

SV40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期狀態(tài)時(shí)，每個(gè)宿主細(xì)胞含有105個(gè)病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達(dá)外源蛋白第29頁,共86頁，2024年2月25日，星期天猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建

重組的SV40DNA分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細(xì)胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。AproriviralgenegptSV40oripV2-GPTpBR322pBR322SV40

pV2-GPT是一種SV40DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其中g(shù)pt為細(xì)菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔b-珠蛋白.第30頁,共86頁，2024年2月25日，星期天猴多瘤病毒DNA（SV40）利用SV40DNA載體表達(dá)外源基因的程序SV40載體病毒晚期基因啟動子篩選標(biāo)記ori缺陷的SV40輔助病毒去除細(xì)菌序列插入外源基因重組分子分離病毒DNA轉(zhuǎn)化篩選增殖感染第31頁,共86頁，2024年2月25日，星期天猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表達(dá)好外源基因能高效表達(dá)SV40DNA載體的特點(diǎn)基因重排高病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞裝載量較小第32頁,共86頁，2024年2月25日，星期天3.人乳多瘤病毒DNA（BKV）

人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨(dú)立于染色體而自人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性主復(fù)制，每個(gè)宿主細(xì)胞最高可達(dá)500個(gè)拷貝。第33頁,共86頁，2024年2月25日，星期天人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建BKV-E.coli穿梭載體BKVoriBKVgeneDREMMTPAprE.colioriSV40PNeor刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成穿梭載體，它不能整合，同時(shí)也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細(xì)胞。安裝細(xì)胞色素P450dioxin介導(dǎo)的增強(qiáng)子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動子MMTP，由其帶動外源基因的表達(dá)。SV40來源的啟動子控制Neor

標(biāo)記基因，以G418篩選重組子。以此載體在人細(xì)胞系中表達(dá)b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。第34頁,共86頁，2024年2月25日，星期天4.人牛痘病毒DNA人牛痘病毒是一個(gè)大型DNA病毒，基因組長185kb，能在宿主細(xì)胞質(zhì)中自主復(fù)制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建人牛痘病毒的生物學(xué)特性出的重組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的病毒啟動子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外DNA重組很困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。第35頁,共86頁，2024年2月25日，星期天人牛痘病毒DNA目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒其基因組上插入了一個(gè)可表達(dá)的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在人牛痘病毒DNA表達(dá)載體的構(gòu)建外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，先以上述的重組病毒感染細(xì)胞，使其大量表達(dá)T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7啟動子的細(xì)菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物受體細(xì)胞，此時(shí)外源基因整合在受體細(xì)胞染色體DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達(dá)出重組蛋白。人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達(dá)的。第36頁,共86頁，2024年2月25日，星期天人牛痘病毒DNA利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序牛痘病毒啟動子T7RNA聚合酶基因T7啟動子外源基因細(xì)菌重組質(zhì)粒感染轉(zhuǎn)化培養(yǎng)收集第37頁,共86頁，2024年2月25日，星期天哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法（四）哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移第38頁,共86頁，2024年2月25日，星期天(1)哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是外源基因表達(dá)盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。但外源基因表達(dá)盒進(jìn)入受體細(xì)胞后，往往以多拷貝的形式隨機(jī)整合在染色體DNA上，導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活、外源基因不表達(dá)。第39頁,共86頁，2024年2月25日，星期天哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此時(shí)DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；此時(shí)細(xì)胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便進(jìn)入受體細(xì)胞；1.磷酸鈣共沉淀法將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃保溫4-16小時(shí)棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。如果在外源DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性DNA可以提高轉(zhuǎn)化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒DNA，可使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。第40頁,共86頁，2024年2月25日，星期天哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解受體細(xì)胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時(shí)高壓電場，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時(shí)電擊轉(zhuǎn)化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細(xì)胞類型，如生長在懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。2.電擊轉(zhuǎn)化法DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。第41頁,共86頁，2024年2月25日，星期天電轉(zhuǎn)化設(shè)備第42頁,共86頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共86頁，2024年2月25日，星期天哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。合，DNA隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細(xì)胞和HeLa3.脂質(zhì)體介導(dǎo)法將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會與受體細(xì)胞膜融細(xì)胞。第44頁,共86頁，2024年2月25日，星期天脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體(liposome)是用人工方法將磷脂和相似的兩性脂質(zhì)在水溶液中形成一種脂質(zhì)雙層包圍水溶液的微球。第45頁,共86頁，2024年2月25日，星期天哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法

血影細(xì)胞是指哺乳動物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞同時(shí)，外源DNA也容易進(jìn)入。當(dāng)上述外界條件消失后，紅細(xì)胞膜又可恢復(fù)原來的通透性。因此，可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細(xì)胞，然后再將4.血影細(xì)胞介導(dǎo)法核結(jié)構(gòu)。在溶血過程中，紅細(xì)胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。第46頁,共86頁，2024年2月25日，星期天(2)哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。這種方法具有定向性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家禽和牲畜細(xì)胞等。第47頁,共86頁，2024年2月25日，星期天提高哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本方法利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIII（五）提高哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白的方法及應(yīng)用第48頁,共86頁，2024年2月25日，星期天(1)提高哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本方法目的基因在哺乳動物細(xì)胞，如CHO中的高效表達(dá)的策略主要針對三個(gè)方面來進(jìn)行考慮：載體、目的基因和宿主細(xì)胞

第49頁,共86頁，2024年2月25日，星期天一、載體改造第50頁,共86頁，2024年2月25日，星期天基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是動物細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細(xì)胞中，dhfr基因均得以擴(kuò)增。這些抗性細(xì)胞正是通過增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶1.增加目的基因的拷貝數(shù)（DHFR）的特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多的表達(dá)水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的基因擴(kuò)增現(xiàn)象域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時(shí)被擴(kuò)增。1）運(yùn)用共擴(kuò)增基因做選擇標(biāo)記增加目的基因的拷貝數(shù)(1)轉(zhuǎn)錄前水平第51頁,共86頁，2024年2月25日，星期天DHFR-MTX高效表達(dá)系統(tǒng)外源基因dhfr轉(zhuǎn)染dhfr-細(xì)胞系單克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)移0.05mMMTX培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移5mMMTX0.25mMMTX培養(yǎng)單克隆外源基因擴(kuò)增至100拷貝第52頁,共86頁，2024年2月25日，星期天GS-MSX高效表達(dá)系統(tǒng)

谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亞砜（MSX）對動物細(xì)胞的毒害作用。先將帶有GS編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)中不必使用GS缺陷型的受體細(xì)胞，而且在正常的MSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是GS-MSX系統(tǒng)比DHFR-胞中，由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉(zhuǎn)染過程MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。第53頁,共86頁，2024年2月25日，星期天具體實(shí)例：將選擇基因通過一段寡聚核苷酸連在目的基因的3′端（如圖）。前體mRNA在翻譯時(shí),位于目的基因3′端下游的共擴(kuò)增基因的翻譯起始的效率大大降低,導(dǎo)致翻譯水平明顯低于上游的目的基因.2）通過選擇基因的弱化表達(dá)增加拷貝數(shù)第54頁,共86頁，2024年2月25日，星期天1）在載體上添加染色體上的某些特定序列

在載體上添加染色體上的某些特定序列（如骨架/基質(zhì)附著區(qū)SAR/MAR)使表達(dá)載體整合到宿主細(xì)胞的染色體后能模擬染色體的高轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，從而使形成的陽性克隆較均一地高效表達(dá)目的基因。2）基因定點(diǎn)整合至高表達(dá)區(qū)

類似基因打靶，在重組酶的介導(dǎo)下定點(diǎn)整合到染色體轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)2.整合位點(diǎn)的優(yōu)化第55頁,共86頁，2024年2月25日，星期天(2)轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控可以概括為順式作用元件與反式作用因子的相互作用。它們分別由表達(dá)載體和宿主細(xì)胞提供。因此,表達(dá)載體的元件組成及結(jié)構(gòu)是CHO細(xì)胞高效表達(dá)外源基因的關(guān)鍵因素之一。第56頁,共86頁，2024年2月25日，星期天

在載體上安裝病毒或細(xì)胞來源的強(qiáng)啟AprM13oriColE1oriCMVPPolylinkerGeneIntronSV40TPolyAsignal高效表達(dá)載體mRNA前體AAAAAAAAAmRNA動子和增強(qiáng)子，是使外源基因高效表達(dá)的一種手段，如：細(xì)胞巨化病毒CMV的啟動子（CMVP)SV40的終止子（SV40T)

1.選擇強(qiáng)啟動子和增強(qiáng)子2.在目的基因編碼區(qū)尾端添加強(qiáng)的終止子區(qū)域其它強(qiáng)終止子：T抗原、乙型肝炎病毒表面抗原序列或β2珠蛋白終止子等。第57頁,共86頁，2024年2月25日，星期天1、選擇高效多聚腺苷酸加尾信號(pA)

真核基因的hnRNA的加工過程需要多聚腺苷酸加尾信號(pA)。前者多采用SV40的晚期及早期pA、牛生長激素基因的pA和人工合成的pA.PolyA是mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式。PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。Poly(A)的作用:（3）轉(zhuǎn)錄后水平第58頁,共86頁，2024年2月25日，星期天2.剪接信號的運(yùn)用絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)型載體上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因?yàn)閙RNA前體的剪切能促進(jìn)成熟mRNA向胞質(zhì)的運(yùn)輸，有利于翻譯。動物珠蛋白基因的內(nèi)含子、SV40的內(nèi)含子第59頁,共86頁，2024年2月25日，星期天2.提高轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平轉(zhuǎn)錄因子通過DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異識別并結(jié)合目標(biāo)基因的調(diào)控序列，并通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活或募集轉(zhuǎn)錄作用因子(如RNA聚合酶)至啟動子從而增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。第60頁,共86頁，2024年2月25日，星期天(4)翻譯水平第61頁,共86頁，2024年2月25日，星期天1.添加Kozak序列

Kozak系統(tǒng)分析了mRNA的5′端的序列與翻譯效率的關(guān)系。結(jié)果表明：最有效的翻譯起始的共有序列是5′－CCA/GCCATGG－3′(劃線的為起始密碼子)，而且最重要的是－3位的嘌呤，其次是+4位的G.實(shí)驗(yàn)表明：具有Kozak序列與否將使翻譯起始的差異在一個(gè)數(shù)量級。第62頁,共86頁，2024年2月25日，星期天

內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）是從細(xì)小RNA病毒中發(fā)現(xiàn)的，由它連接的開放閱讀框架可以同時(shí)翻譯。IRES序列被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建雙順反子或多順反子哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體。用IRES構(gòu)建多個(gè)順反子表達(dá)載體，可以表達(dá)多亞基蛋白。2.通過IRES表達(dá)多亞基蛋白第63頁,共86頁，2024年2月25日，星期天3.通過翻譯增強(qiáng)子提高翻譯效率

翻譯增強(qiáng)子是具有與IRES不同二級結(jié)構(gòu)的另一類提高翻譯起始效率的順式調(diào)控元件。1998年stein等發(fā)現(xiàn)在組織缺氧情況下VEGFmRNA壽命大為提高。VEGF翻譯增強(qiáng)的程度可高達(dá)40倍，由此發(fā)現(xiàn)了翻譯增強(qiáng)子。第64頁,共86頁，2024年2月25日，星期天（1)利用密碼子的偏好性根據(jù)密碼子的偏好性，在不改變蛋白質(zhì)編碼序列的前提下盡量使用CHO細(xì)胞常用的密碼子對基因進(jìn)行改造實(shí)例：Kim等用人高表達(dá)基因偏愛的密碼子系統(tǒng)地設(shè)計(jì)了人的EPO基因，再以酵母偏愛的密碼子編碼人的EPO基因作對照來比較優(yōu)化后的人EPO基因的表達(dá)效率。結(jié)果表明，優(yōu)化的人EPO基因密碼子比非優(yōu)化的人EPO基因密碼子的表達(dá)效率高2－3倍。二、基因改造第65頁,共86頁，2024年2月25日，星期天（2)盡量使用基因組DNA基因組DNA比cDNA表達(dá)量要高。因此，在可能的條件下，盡量使用基因組DNA。若用cDNA，則盡量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低轉(zhuǎn)錄、翻譯時(shí)不必要的能量消耗，另一方面減少5′未翻譯前導(dǎo)區(qū)和克隆中的GC尾部對表達(dá)水平的不良影響。第66頁,共86頁，2024年2月25日，星期天三、宿主改造（1）增強(qiáng)CHO細(xì)胞抗細(xì)胞凋亡活性；（2）使CHO細(xì)胞可在無血清培養(yǎng)基（PFM）中自分泌生長；（3）減少CHO細(xì)胞中有害代謝物的產(chǎn)生；（4）控制CHO細(xì)胞增殖速率；第67頁,共86頁，2024年2月25日，星期天迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但在哺乳動物工程細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：b

干擾素 g

干擾素凝血因子VIII 凝血因子IX促紅細(xì)胞生成素（EPO）

人生長因子（hGH）白介素2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原單克隆抗體 CD4受體組織型纖溶酶原激活劑（tPA） （2）利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的實(shí)例第68頁,共86頁，2024年2月25日，星期天1.利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體大多數(shù)惡性淋巴Neor鼠金屬硫蛋白啟動子b

肌動蛋白啟動子抗體輕鏈cDNAb

肌動蛋白終止子pLdhfrSV40啟動子b

肌動蛋白啟動子抗體重鏈cDNAb

肌動蛋白終止子pH瘤細(xì)胞表面上都有一種特異性的糖蛋白campath，用人源化的小鼠抗campath抗體治療非霍杰金淋巴細(xì)胞瘤患者，效果良好。重組抗體采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)。第69頁,共86頁，2024年2月25日，星期天2.利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑第一個(gè)由重組哺乳動物dhfr啟動子人tPAcDNA終止子細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白是治療急性心肌梗塞的溶血栓藥物：人組織纖溶酶原激活劑（tPA）。同樣采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)，受體細(xì)胞選用CHO系統(tǒng)。目前，用該工藝路線生產(chǎn)的重組人tPA已經(jīng)商品化。信號肽編碼序列此外，人tPA也可由重組大腸桿菌生產(chǎn)，但蛋白的重折疊效率低。第70頁,共86頁，2024年2月25日，星期天t-PA的二級結(jié)構(gòu)第71頁,共86頁，2024年2月25日，星期天第72頁,共86頁，2024年2月25日，星期天第73頁,共86頁，2024年2月25日，星期天第74頁,共86頁，2024年2月25日，星期天第75頁,共86頁，2024年2月25日，星期天第76頁,共86頁，2024年2月25日，星期