單克隆抗體和基因工程抗體的制備單克隆抗體和基因工程抗體的制備單克隆抗體和基因工程抗體的制備大多數抗原分子具有多個抗原決定簇（表位，）。一個抗原決定簇刺激一個細胞克隆產生一種特異性抗體，一種抗原刺激機體產生多種抗體稱為多克隆抗體（）如免疫血清。由一個只識別一種抗原表位的細胞克隆產生的同源抗體稱為單克隆抗體()。概述書籍能培養(yǎng)我們的道德情操，給我們巨大的精神力量，鼓舞我們前進單克隆抗體和基因工程抗體的制備單克隆抗體和基因工程抗體的制備1大多數抗原分子具有多個抗原決定簇（表位，）。一個抗原決定簇刺激一個細胞克隆產生一種特異性抗體，一種抗原刺激機體產生多種抗體稱為多克隆抗體（）如免疫血清。由一個只識別一種抗原表位的細胞克隆產生的同源抗體稱為單克隆抗體()。概述大多數抗原分子具有多個抗原決定簇（表位，）。單克隆抗體理化性狀高度均一，其抗原結合部位完全相同，生物活性專一，特異性強，純度高，效價高，易于實驗標準化與大量制備，是研究抗體的一重大突破。應用比較廣，如試劑診斷盒、治療腫瘤、器官移植與自身免疫病等。單克隆抗體理化性狀高度均一，其抗原結合部位完第一節(jié)雜交瘤技術的基本原理基本原理是融合的兩種細胞保持自身的特性，產生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細胞稱為雜交細胞。包括細胞、細胞，前者產生，后者產生。第一節(jié)雜交瘤技術的基本原理基本原一、淋巴細胞雜交瘤技術細胞是經抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。細胞能產生抗體，但不能在體外長期生長，而骨髓瘤細胞不產生抗體但在體外能長期生長，二者融合，各保持其本性，既產生抗體又長期生長。其原理分為幾個步驟一、淋巴細胞雜交瘤技術目的是制備抗原特異的，所以融合的細胞必須經抗原免疫的細胞，通常取脾，另一是在體外長期生長又不產生抗體，所以選腫瘤細胞即多發(fā)性骨髓瘤細胞，具備以下特點：

（一）細胞的選擇與融合目的是制備抗原特異的，所以融合的細胞必須經.穩(wěn)定、易培養(yǎng).自身不分泌或.融合率高.是缺陷株

.穩(wěn)定、易培養(yǎng)目前常用的小鼠細胞瘤株有（）、等。為敏感株，易培養(yǎng),融合率高，最常選用聚乙二醇()使細胞膜輕度損傷，細胞容易融合。目前常用的小鼠細胞瘤株有（）、等。（二）選擇培養(yǎng)基的應用細胞融合是一個隨機的物理過程。融合后可能出現以下情況:）脾細胞與瘤細胞）瘤細胞與瘤細胞）脾細胞與脾細胞）未融合的脾細胞）未融合的瘤細胞）多聚體形式。）、）、）在體外易死去，不需篩選。（二）選擇培養(yǎng)基的應用細胞融合單克隆抗體和基因工程抗體的制備細胞的合成一般有兩條途徑一是糖和氨基酸與其他小分子化合物合成核苷酸，進一步合成，葉酸是重要輔酶。一是輔助途徑，是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶存在下，經次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶（）和胸腺嘧啶核苷激酶（）的催化作用合成。細胞的合成一般有兩條途徑一氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，當氨基蝶呤存在時，能阻斷第一條途徑。細胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關鍵成分，次黃嘌呤()、氨基蝶呤()、胸腺嘧啶核苷()，三者取前綴縮寫為培養(yǎng)基，其融合細胞所用的瘤細胞是經毒性培養(yǎng)基選擇出來的陰性細胞株。氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，當氨基蝶呤存在時，能阻斷第所以，前面提到的）瘤細胞與瘤細胞與)未融合的瘤細胞不能生長，只有）脾細胞與瘤細胞才能生長，因為脾細胞為陽性，通過補償途徑代替氨基蝶呤阻斷的主要途徑。所以，前面提到的）瘤細胞與瘤細胞與（三）有限稀釋與抗原特異性選擇在免疫動物時，一種抗原往往有多個表位，一個細胞克隆接受一個表位，故在免疫動物時是眾多細胞克隆的抗體的分泌，而針對目的抗原的細胞只占很少部分，在細胞融合后，有相當一部分是無關的細胞融合體，即融合細胞分泌的不是目的抗體，要進行篩選，分二步稀釋。（三）有限稀釋與抗原特異性選擇在計數，每個孔只放一個細胞，實際是至數個，整個過程為克隆化，將陽性細胞株重復一次，盡量使抗體更純，將陽性細胞進行增殖，部分凍存，部分進行體外培養(yǎng)或動物接種。計數，每個孔只放一個細胞，實際是至數個另外還有其他雜交瘤技術，如人人淋巴細胞雜交瘤和鼠人淋巴細胞雜交瘤，人骨髓瘤細胞系體外建株比較困難，生長不穩(wěn)定，有的分泌，有的分泌的γ、κ鏈。細胞取外周血淋巴細胞、脾細胞、淋巴結細胞、病灶浸潤性淋巴細胞。從理論上講很好，但實際比較困難，在于缺乏好的親體骨髓瘤細胞株，較難獲得抗原特異性淋巴細胞；人雜交瘤細胞不能在小鼠或其他動物體內生長。

另外還有其他雜交瘤技術，如人人淋巴細胞小鼠骨髓瘤與人的細胞雜交瘤，該技術優(yōu)點是易獲得小鼠骨髓瘤細胞，融合率較高，但最大的缺點是不同種雜交后不穩(wěn)定，雜交瘤傳代后，很快喪失分泌抗體的染色體。小鼠骨髓瘤與人的細胞雜交瘤，該技術優(yōu)點是易獲二、細胞雜交瘤自細胞雜交瘤技術后，淋巴細胞雜交瘤成為熱門，為獲得淋巴因子，更深入地研究細胞的各種功能，雖然有一些小鼠細胞雜交瘤成功的報道，但結果不滿意，該細胞很不穩(wěn)定，分泌淋巴因子無特異性，一種細胞雜交瘤可同時分泌幾種淋巴因子，到目前仍無突破性進展。二、細胞雜交瘤自細胞雜交瘤技術后，淋淋巴細胞雜交瘤分為小鼠與人，由于細胞功能的多樣化，制備出的細胞雜交瘤也各有其特性，如分泌淋巴因子，特異性殺傷功能，分泌抑制因子，自身反應性等。其基本過程是將激活的細胞與酶缺陷型淋巴細胞瘤細胞融合，可表達特異性或其他功能的雜交瘤細胞，與細胞相以，但細胞激活和陽性克隆篩選較為雜交，不穩(wěn)定，簡介主要步驟。淋巴細胞雜交瘤分為小鼠與人，由于細胞功能的多.淋巴瘤細胞系的選擇）體外無限制快速生長）融合率高）不分泌淋巴因子和殺傷功能）缺乏某一特異性表面抗原或受體）酶缺陷型.淋巴瘤細胞系的選擇.特異性細胞的制備與純化主要有可溶性抗原誘導激活的細胞、同種反應性細胞、人的特異性細胞。.特異性細胞的制備與純化主要有可溶性抗原誘導細胞雜交瘤的篩選通常在含有選擇培養(yǎng)基上，用特異性抗體篩選產生淋巴因子的雜交瘤細胞，用抗抗體篩選陽性細胞。細胞雜交瘤的篩選三、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)雜交瘤細胞形成的初期很不穩(wěn)定，鼠的二倍體細胞有對染色體，雜交后對，易丟失，丟失后仍生長，要檢測上清液中是否有目的抗體與淋巴因子。三、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)將陽性細胞進行單細胞培養(yǎng)，反復～次，確保為一單細胞陽性雜交瘤細胞應與時凍存，以防止細胞染色體丟失，發(fā)生變異或污染，凍存于液氮（℃）,凍存時加小牛血清至,加幾滴二甲亞砜。雜交瘤細胞培養(yǎng)可用液體、半固體、接種動物腹腔。將陽性細胞進行單細胞培養(yǎng)，反復～次，確保為第二節(jié)單克隆抗體的制備技術單一、特異、純化，利用雜交瘤技術制備的基本原理是三個原則：）一種單克隆產生一種抗體）雜交瘤細胞保持雙親細胞特性）篩選培養(yǎng)基第二節(jié)單克隆抗體的制備技術一、單克隆抗體的產生.動物體內生長雜交瘤細胞注射同系小鼠腹腔，先注射石蠟或不完全佐劑，使腹腔滲出液增多，～周后無菌方法抽取腹水，離心取上清。

一、單克隆抗體的產生.體外培養(yǎng)較常做，用普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，根據培養(yǎng)時間、細胞生長情況收取上清液。另有高密度培養(yǎng)，在單位體積內增加細胞的培養(yǎng)數量。.體外培養(yǎng)二、單克隆抗體的純化腹水或細胞上清液，均含有脂蛋白、脂質與細胞碎片等雜質，用濾紙去掉脂質和大顆粒，離心去除細胞碎片和蛋白聚合物。二、單克隆抗體的純化目前純化方法有十幾種，一般采用鹽析、凝膠過濾、離子交換層析和辛酸提取等，現在最有效的方法是親和純化法，常用或抗小鼠免疫球蛋白抗體與載體交聯。稱為柱，抗體結合上去，然后洗脫。目前純化方法有十幾種，一般采用鹽析、凝膠過濾三、單克隆抗體的性質鑒定鑒定的方法很多，用已知抗原測定抗體，幾乎所有的抗原抗體反應試驗都可以作，如陽性，再定量，確定工作濃度。三、單克隆抗體的性質鑒定第三節(jié)基因工程抗體技術雜交瘤單克隆抗體在診斷、治療、預防和蛋白質提純應用中非常廣泛，但對人是異源性，人抗小鼠抗體，應用基因工程技術減少小鼠源成分，保留原有的抗體特異性。第三節(jié)基因工程抗體技術雜交瘤單克隆抗一、人源化抗體人源化抗體主要指鼠源性單克隆抗體的基因克隆與重組技術改造，重新表達的抗體。其大部分氨基酸序列為人源序列所取代，既基本保留親代鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了鼠異源性。一、人源化抗體人源化抗體主要（一）人鼠嵌合抗體通過基因工程技術將人區(qū)與鼠區(qū)連接，導入細胞內表達制備的抗體稱為嵌合抗體，因的抗原性在區(qū)，來自人，故抗原性降低，且半衰期明顯延長，在介導與亦明顯增強。（一）人鼠嵌合抗體.鼠單克隆抗體可變區(qū)基因克隆用探針從該雜交瘤細胞的基因組文庫中調取。用方法從該細胞的中擴增與基因。.鼠單克隆抗體可變區(qū)基因克隆.表達載體的構建人鼠嵌合抗體的表達載體基因依可變區(qū)基因克隆的表達方式不同而分為兩類，從基因文庫所克隆的可變區(qū)基因帶有上游的轉錄調控組件與內含子剪接信號，因此載體只需要包括細胞內增殖所必須的抗生素抗性基因和質粒復制的起始序列以與在真核細胞進行選擇的顯性標記基因。

.表達載體的構建將載體導入真核細胞稱為轉染。導入的整合至細胞基因組中得到轉染子，要得到穩(wěn)定的轉染子需利用真核細胞的顯性選擇標記基因，這些標記基因使細胞獲得對某些細胞毒物質的抗體，在培養(yǎng)液中加入相應的細胞毒物質可殺死轉染不成功的細胞，達到選擇的目的。將載體導入真核細胞稱為轉.表達用哺乳動物細胞或大腸桿菌表達量較少，而應用二氫葉酸還原酶（）擴增系統(tǒng)使抗體表達增強。是正常核酸代謝必須的酶，缺乏該酶的中華倉鼠卵細胞（））需在有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷條件下利用合成，因此,作的顯性選擇標記基因，在無次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情況下，只有導入基因，細胞才能存活。該糸統(tǒng)可用來擴增導入的目的基因。.表達(二)改形抗體（）應用基因工程技術在嵌合抗體基礎上用人抗體可變區(qū)序列取代鼠源單抗以外的骨架序列，重新構成既有鼠源單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體，該抗體對人無免疫原性。(二)改形抗體（）（三）抗體的表面修飾人和鼠區(qū)來自不同的種屬，輕鏈不同型別，互補性決定區(qū)()的長度可不一致，但暴露于表面的殘基的位置數量都很保守，通過改變表面殘基使其人源化，降低鼠可變區(qū)的異源性，將的表面人源化，消除其免疫原性而不影響的整體空間構象。（三）抗體的表面修飾（四）雙特異性抗體雙特異性抗體（）又稱雙功能抗體。兩個抗原結合部位具有不同的特異性，可以同時與兩種不同特異性抗原發(fā)生結合。（四）雙特異性抗體.化學交聯分別分離純化兩種抗原的單抗，先使解離后，獲得單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體或其片段交聯起來。該方法易致抗體失活，其產物也難以保證均質性。.化學交聯.細胞工程將二種雜交瘤細胞進行融合產生雜交瘤，核酸隨機組合多種多樣。.細胞工程.基因工程用抗體分子片段如或等，經基因操作修飾后，或體外組裝成為，或直接導入受體細胞表達分泌。在免疫檢測、腫瘤放射免疫顯象、藥物剎傷、介導細胞剎傷效應起重要作用。.基因工程二、小分子抗體具有結合抗原功能的分子片段稱為小分子抗體。其優(yōu)點：）可在原核細胞表達，生產成本低;）易于穿透血管或組織到靶細胞部位，有利于疾病的治療；）不含段，副作用小；）半衰期短，有利于毒素中和與清除。

二、小分子抗體具有小分子抗體包括：抗原結合片段（），可變區(qū)片段（）,單鏈抗體（），單區(qū)抗體。另有和。小分子抗體包括：抗原結合片.由一條完整的鏈和約為的鏈組成，是完整抗體的，只有一個結合位點，它是將重鏈區(qū)和區(qū)與完整輕鏈連接，在細胞啟動子的控制下分泌表達。..和單鏈抗體（）由和構成，非共價鍵結合，為完整抗體的，單一抗原結合位點，和連接有三種方法：）用戊二醛處理，使之交聯；）引入半胱氨酸殘基，使和之間形成二硫鍵；）把和用一段適當的寡核苷酸分子連接起來，表達成一個單鏈，稱為。.和單鏈抗體（）.單區(qū)抗體與最小識別單位根據抗體分子的結構，一般將稱為抗體的最小單位，但有些更小亞單位仍結合抗原，如單獨重鏈仍可保留相當程度抗原結合能力，其作用比大，稱為單區(qū)抗體（），其親和力低于完整的，因單區(qū)抗體的疏水區(qū)的暴露，增加了非特異性吸附，水溶性減低，其應用受到限制，但分子量小，單位體積濃度高，副作用小，是很有前景的抗體部分。.單區(qū)抗體與最小識別單位將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到有多樣性生物功能的融合蛋白，有幾種構建方式：）將或與其他生物活性蛋白融合，建成生物導彈。

三、抗體融合蛋白將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到有多樣）在融合時可根據某些恒定區(qū)，可使某些生物活性與抗體的生物學效應功能聯結在一起。）將與某些細胞膜蛋白融合，形成嵌合受體，使細胞結合抗原。）在融合時可根據某些恒定區(qū)，可使某些生物活性與抗（一）含片段的抗體融合蛋白將與某些毒素、酶與細胞因子等的基因連接，能編碼與毒素、酶與細胞因子復合物，即生物導彈，主要在于抗腫瘤。（一）含片段的抗體融合蛋白（二）嵌合受體將與某些細胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表達于細胞表面。其抗體部分與相應抗原特異性結合。如將抗體的可變區(qū)基因與的α鏈和β鏈恒定區(qū)融合，將融合基因導入細胞，既表達特異性抗體，又表達，該不受分子限制。（二）嵌合受體（三）含的抗體融合蛋白如將分子細胞膜外部分與融合后用真核細胞表達，由二硫鍵連接成雙體，分泌到細胞外，產生二種功能：）延長在血循環(huán)中的半衰期；）通過功能蛋白與配體分子的作用，將的生物學效應引導至特定目的，如與融合蛋白，是輔助細胞表面糖蛋白，是的受體，該融合蛋白能競爭結合，可阻斷對的感染，可介導與，可通過胎盤。（三）含的抗體融合蛋白小分子抗體都是單價，不能偶聯。將特異性不同的兩個小分子抗體連接在一起可獲得雙特異性抗體。（），雙價與抗原結合比單價敏感性高，親和力大，結構和功能上都更接近親本抗體。分子片段可從、或組建，可在體內或體外連接。四、雙特異性抗體小分子抗體都是單價，不能偶聯。將特異性不同的在小分子抗體的羧基端設計半胱氨酸殘基，如帶鉸鏈區(qū)的段或帶半胱氨酸殘基尾巴的，可在體外通過化學交聯成為雙價抗體分子，亮氨酸鉸鏈也可用來構建，兩個不同抗體連接成為功能抗體。如抗體和抗的在體外直接介導細胞對表達的細胞有殺傷作用。（一）雙價抗體分子的構建.體外構建在小分子抗體的羧基端設計半胱氨酸殘基，如帶鉸對小分子抗體基因的改造修飾，使細胞直接表達雙抗體分子，比體外組建更有效，現有以下幾種方法:

.雙抗體分子的細胞內組建對小分子抗體基因的改造修飾，使細胞直接表達（）設計促進雙聚體形成的結構域，半胱氨酸是促進雙聚體形成的結構域，使小分子抗體在大腸桿菌的分泌型表達過程中形成雙體，亮氨酸拉鏈和甲基（）亦有螺旋—轉角—螺旋結構，使之成為雙體。（）在基因構建上直接將兩個抗體分子片段融合。（）雙體分子兩個的和相互配對，可產生雙價的雙抗體分子。（）設計促進雙聚體形成的結構域，半胱氨酸是促進雙聚體形能同時結合兩種不同抗原，因而可介導標記物與靶抗原的結合，或某些高級分子定位于靶細胞。在臨床上有以下應用：

（二）雙特異性抗體的應用能同時結合兩種不同抗原，因而可介導標記物與靶.在免疫檢測中的應用一個臂結合靶抗原，另一個臂結合酶，不需用酶標記抗體，避免在標記過程中降低酶與抗體的活性。.在腫瘤放射免疫顯像中的應用一個臂結合腫瘤細胞，另一個臂結合半抗原螯合劑，半抗原螯合劑能選擇與放射性核素結合。放射免疫顯像，清晰度和靈敏度高。.在免疫檢測中的應用一個臂結合靶抗原.雙特異性抗體介導的藥物殺傷效應治療腫瘤生物導彈如藥物、毒素或核素。.介導的細胞殺傷效應一臂結合腫瘤抗原，一臂結合免疫活性細胞起介導作用并激活免疫細胞。.雙特異性抗體介導的藥物殺傷效應抗體庫技術是