關(guān)于細(xì)菌染色和涂片觀察的方法第一節(jié)

不染色標(biāo)本檢查法所謂不染色標(biāo)本檢查法是將細(xì)菌標(biāo)本不經(jīng)染色直接鏡檢，從而觀察生活狀態(tài)下細(xì)菌的形態(tài)及運(yùn)動(dòng)狀況的一種檢查方法。這種檢查方法雖可看到細(xì)菌的大致輪廓，但主要用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。第2頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、不染色標(biāo)本檢查法的具體方法1、壓滴法2、懸滴法3、毛細(xì)管法第3頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

染色標(biāo)本檢查法所謂染色標(biāo)本檢查法是用特殊的手段對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，而后再檢查其形態(tài)、大小、排列方式、染色反應(yīng)以及特殊結(jié)構(gòu)的一種檢查方法,有助于細(xì)菌的初步識(shí)別或診斷。第4頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天

細(xì)菌染色的一般程序細(xì)菌染色的基本程序是：涂片→固定→（媒染）→染色→（脫色）→（復(fù)染）第5頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、涂片制備：

隨標(biāo)本的種類(lèi)而略有不同。一般臨床標(biāo)本大多可直接涂抹于潔凈載玻片上；培養(yǎng)的細(xì)菌，若為液體培養(yǎng)液，亦可直接涂于載玻片上；若為固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌，則先取一接種環(huán)生理鹽水于載玻片中央，然后從培養(yǎng)基上取菌少許，在鹽水中研磨均勻，使呈輕度乳濁，以接種環(huán)擴(kuò)成1cm2或2份硬幣大小的涂面，在室溫下自然干燥或放在火焰上方的熱空氣中慢慢烘干。但切忌緊靠火焰烤干。第6頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、固定：染色前必須先行固定。其目的在于凝固細(xì)胞質(zhì)和其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分而殺死細(xì)菌；使菌體粘附于玻片上以及改變細(xì)菌對(duì)染料的通透性（因活菌通常不易使染料透入細(xì)胞內(nèi)）。固定的方法一般采用火焰加熱法，在特殊目的時(shí)也可用冷凍干燥法或化學(xué)法如醇、酸、氯化高汞、重金屬鹽或氧化劑等進(jìn)行固定。第7頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、媒染：媒染的目的是增加染料和被染物的親和力。凡使染料固定于被染物；或引起細(xì)胞膜通透性改變的物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為媒染劑。常用的媒染劑有明礬、苦味酸、金屬鹽、碘等。也可用加熱法媒染。媒染劑可用于固定之后，亦可含于固定液或染液中，也可在初染之后復(fù)染之前進(jìn)行。第8頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、染色：隨目的而選用適宜的染液。染色時(shí)，滴加染液以覆蓋涂面為度，染色時(shí)間隨方法而定。單染法只用一種染料如呂氏美蘭、稀釋石炭酸復(fù)紅等；而多數(shù)染色法需用第二種染液進(jìn)行復(fù)染。第9頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、脫色：脫色：是使被染物脫去已染上的顏色。脫色的目的是觀察細(xì)菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度，故可作為鑒別染色之用。凡具有脫色作用的化學(xué)試劑稱(chēng)脫色劑。脫色劑或呈溶媒作用，如醇類(lèi)、丙酮等；或能影響蛋白質(zhì)的電離程度，改變其電荷性質(zhì)或數(shù)量，因而影響細(xì)菌與染料的結(jié)合程度，如酸類(lèi)能減少細(xì)菌的負(fù)電荷，故可作堿性染料的脫色劑。第10頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天6、復(fù)染：已經(jīng)脫色處理的細(xì)胞或其結(jié)構(gòu)常以復(fù)染液作復(fù)染以便于觀察。復(fù)染液與初染液的顏色不同而成鮮明對(duì)比，所以復(fù)染也稱(chēng)為對(duì)比染色。復(fù)染液不宜太強(qiáng)，以免掩蓋初染的顏色而失去對(duì)比作用。第11頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用染色法細(xì)菌的常用染色法有：?jiǎn)稳旧ā?fù)染色法、特殊結(jié)構(gòu)染色法、負(fù)染色法以及熒光染色法等。第12頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）、單染色法：

單染色法是指用一種染料進(jìn)行染色的方法。如用美蘭或稀釋石炭酸復(fù)紅等，使各種細(xì)菌均染成同一種單一的顏色。故此法只能顯示細(xì)菌的形態(tài)及大小，對(duì)細(xì)菌的鑒別價(jià)值不大。第13頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）、復(fù)染色法：

復(fù)染色法是用二種以上染料進(jìn)行染色的方法。此法除顯示細(xì)菌的形態(tài)、大小外，還有鑒別細(xì)菌種類(lèi)的價(jià)值，因此也稱(chēng)鑒別染色法。常用的鑒別染色法有革蘭氏染色法及抗酸染色法。第14頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、革蘭氏染色法（Gram’sStain）是最常用的鑒別染色法之一。此染色法是由丹麥細(xì)菌學(xué)家ChristianGram氏于1882～1884年發(fā)明的，至今已逾百年，仍在廣泛使用，是細(xì)菌學(xué)中最為經(jīng)典的染色方法。第15頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）、革蘭氏染色的方法：第16頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定—→初染—→媒染—→脫色

（結(jié)晶紫或龍膽紫）（盧戈氏碘液）（95%酒精）—→復(fù)染

（稀釋復(fù)紅）第17頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天

固定初染媒染脫色復(fù)染

革蘭氏陽(yáng)性菌，用符號(hào)“G+”或“GP”

（Gram’sPositive）表示。

革蘭氏陰性菌，用符號(hào)“Gˉ”或“GN”（Gram’sNegative）表示。

第18頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天第19頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌例子(金黃色葡萄球菌x1000)第20頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌例子第21頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭氏陰性桿菌例子(大腸桿菌x1000)第22頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭氏陰性弧菌例子第23頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢桿菌例子第24頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭氏陽(yáng)性短桿菌例子(李斯特菌x1000)第25頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭氏陰性彎曲菌例子第26頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭氏陽(yáng)性棒狀桿菌例子第27頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭氏染色的結(jié)果與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、操作技術(shù)及菌齡等有密切的關(guān)系。培養(yǎng)基成分：在缺乏鎂鹽的培養(yǎng)基中，革蘭氏陽(yáng)性菌可變?yōu)楦锾m氏陰性菌。培養(yǎng)條件：在酸性環(huán)境中細(xì)菌帶正電荷。操作技術(shù)：如涂片太厚影響酒精脫色，革蘭氏陰性菌則可染成革蘭氏陽(yáng)性菌；脫色時(shí)倘酒精作用時(shí)間太長(zhǎng)，革蘭氏陽(yáng)性菌又會(huì)染成革蘭氏陰性菌。菌齡：菌齡也能影響染色的結(jié)果，這和細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中核酸含量的改變有關(guān)。例如本是革蘭氏陽(yáng)性的老齡菌，因核酸減少則常有許多菌細(xì)胞變?yōu)楦锾m氏陰性。第28頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖含量較多，脂類(lèi)較少，與95%酒精接觸后可迅速導(dǎo)致細(xì)胞壁脫水，通透性降低，使在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)著色的染料——結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物不易透出，所以保留了紫色。而革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁含肽聚糖較少、脂類(lèi)較多，與95%酒精接觸后肽聚糖脫水不明顯，而脂類(lèi)被酒精溶解后使細(xì)胞壁通透性增加，酒精易透入菌體內(nèi)溶解染料——碘復(fù)合物并使其透出，因而使紫色被洗脫后又被染成紅色。第29頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天3）、革蘭氏染色法的臨床意義①、鑒別細(xì)菌：該染色法可將細(xì)菌分為GP菌與GN菌兩大類(lèi)，這樣可以初步識(shí)別細(xì)菌、縮小范圍，便于進(jìn)一步鑒定。②、了解細(xì)菌與致病性的關(guān)系：大多數(shù)GP菌的致病物質(zhì)主要為外毒素；而大多數(shù)GN菌的致病物質(zhì)主要為內(nèi)毒素。通過(guò)革蘭氏染色，可了解細(xì)菌的致病物質(zhì)，從而做出相應(yīng)的治療對(duì)策。第30頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天③、選擇抗菌藥物：GP菌和GN菌在細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)上有很大差別，因而對(duì)抗菌藥物的敏感性不同。如大多數(shù)GP菌對(duì)青霉素、紅霉素、頭孢菌素等敏感；而大多數(shù)GN菌對(duì)這幾種抗生素不敏感，但對(duì)鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素等敏感，故臨床上可根據(jù)病原菌的革蘭氏染色性，選擇有效的藥物進(jìn)行治療。第31頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、

抗酸染色法有些細(xì)菌如結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌等分枝桿菌，用一般染色法不易著色，必須使用強(qiáng)染色劑（如石炭酸復(fù)紅）并采用加熱和延長(zhǎng)染色時(shí)間的方法才能使其著色。且一旦染上顏色后又不易被酸性酒精脫色。這種能夠抵抗酸性酒精脫色的細(xì)菌，稱(chēng)為抗酸桿菌。應(yīng)用這種原理進(jìn)行染色的方法叫抗酸染色法?？顾崛旧ǔＳ玫挠休隆{二氏染色法和潘本漢氏染色法。第32頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天①染色的步驟：

直接涂片法第33頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天夾層杯液基集菌法：第34頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定——→初染——→脫色——→復(fù)染石炭酸復(fù)紅加熱3%鹽酸酒精呂氏美蘭第35頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天染色過(guò)程中的細(xì)菌顏色變化：抗酸桿菌非抗酸桿菌第36頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天第37頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天鏡檢與報(bào)告：

用光學(xué)顯微鏡鏡檢(目鏡10×，油鏡100×)染色痰片。在淡藍(lán)色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。所見(jiàn)結(jié)果按下列標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告：1)抗酸桿菌陰性：連續(xù)觀察300個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。

2)抗酸桿菌(1+)：1～9條抗酸桿菌／100視野。

3)抗酸桿菌(2+)：l一9條抗酸桿菌／10視野。

4)抗酸桿菌(3+)：1～9條抗酸桿菌／每個(gè)視野。

5)抗酸桿菌(4+)：≥10條抗酸桿菌／每個(gè)視野。第38頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天③

抗酸染色的意義：用以鑒別抗酸菌（如結(jié)核桿菌和麻風(fēng)桿菌）和非抗酸菌。第39頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）、特殊結(jié)構(gòu)染色法細(xì)菌的某些基本結(jié)構(gòu)如細(xì)胞壁、核質(zhì)、胞漿顆粒和特殊結(jié)構(gòu)如莢膜、芽孢、鞭毛等，用普通染色法不易著色，須用一些特殊染色法才能染上顏色。特殊染色法主要有莢膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、異染顆粒染色法等。這些染色法不僅能使特殊結(jié)構(gòu)著色，還可使特殊結(jié)構(gòu)染成與菌體不同的顏色，有利于觀察和區(qū)別。第40頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天第41頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天第42頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天在細(xì)菌檢驗(yàn)工作中，除異染顆粒染色法較常用外，由于其它特殊結(jié)構(gòu)染色法操作費(fèi)時(shí)，費(fèi)用較高、染色過(guò)程要求非常嚴(yán)格，而普通染色法雖不能使特殊結(jié)構(gòu)本身著色，但菌體著色后，莢膜和芽孢部分由于不著色也能顯示出來(lái)，再加上特殊染色法比較復(fù)雜，故日常工作中較少使用這些特殊結(jié)構(gòu)染色法第43頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天第44頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天第45頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）、負(fù)染色法

所謂負(fù)染色法是指使背景著色而細(xì)菌本身不著色的一種染色方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如剛果紅或水溶性苯胺黑等進(jìn)行染色。因酸性染料帶負(fù)電荷，而細(xì)菌本身在近乎中性的環(huán)境中也帶負(fù)電荷，同種電荷相排斥，故染色時(shí)菌體不著色，而只能使背景著色