MLL重排白血病人源化小鼠模型的建立及系別轉(zhuǎn)換的研究背景及目的:MLL基因重排是兒童和成人白血病中常見的遺傳學(xué)異常,MLL重排白血病具有獨(dú)特的生物學(xué)和臨床特征,已成為急性白血病的一種獨(dú)立亞型。然而,目前我們對MLL-r白血病的病因、發(fā)病機(jī)制及其系別轉(zhuǎn)換的原因等問題尚不十分明確。本研究以MLL-r急性白血病中常見的MLL-AF9融合基因?yàn)檠芯繉ο?通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人胚胎肝臟造血干細(xì)胞或成人骨髓造血干細(xì)胞,并移植入免疫缺陷小鼠,建立MLL-AF9白血病人源化小鼠模型;同時(shí)利用該模型探討微環(huán)境(細(xì)胞因子)和靶細(xì)胞(胚胎造血干細(xì)胞、成人骨髓造血干細(xì)胞)對MLL-r白血病系別決定、轉(zhuǎn)換的影響。方法:1.通過MLL-AF9逆轉(zhuǎn)錄病毒感染不同來源(人胚胎和健康成人骨髓)的CD34+造血干細(xì)胞,并植入NSG或NSG/SGM3免疫缺陷小鼠,建立MLL-AF9白血病人源化小鼠模型。2.通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)等多種方法明確上述人源化小鼠模型中MLL-AF9白血病的類型,比較不同來源的造血干細(xì)胞和微環(huán)境對MLL-AF9白血病系別決定的影響。3.通過高壓靜脈注射IL-3質(zhì)粒誘導(dǎo)NSG小鼠表達(dá)人IL-3,并將原代MLL-AF9白血病細(xì)胞在上述NSG小鼠中傳代,探討人IL-3對MLL-AF9白血病發(fā)生、系別決定、轉(zhuǎn)換的影響。4.通過Southern印跡雜交和IGH基因重排等方法,對上述MLL-AF9白血病進(jìn)行克隆性分析。結(jié)果:1.MLL-AF9逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人胚胎肝臟CD34+造血干細(xì)胞可在NSG小鼠誘發(fā)ALL通過MLL-AF9逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人胚胎肝臟CD34+造血干細(xì)胞(以下簡稱MLL-AF9hFLCs),并經(jīng)尾靜脈注射經(jīng)亞致死劑量照射的NSG免疫缺陷小鼠(以下簡稱MLL-AF9hFLCs-NSG),定期檢測NSG小鼠一般情況及外周血白血病細(xì)胞比例。MLL-AF9hFLCs-NSG小鼠移植后中位生存時(shí)間為183.0(179.0-192.0)天,肝臟、脾臟明顯增大,于外周血、骨髓、肝臟和脾臟等外周器官檢測到大量GFP+白血病細(xì)胞,此類細(xì)胞形態(tài)及免疫表型與人MLL-r急性B淋巴細(xì)胞白血病高度類似,提示MLL-AF9hFLCs可在NSG小鼠誘發(fā)ALL(以下簡稱MLL-AF9hFLCs-NSGALL)。將上述MLL-AF9hFLCs-NSG小鼠的骨髓中的ALL細(xì)胞在NSG小鼠中傳代,結(jié)果顯示大于等于5×102的細(xì)胞即可在第二代NSG小鼠中誘發(fā)ALL,且白血病細(xì)胞形態(tài)、免疫表型均與原代MLL-AF9hFLCs-NSGALL一致。2.MLL-AF9hFLCs可在NSG/SGM3小鼠誘發(fā)AML將與結(jié)果1中相同的MLL-AF9hFLCs經(jīng)尾靜脈注射入經(jīng)亞致死劑量照射的可表達(dá)人IL-3、SCF和GM-CSF的NSG/SGM3免疫缺陷小鼠(以下簡稱MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3)。MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3小鼠移植后中位生存時(shí)間為34.0(34.0-36.0)天,肝臟、脾臟明顯增大,于外周血、骨髓、肝臟和脾臟等器官檢測到大量GFP+白血病細(xì)胞,其細(xì)胞形態(tài)及免疫表型與人MLL-r急性髓系白血病高度類似,提示MLL-AF9hFLCs可在NSG/SGM3小鼠誘發(fā)AML(以下簡稱MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3AML)。將不同數(shù)目的來源于MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3小鼠骨髓的AML細(xì)胞經(jīng)靜脈注射植入NSG/SGM3小鼠,顯示AML細(xì)胞數(shù)需大于等于1×105才可能在第二代NSG/SGM3小鼠中誘發(fā)AML,其白血病細(xì)胞形態(tài)、免疫表型均與原代MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3AML一致。3.MLL-AF9逆轉(zhuǎn)錄病毒感染健康成人骨髓CD34+造血干細(xì)胞在NSG小鼠未能誘發(fā)白血病將MLL-AF9逆轉(zhuǎn)錄病毒感染健康成人骨髓CD34+造血干細(xì)胞(以下簡稱MLL-AF9aBMCs),經(jīng)骨髓腔內(nèi)注射植入經(jīng)亞致死劑量照射的NSG小鼠(簡稱為MLL-AF9aBMCs-NSG)。移植后未能在MLL-AF9aBMCs-NSG小鼠外周血中檢測到GFP+白血病細(xì)胞,但可以檢測到小于1%的人CD45+GFP-細(xì)胞。于移植后21周行骨髓穿刺術(shù),可以在NSG小鼠骨髓細(xì)胞中檢測到人CD45+細(xì)胞(占骨髓單個(gè)核細(xì)胞比例分別為9.5%、1.8%和2.6%),且均為人CD45+GPF-細(xì)胞,并未檢測到GFP+細(xì)胞。上述MLL-AF9aBMCs-NSG小鼠均健康存活至移植后第50周,安樂死處死并解剖后發(fā)現(xiàn)其肝臟和脾臟大小正常,外周血、脾臟和骨髓均未檢測到GFP陽性細(xì)胞,但骨髓中仍可以檢測到少量人CD45+GFP-細(xì)胞。4.MLL-AF9aBMCs可在NSG/SGM3小鼠誘發(fā)AML將與結(jié)果3中相同的MLL-AF9aBMCs經(jīng)骨髓腔內(nèi)注射植入經(jīng)亞致死劑量照射的NSG/SGM3免疫缺陷小鼠(以下簡稱為MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3)。MLL-AF9aBMCs-NSG/SGM3小鼠移植后中位生存時(shí)間為99.0(84.0-113.0)天。大體解剖顯示肝臟、脾臟明顯增大;于外周血、骨髓、肝臟和脾臟等外周器官檢測到大量GFP+白血病細(xì)胞,此類細(xì)胞形態(tài)及免疫表型與人類MLL-r急性髓系白血病細(xì)胞高度類似,提示MLL-AF9aBMCs可在NSG/SGM3小鼠誘發(fā)AML(以下簡稱MLL-AF9aBMCs-NSG/SGM3AML),但其潛伏期明顯長于MLL-AF9hFLCs在NSG/SGM3小鼠誘發(fā)AML。同樣,將上述MLL-AF9aBMCs-NSG/SGM3小鼠的骨髓AML細(xì)胞在NSG/SGM3小鼠中傳代,顯示輸注的細(xì)胞數(shù)需大于等于5×106才可能在第二代NSG/SGM3小鼠中誘發(fā)AML,其白血病細(xì)胞形態(tài)、免疫表型均與原代MLL-AF9aBMCs-NSG/SGM3AML一致。5.靜脈高壓注射IL-3質(zhì)?？杉铀費(fèi)LL-AF9hFLCs-NSG/SGM3AML細(xì)胞在NSG小鼠的植入及遷移MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3AML白血病細(xì)胞表面表達(dá)人IL-3受體(huIL-3R、huCD123),不表達(dá)或低表達(dá)人SCF受體(huSCFR、huCD117)和人GM-CSF受體(huGM-CSFR、huCD117)。比較MLL-AF9hFLCsNSG/SGM3AML白血病細(xì)胞在高壓靜脈注射IL-3質(zhì)粒的NSG小鼠和對照組NSG小鼠的致病情況,MLL-AF9hFLCsNSG/SGM3AML可導(dǎo)致高壓靜脈注射IL-3質(zhì)粒的NSG小鼠(5/5)發(fā)生白血病,3/5的小鼠在觀察期內(nèi)(移植后37周)死亡;對照組NSG小鼠觀察期內(nèi)未能在外周血檢測到人GFP+白血病細(xì)胞,但4/5小鼠骨髓內(nèi)長期存在人GFP+白血病細(xì)胞,5/5小鼠觀察期內(nèi)均健康存活。6.原代MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3AML細(xì)胞植入IL-3質(zhì)粒高壓靜脈注射的NSG小鼠后可發(fā)生急性混合譜系白血病將原代MLL-AF9hFLCsNSG/SGM3AML白血病細(xì)胞輸入經(jīng)IL-3質(zhì)粒高壓靜脈注射的NSG小鼠,3/5小鼠發(fā)生與輸注的原代細(xì)胞特征相同的AML(簡稱2°MLL-AF9hFLCsAML);2/5小鼠的發(fā)生MLL(簡稱2°MLL-AF9hFLCsMLL),即同時(shí)存在兩類GFP+白血病細(xì)胞,分別為CD19+CD33-GFP+(簡稱2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD19+)和CD19-CD33+GFP+(簡稱2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD33+)白血病細(xì)胞,二者的細(xì)胞形態(tài)、免疫表型分別與ALL和AML一致。我們分別對原代及二代白血病細(xì)胞進(jìn)行克隆性分析。Southern印跡雜交的結(jié)果顯示原代MLL-AF9hFLCsNSG/SGM3AML、2°MLL-AF9hFLCsAML、2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD19+和2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD33+具有相同的克隆起源。IGH重排結(jié)果顯示2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD19+發(fā)生IGH基因重排,原代MLL-AF9hFLCsNSG/SGM3AML、2°MLL-AF9AML、2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD33+則未檢測到IGH基因重排。結(jié)論:1.利用MLL-AF9逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人胚胎肝臟造血干細(xì)胞可