消融聯(lián)合瘤周注射免疫佐劑誘導(dǎo)小鼠抗肝癌主動(dòng)免疫效應(yīng)系列研究第一部分：不同溫度熱消融小鼠皮下移植性肝癌的實(shí)驗(yàn)研究目的：通過(guò)對(duì)小鼠皮下移植性肝癌進(jìn)行不同溫度的熱生理鹽水消融,觀察小鼠生存時(shí)間、肝癌體積大小、消融灶內(nèi)免疫細(xì)胞及熱休克蛋白的變化,探討誘導(dǎo)有效免疫反應(yīng)的合適消融溫度。方法：共120只C57BL/6J小鼠皮下種瘤成功后,隨機(jī)分為50℃、60℃、70℃、100℃及對(duì)照組共5組,每組24只；7-12天后,腫瘤長(zhǎng)徑、短徑約6～8mm時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),在各組小鼠的皮下瘤內(nèi)按各組溫度注射不同溫度熱生理鹽水0.15m1進(jìn)行消融,每組各取6只觀察小鼠生存時(shí)間,6只于第15日觀察腫瘤大小變化及取下腫瘤標(biāo)本做HE染色,同時(shí)計(jì)算肝癌殘留率,6只于消融后第72小時(shí)取腫瘤標(biāo)本做免疫組化CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè),6只于消融后第24小時(shí)取腫瘤標(biāo)本做免疫組化HSP70單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果：①小鼠生存時(shí)間：各組小鼠生存時(shí)間不全相等(P<0.05),50℃組生存時(shí)間較長(zhǎng),對(duì)照組最短。②腫瘤體積大小變化：各消融組體積均顯著小于對(duì)照組(P<0.05)；與消融前腫瘤體積比較,50℃組是唯一一組較消融前腫瘤明顯縮小的組別(P<0.05)。③HE染色結(jié)果：經(jīng)HE染色證實(shí),對(duì)照組標(biāo)本中無(wú)腫瘤細(xì)胞壞死,肝癌殘留率為100%；50℃組中1個(gè)標(biāo)本可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞殘留,肝癌殘留率為16.7%；剩余三組中每組2個(gè)標(biāo)本可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞殘留,肝癌殘留率為33.3%。④免疫組化結(jié)果：50℃組CD4+細(xì)胞數(shù)量顯著高于其它各組(P<0.05),CD8+細(xì)胞50℃組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P>0.05),但高于其它熱消融組(P<0.05)；50℃C組CD4+/CD8+比值升高最為明顯；HSP70標(biāo)記指數(shù)熱消融組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),標(biāo)記指數(shù)在各組中隨溫度升高而降低,即50℃組最高,對(duì)照組最低。結(jié)論：在熱生理鹽水消融皮下移植性肝癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,50℃左右的消融溫度可能更有利于誘導(dǎo)產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的主動(dòng)免疫效應(yīng)。第二部分：熱消融聯(lián)合消融灶周邊注射CpGODN對(duì)小鼠肝癌生長(zhǎng)抑制作用的研究目的探討熱消融聯(lián)合消融灶周邊注射CpGODN治療對(duì)小鼠肝癌的影響以及繼發(fā)免疫效應(yīng)的抗腫瘤效果。方法建立Hepal-6小鼠皮下肝癌動(dòng)物模型,隨機(jī)分為100℃熱消融治療組,100℃熱消融聯(lián)合CpGODN治療組、CpGODN治療組和對(duì)照組,8只于接種腫瘤細(xì)胞后第7天、第14天給予治療,測(cè)量小鼠腫瘤體積,觀察荷瘤小鼠存活情況及消融灶內(nèi)淋巴細(xì)胞和HSP70變化,另8只第7天給予治療,30d后對(duì)側(cè)接種等量腫瘤細(xì)胞,1月后處死,觀察小鼠生存狀況及對(duì)側(cè)種瘤生長(zhǎng)情況結(jié)果①各實(shí)驗(yàn)組小鼠觀察期內(nèi)死亡率均低于對(duì)照組(P<0.05),各實(shí)驗(yàn)組對(duì)側(cè)均無(wú)腫瘤生長(zhǎng),對(duì)照組再接種腫瘤生長(zhǎng)率為100%(3/3),兩者相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；②各實(shí)驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組相比,腫瘤體積顯著縮小(P<0.05),聯(lián)合治療組腫瘤縮小更顯著；③各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組有較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(P<0.05),聯(lián)合治療組數(shù)量最多；④各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有更多HSP70表達(dá)(P<0.05),聯(lián)合治療組HSP70表達(dá)最多,與其余實(shí)驗(yàn)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CpGODN對(duì)荷瘤小鼠具有明顯的免疫增強(qiáng)作用,CpGODN聯(lián)合熱消融能有效的治療小鼠肝癌,且能有效的減少?gòu)?fù)發(fā)第三部分：瘤內(nèi)注射MIP-3α對(duì)小鼠肝癌生長(zhǎng)抑制作用的研究目的探討巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3a(MIP-3a)能否在小鼠皮下肝癌灶內(nèi)趨化、募集外周的樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs),使之在原位有效地?cái)z取并提呈腫瘤抗原,誘導(dǎo)針對(duì)肝癌細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答,以達(dá)到控制腫瘤進(jìn)展的目的。方法成功建立小鼠皮下肝癌模型后隨機(jī)分為3組,第10天起分別向MIP-3α治療組、PBS對(duì)照組小鼠皮下腫瘤內(nèi)注射MIP-3α溶液(含MIP-3α0.2μm)及PBS100μl,空白對(duì)照組小鼠不予任何處理。20天后取腫瘤組織,免疫組化法檢測(cè)腫瘤內(nèi)DCs、CD4+、CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤內(nèi)DCs浸潤(rùn)數(shù)量及其表型。另取部分小鼠建立模型,分組、治療方法同前,治療實(shí)驗(yàn)結(jié)束后持續(xù)觀察,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線并觀察生存時(shí)間。結(jié)果①M(fèi)IP-3α治療組小鼠腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的CD4+、CD8+細(xì)胞及DCs數(shù)量均顯著高于其他兩組。②MIP-3α治療組小鼠腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)性DCs的CD80、CD86表達(dá)率顯著高于其他兩組(P<0.05)。③MIP-3α治療組小鼠腫瘤生長(zhǎng)速率顯著低于對(duì)照組(p<0.001),生存時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(p<0.05)。結(jié)論①瘤