關于熒光定量原理擴增曲線內容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產品選擇指南第2頁,共55頁，2024年2月25日，星期天實時定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析與常規(guī)PCR技術比較：對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析，無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測熒光定量PCR原理－－定義第3頁,共55頁，2024年2月25日，星期天

擴增曲線熒光閾值

Ct值熒光定量PCR原理－－常用名詞概念第4頁,共55頁，2024年2月25日，星期天Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase熒光基團熒光檢測元件熒光定量PCR原理－－擴增曲線第5頁,共55頁，2024年2月25日，星期天Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）熒光域值的缺省設置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍手動設置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進入指數(shù)期的最初階段真正的信號:熒光信號超過域值Threshold熒光定量PCR原理－－熒光域值第6頁,共55頁，2024年2月25日，星期天Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值第7頁,共55頁，2024年2月25日，星期天CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關系第8頁,共55頁，2024年2月25日，星期天線性關系、擴增效率確認檢測靈敏度確認Notemplatecontrol確認PCR擴增效率（E）:0.8-1.235Cycles內可得到好的定量結果如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內無非特異性產物擴增35Cycles內無引物二聚體產生相關系數(shù)（r2）：大于0.98熒光定量PCR反應性的確認第9頁,共55頁，2024年2月25日，星期天

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等

絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測等

相對定量研究：mRNA表達量分析，siRNA效果確認，基因芯片結果驗證，差異顯示結果驗證等熒光定量PCR技術的應用第10頁,共55頁，2024年2月25日，星期天內容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量產品選擇指南第11頁,共55頁，2024年2月25日，星期天非特異性熒光標記

SYBRGreenI特異性熒光標記

TaqManProbe常用熒光標記方法第12頁,共55頁，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI第13頁,共55頁，2024年2月25日，星期天熱變性引物退火延伸反應SYBRGreenI染料法——作用機理第14頁,共55頁，2024年2月25日，星期天問題點：

SYBRGreenI與雙鏈DNA進行結合后散發(fā)熒光，因此如果反應體系中有非特異性擴增或引物二聚體的產生，也將同時被檢測，從而可能導致檢測結果不準確。SYBRGreenI染料法——問題點與關鍵點關鍵點：

設計合適引物，防止非特異性擴增！第15頁,共55頁，2024年2月25日，星期天將溫度與熒光強度的變化求導(-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜SYBRGreenI染料法——融解曲線第16頁,共55頁，2024年2月25日，星期天融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確SYBRGreenI染料法——融解曲線第17頁,共55頁，2024年2月25日，星期天

對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA

使用方便，不必設計復雜探針具有價格優(yōu)勢優(yōu)點

容易與非特異性雙鏈DNA結合，產生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應條件對引物特異性要求較高不能進行多重定量缺點SYBRGreenI染料法——優(yōu)缺點第18頁,共55頁，2024年2月25日，星期天Taqman探針法——原理

5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針第19頁,共55頁，2024年2月25日，星期天Taqman探針法——工作機理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應探針報告基團淬滅基團探針DNA聚合酶引物RRRR第20頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1、引物、探針的設計：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM

探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針法——PCR體系的建立第21頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3’淬滅基團淬滅基團性質建議使用的5’報告基團TAMRA熒光物質FAM,HEX,TET,JOE等Eclipse非熒光物質FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX等Taqman探針法——熒光標記物的選擇第22頁,共55頁，2024年2月25日，星期天

高度特異性重復性好可進行多重定量優(yōu)點

只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高不易找到本底低的探針缺點Taqman探針法——優(yōu)缺點第23頁,共55頁，2024年2月25日，星期天不同定量方法的比較方法優(yōu)點缺點適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶不能進行多重定量適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉基因重組動植物的研究TaqMan方法特異性高重復性好多重定量價格高只適合特定目標病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷第24頁,共55頁，2024年2月25日，星期天內容概要

熒光定量PCR原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量產品選擇指南第25頁,共55頁，2024年2月25日，星期天絕對定量解析方法第26頁,共55頁，2024年2月25日，星期天Sample25絕對定量的定義

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,即得到該擴增反應存在的線性關系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量第27頁,共55頁，2024年2月25日，星期天質粒標準品的制備PCR目的基因克隆質粒提取，OD值定量，將質粒梯度稀釋作為標準品使用目的基因目的基因目的基因質粒目的基因基因組DNA第28頁,共55頁，2024年2月25日，星期天拷貝數(shù)的計算：待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標準品i)+9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v質粒標準品稀釋方法與拷貝數(shù)計算第29頁,共55頁，2024年2月25日，星期天

方法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測

試劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMix（Probe）（目錄號：FP203）

標準品：質粒標準品濃度為106、105

、104

、103

；2個重復；設陰性空白對照

實驗步驟：提取HBVDNA；設計特異引物；設計TaqMan探針并標記探針；熒光定量擴增；結果分析：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)。絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量第30頁,共55頁，2024年2月25日，星期天Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD標準品5×10328.1828.6428.410.16標準品5×10425.2525.1425.190.04標準品5×10522.1122.4622.280.12標準品5×10618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實驗數(shù)據(jù)絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量第31頁,共55頁，2024年2月25日，星期天擴增效率（E）計算

E=10-1/斜率－1=10-1/-3.17－1

=2.03－1

＝1.03標準曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標準曲線y=-3.17x+37.52R2=0.9988絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量

相關系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結果可信度越高。擴增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。第32頁,共55頁，2024年2月25日，星期天未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.1726X+37.52QuantityUnknown=105.36

=229087copies絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量X=20.5-37.52-3.1726=5.36第33頁,共55頁，2024年2月25日，星期天相對定量解析方法第34頁,共55頁，2024年2月25日，星期天理論上目的基因表達量分析條件SampleBSampleA目的基因擴增效率相同RNA提取效率相同細胞起始數(shù)相同實際目的基因表達量分析相對定量的必要性第35頁,共55頁，2024年2月25日，星期天以上條件不可能同時得到滿足，必須用內對照基因（管家基因）進行校正，進行相對表達量分析。第36頁,共55頁，2024年2月25日，星期天管家基因

維持細胞基本代謝活動所必須的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法

根據(jù)文獻提供通過具體實驗篩選相對定量分析——管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

第37頁,共55頁，2024年2月25日，星期天

雙標準曲線法

2-△△Ct法

相對定量分析——兩種常用的分析方法第38頁,共55頁，2024年2月25日，星期天

通過標準曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達量。

相對值=校正值=目的基因定量結果管家基因定量結果待測樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析——雙標準曲線法公式：第39頁,共55頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標準曲線應用：基因表達調控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一相對定量分析——雙標準曲線法檢測樣品管家基因H目的基因X定量結果定量結果校正值相對量對照樣品6391.5343.40.05371.000待測樣品18589.717.30.00200.037待測樣品27432.91946.10.26184.874實驗數(shù)據(jù)第40頁,共55頁，2024年2月25日，星期天公式：F=2－相對定量分析——2法優(yōu)點：無需作標準曲線缺點：假定擴增效率為100%；假定標準曲線及每次擴增之際間的效率都保持一致；實驗條件優(yōu)化較為復雜應用：基因表達調控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一

待測組目的基因平均Ct值待測組管家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組管家基因平均Ct值－－－－△△Ct第41頁,共55頁，2024年2月25日，星期天實驗數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-

△△Ct法：假設目的基因和參照基因擴增效率都接近100%△Ct（處理前）＝18－17＝1△Ct（處理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（處理后/處理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）=5.3所以Jun基因在處理后表達水平比處理前高5.3倍修正方法：如果我們知道目標基因和參照基因有相同的擴增效率，但擴增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴增效率為1.95，那么計算公式可修正為1.95－△△Ct相對定量分析——2-△△Ct法第42頁,共55頁，2024年2月25日，星期天內容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量相關產品第43頁,共55頁，2024年2月25日，星期天SYBR法實驗流程及注意事項樣品制備模板準備引物設計反應條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機反應體系優(yōu)化試劑選擇分析方法第44頁,共55頁，2024年2月25日，星期天樣品制備環(huán)境要求模板準備數(shù)據(jù)分析RT上機濃度確定SYBR法實驗流程及注意事項無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具高純度，濃度均一的RNA分光光度計檢測電泳檢測第45頁,共55頁，2024年2月25日，星期天RT反應體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備模板準備數(shù)據(jù)分析上機AMVM-MLVQuantSuper下游反應數(shù)確定反轉錄體積選擇應用引物高效、全長的cDNASYBR法實驗流程及注意事項第46頁,共55頁，2024年2月25日，星期天模板準備引物設計濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機核酸制備區(qū)反應液制備區(qū)制作標準曲線設定濃度區(qū)間評價引物使用mix降低系統(tǒng)誤差設置重復（≥3次）設置空白和陰性對照均一的反應液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個堿基重復＜4個無二級結構擴增長度：100－200bp第47頁,共55頁，2024年2月25日，星期天反應體系優(yōu)化上機反應條件優(yōu)化RT樣品制備模板準備數(shù)據(jù)分析反應體積＞5ul，推薦20－50ulMg2＋調節(jié)，酶活調節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時間：產物長度決定擴增效率：90％－110％重復性：std＜0.2標準曲線：R＞0.99或R2

＞0.98SYBR法實驗流程及注意事項標準品待測樣本陽性對照陰性對照第48頁,共55頁，2024年2月25日，星期天技能要求誤差控制儀器介紹上機試劑選擇RT樣品制備模板準備數(shù)據(jù)分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseri