關(guān)于酶反應(yīng)動力學(xué)中間產(chǎn)物學(xué)說第一節(jié)單底物酶促動力學(xué)第二節(jié)雙底物酶促反應(yīng)動力學(xué)第三節(jié)酶反應(yīng)影響因素第2頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

中間產(chǎn)物學(xué)說

酶動力學(xué)研究始于1902年，當時，A.Brown用酵母β-呋喃果糖糖苷酶對蔗糖進行水解。他發(fā)現(xiàn)當蔗糖的濃度比酶的濃度高許多時，反應(yīng)速度不再取決于蔗糖的濃度，即是說，反應(yīng)速度相對于蔗糖來說是零級反應(yīng)。因此，他提出，蔗糖水解的總反應(yīng)是由兩個基本反應(yīng)構(gòu)成，第一步是底物與酶形成一種復(fù)合物，第二步是這種中間物生成產(chǎn)物并釋放出酶:

k1k2E+S←→ES→P+Ek-1

這里,E、S、ES和P分別代表酶、底、酶-底物復(fù)合物和產(chǎn)物。中間產(chǎn)物學(xué)說認為,

當酶催化某個反應(yīng)時,酶和底物先結(jié)合形成一個中間復(fù)合物,然后中間復(fù)合物再分解,生成產(chǎn)物并釋放出酶。一般以產(chǎn)物的生成速度代表整個酶催化反應(yīng)速度，而產(chǎn)物的生成取決于中間物的濃度.因此,整個酶促反應(yīng)的速度取決于中間物的濃度.第3頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)單底物酶促動力學(xué)單底物酶促動力學(xué)只有初速度才是酶的反應(yīng)速度，原因：（1）底物隨反應(yīng)時間的延長減少；（2）酶隨反應(yīng)時間的延長受速度、pH的影響，酶部分變性；（3）隨時間延長，產(chǎn)物增加，產(chǎn)物對酶的抑制作用；（4）產(chǎn)物增加，逆反應(yīng)速度增加。

因此，只有初速度才是酶的反應(yīng)速度。第4頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一、酶濃度的影響酶促反應(yīng)的速度和酶濃度成正比[S]>>[E] V∝[E]第5頁,共54頁，2024年2月25日，星期天反應(yīng)速度:用單位時間內(nèi)、單位體積中底物(S)的減少量或產(chǎn)物(P)的增加量來表示。單位：濃度/單位時間引起酶反應(yīng)速度降低的原因：底物濃度的降低；酶的部分失活；產(chǎn)物對酶的抑制；產(chǎn)物增加引起的逆反應(yīng)速度的增加研究酶反應(yīng)速度以酶促反應(yīng)的初速度(initialspeed)為準酶反應(yīng)速度曲線時間產(chǎn)物濃度斜率=[P]/

t=V初速度[P]t第6頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、底物濃度對反應(yīng)速度的影響1、單底物酶促反應(yīng)動力學(xué)（1））米氏方程（Michaelis－MentenequationVVmax[S]可以用一個方程來表示：是最基本的動力學(xué)方程。V=Vmax[S]/(Km+[S])

v=—————Vmax·[S]km+[S]第7頁,共54頁，2024年2月25日，星期天酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線

(條件:[E];pH;t等條件固定不變)在低底物濃度時,反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級反應(yīng)特征;v=k[S]當?shù)孜餄舛容^高時[S]增加,反應(yīng)速度v增加,但增加幅度較小當?shù)孜餄舛冗_到一定值，反應(yīng)速度達到最大值（Vmax），此時再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應(yīng)。v=Vmax

原因:中間產(chǎn)物學(xué)說解釋E+SESE+P第8頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一級反應(yīng)混合級反應(yīng)零級反應(yīng)V[S]第9頁,共54頁，2024年2月25日，星期天中間復(fù)合物學(xué)說：

第一步:E+SES第二步:ES→E+PV∝[ES]1913年Michaelis和Menten推導(dǎo)了米氏方程

第10頁,共54頁，2024年2月25日，星期天酶促反應(yīng)的米氏方程及Km推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照“穩(wěn)態(tài)平衡”假說的設(shè)想進行推導(dǎo)。米氏方程:米氏常數(shù):第11頁,共54頁，2024年2月25日，星期天米氏方程討論當?shù)孜餄舛容^低時,有[S]Km,代入米氏方程則有v=Vmax/Km[S],即反應(yīng)速度與底物濃度呈正比,符合一級反應(yīng)當?shù)孜餄舛群芨邥r,有[S]Km,代入米氏方程則有v=Vmax,即反應(yīng)速度與底物濃度無關(guān),符合零級反應(yīng)當[S]=Km時,v=Vmax/2第12頁,共54頁，2024年2月25日，星期天米氏方程的推導(dǎo)令：將（4）代入（3），則：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：則：(1)經(jīng)整理得：由于酶促反應(yīng)速度由[ES]決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時：當[Et]=[ES]時，(4)所以

第13頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.2.3米氏常數(shù)的意義當v=Vmax/2時，Km=[S]（Km的單位為濃度單位）,即米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時的底物濃度。*

是酶在一定條件下的特征物理常數(shù)，通過測定Km的數(shù)值，可鑒別酶。*

可近似表示酶和底物親合力，Km愈小，E對S的親合力愈大，Km愈大，E對S的親合力愈小。*在已知Km的情況下，應(yīng)用米氏方程可計算任意[s]時的v，或任何v下的[s]。（用Km的倍數(shù)表示）

練習(xí)題：已知某酶的Km值為0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度的80％時底物的濃度應(yīng)為多少？第14頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.2.4米氏常數(shù)的測定基本原則：

將米氏方程變化成相當于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。例：雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）米氏方程的雙倒數(shù)形式：

1Km11—=——.—+——

vVmax[S]Vmax第15頁,共54頁，2024年2月25日，星期天酶動力學(xué)的雙倒數(shù)圖線第16頁,共54頁，2024年2月25日，星期天Km值的物理意義：即是Km值是當酶反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度。(摩爾/升)。Km是酶的一個特性常數(shù)與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶濃度無關(guān)，只是對一定底物、一定的pH、一定的溫度條件而言。V＝Vmax2VmaxVmax[S]Km+[S]2得化簡得：

Km=[S]V＝Km+[S]Vmax[S]

對活細胞的實驗表明：酶的底物濃度通常就在這種底物的Km值附近，不是大大高于或大大低于Km?第17頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.動力學(xué)參數(shù)的意義

(1)Km值的意義

KS=K2K1Km

=K2+K3K1Km=Ks

E+S[ES]P+EK1K3K2K4第18頁,共54頁，2024年2月25日，星期天酶底

物Km（mmol/L）

過氧化氫酶H2O225

脲酶

尿素

23

蔗糖酶蔗糖28棉子糖350谷氨酸脫氫酶谷

氨

酸0.12α—酮戊二酸2.0乳酸脫氫酶丙

酮

酸0.017第19頁,共54頁，2024年2月25日，星期天KM值與米氏方程的實際用途：例：當[S]=3Km時，反應(yīng)速率相當于Vmax的百分數(shù)？V＝Km+[S]Vmax[S]

當Km已知時，任何底物濃度下被酶飽和的百分數(shù)可用下式表示：fES=[s]Km+[s]第20頁,共54頁，2024年2月25日，星期天可幫助推斷某一

代謝反應(yīng)的方向和途徑和限速步驟例：酶1，2，3分別催化

ABCDKm分別為10-2,10-3,10-4，A，B，C濃度均為10-4

限速步驟？123例：丙酮酸可被乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶和丙酮酸脫

羧酶催化，當丙酮酸濃度較低時，走哪條途徑？

Km分別為

1.7×10-5、

1.3×10-3和

1.0×10-3mol/L第21頁,共54頁，2024年2月25日，星期天(2)Vmax和

k3(kcat)的意義Kcat值越大，表示酶的催化效率越高。

E+S[ES]P+EK1K3K2K4(3)Kcat/km的意義Km

=K2+K3K1Kcat/km=K2+K3K3K1上限為108~109mol-1·L·s-1大小可以比較不同酶或同一種酶催化不同底物的催化效率。第22頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3.利用作圖法測定

km和

Vmax

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)作圖

v~[s][s]VVmax2KmVmax第23頁,共54頁，2024年2月25日，星期天雙倒數(shù)作圖法

[S]

1v1~V＝Km+[S]Vmax[S]v1第24頁,共54頁，2024年2月25日，星期天(2)Eadie-Hofstee作圖法[S]

vv~v=Vmax–Km·[S]

v[S]vvVmax–KmKmVmaxV＝Km+[S]Vmax[S]第25頁,共54頁，2024年2月25日，星期天單底物酶促反應(yīng)的反應(yīng)速度與底物濃度呈雙曲線關(guān)系，不易直接求出Vmax和Km的值，通常采用雙倒數(shù)法進行參數(shù)估計。將米氏方程改寫成以下形式以對作圖，繪出曲線，橫軸截距即為－值，縱軸截距則是第26頁,共54頁，2024年2月25日，星期天雙倒數(shù)作圖第27頁,共54頁，2024年2月25日，星期天米氏常數(shù)（Michaelis-constant）的意義a

Km的物理意義當V＝1/2Vmax時的底物濃度，為Km的物理意義。即［S］＝KmKm單位：m(mol)/Lb

Km是酶的特征性常數(shù)

不同酶,Km是不一樣的。底物種類，pH（opt）,T（opt）要定下來。（E）

A＋B

C＋D此酶有4個Km值第28頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共54頁，2024年2月25日，星期天c在一定條件下，Km表示酶與底物的親和力有些酶有很多底物，Km值最小的底物叫此酶的最適底物，也叫酶的天然底物。d已知Km，可以求出V/Vmax與底物濃度[S]的關(guān)系。

測定Km的意義：（以上4點）第31頁,共54頁，2024年2月25日，星期天UnderstandingKmKmisaconstantderivedfromrateconstantsKmis,undertrueMichaelis-Mentenconditions,anestimateofthedissociationconstantofEfromS,because atequilibrium,Reversiblereaction,dissociationconstantisSosmallKmmeanstightsubstratebinding;highKmmeansweaksubstratebinding.Kmequalstothesubstrateconcentrationatwhichv=1/2vmaxk1k-1第32頁,共54頁，2024年2月25日，星期天UnderstandingVmaxThetheoreticalmaximalvelocity

VmaxisaconstantVmaxisthetheoreticalmaximalrateofthereaction-butitisNEVERachievedinrealityToreachVmaxwouldrequirethatALLenzymemoleculesaretightlyboundwithsubstrateVmaxisassymptoticallyapproachedassubstrateisincreased第33頁,共54頁，2024年2月25日，星期天米氏常數(shù)的測定雙倒數(shù)作圖法，即Lineweaver-Burk法。

1/V對1/S作圖第34頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)雙底物酶促反應(yīng)動力學(xué)雙底物雙產(chǎn)物反應(yīng)A+B P+Q

雙底物雙產(chǎn)物的反應(yīng)按動力學(xué)機制可分為兩大類:

雙底物雙產(chǎn)物的反應(yīng)序列反應(yīng)（sequentialreactions）

乒乓反應(yīng)（pingpongreactions）

有序反應(yīng)（orderdreactions）隨機反應(yīng)（randomreactions）第35頁,共54頁，2024年2月25日，星期天序列有序反應(yīng)；序列隨機反應(yīng)；乒乓反應(yīng)；EAEAEBQEPQEEABPQA+EAEB+EEBAEBQEPQEEPQ+EE+PEAEPEEEBEQABPQE第36頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1．序列有序反應(yīng)

第37頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2．序列隨機反應(yīng)

第38頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3．乒乓反應(yīng)第39頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)酶反應(yīng)影響因素溫度的影響酶的最適溫度（optimumtemperature）

溫度影響的兩個方面

:1.溫度升高，酶反應(yīng)速度增加在達到最適溫度之前提高溫度，可以增加酶促反應(yīng)的速度。第40頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.溫度升高，酶蛋白變性而失活。在最適溫度以前，第1種影響為主。在最適溫度以后，第2種影響為主。大部分酶在600C以上變性，到700C－800C酶達到不可逆變性；少數(shù)酶能耐受較高的溫度，如細菌淀粉酶在950C下活力最高，又如牛胰核糖核酸酶加熱到1000C仍不失活。第41頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共54頁，2024年2月25日，星期天pH的影響

非特征性常數(shù)，只在一定情況下才有意義。

1、

最適pH

當酶反應(yīng)速度受pH影響，當某個pH，酶表現(xiàn)最大活力，此pH就是pH（opt）。

pH（opt）不是酶的特征性常數(shù)，受測定環(huán)境的影響很大。

2、pH影響的原因（1）

影響酶的構(gòu)象（過酸過堿引起酶構(gòu)象的變化，使酶失活）（2）

影響酶與底物的解離第43頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1．酶反應(yīng)的最適pH（optimum）第44頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.5激活劑對酶作用的影響類別金屬離子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+

陰離子：

Cl-、Br-

有機分子還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金屬螯合劑：EDTA

大分子物質(zhì):具活性的蛋白質(zhì)等,例如激活酶原的物質(zhì)定義:凡是能提高酶活性的物質(zhì)，稱為酶的激活劑(activator）第46頁,共54頁，2024年2月25日，星期天非競爭性抑制作用的特性反競爭性抑制作用的特性競爭性抑制作用的特性

2.6

抑制劑對酶作用的影響第47頁,共54頁，2024年2月25日，星期天可逆抑制的動力學(xué)比較抑制類型VmaxKm無抑制劑VmaxKm競爭性抑制作用不變變大非競爭性抑制作用變小不變反競爭性抑制作用變小變小第48頁,共54頁，2024年2月25日，星期天思考題1、影響酶促反應(yīng)的因素有哪些？它們是如何影響的？2、試比較酶的競爭性抑制作用與非競爭性抑制作用的異同。3、什么是米氏方程，米氏常數(shù)Km的意義是什么？試求酶反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度的99％時，所需求的底物濃度（用Km表示）4、舉例說明酶的結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系。名詞解釋活性中心全酶酶原米氏方程Km誘導(dǎo)契合變構(gòu)效應(yīng)輔酶和輔基第49頁,共54頁，2024年2月25日，星期天、計算：（1）對于一個遵循米氏動力學(xué)的酶而言，當[S]=Km時，若ν=35umol/min，

Vmax是多少umol/min？（2）當[S]=2×10-5mol/L，ν=40umol/min，這個酶的Km是多少？（3）大致繪出此酶ν-[S]關(guān)系的曲線圖形。

A、沒有抑制劑存在時

B、有競爭性抑制劑存在時

C、有非競爭性抑制劑存在時四、在不同底物濃度的反應(yīng)體系中，分別測有無抑制劑存在時的ν數(shù)據(jù)如下：

[S]ν（無I）ν（有I）（2.2×10-5mol/L）

mol/L（×10-4）（umol/min）（umol/min）

1.028171.536232.043295.0