常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第21章1ppt課件常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用第21章1ppt課件1第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique2ppt課件第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridiz2精品資料精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結(jié)一節(jié)課的重點的難點，你是否會認為老師的教學(xué)方法需要改進？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學(xué)問無顏見爹娘……”“太陽當(dāng)空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用--ppt課件4核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理5ppt課件核酸分子雜交(nucleicacidhybridiza5復(fù)性RNADNA6ppt課件復(fù)性RNADNA6ppt課件6（一）印跡技術(shù)印跡技術(shù)(blotting)是指將存在于凝膠中的生物大分子

轉(zhuǎn)移(印跡)于固定化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù)。利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。7ppt課件（一）印跡技術(shù)印跡技術(shù)(blotting)是指將存在于凝膠中7用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”（probe)，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。探針種類：DNA（單鏈、雙鏈），RNA探針標(biāo)記：放射性同位素標(biāo)記，生物素、地高辛、熒光素等。（二）探針技術(shù)8ppt課件用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多8二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡

(SouthernBlotting)Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。

1975年,Southern印跡雜交（Southernblot）由英國人EdwinMellorSouthern創(chuàng)建。用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

9ppt課件二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡(Southern9（二）RNA印跡(NorthernBlotting)

利用DNA可以與RNA進行分子雜交來檢測特異性RNA的技術(shù)，首先將RNA混合物按它們的大小和分子量通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，分離出來的RNA轉(zhuǎn)至尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再與放射性標(biāo)記的探針雜交，通過雜交結(jié)果可以對表達量進行定性或定量。

1979年，J.C.Alwine等提出，因其方法同Southern雜交十分相似，故稱之為Northern雜交。

10ppt課件（二）RNA印跡(NorthernBlotting)

10（三）蛋白質(zhì)的印跡(WesternBlotting)即Western免疫印跡，是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測。與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。

11ppt課件（三）蛋白質(zhì)的印跡(WesternBlotting)11其他：斑點印跡(dotblotting)是將被檢標(biāo)本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析。

原位雜交(insituhybridization)將標(biāo)記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交

DNA芯片技術(shù)(DNAchip)實際上就是一種大規(guī)模集成的固相雜交，是指在固相支持物上原位合成(insitusynthesis)寡核苷酸或者直接將大量預(yù)先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交。12ppt課件其他：12ppt課件12

Southern雜交的主要步驟

待測DNA樣品的制備、酶切酶切片段的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性

Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備

Southern雜交雜交結(jié)果的檢測13ppt課件Southern雜交的主要步驟13ppt課13三種印跡技術(shù)的比較14ppt課件三種印跡技術(shù)的比較14ppt課件1415ppt課件15ppt課件15放射自顯影照片16ppt課件放射自顯影照片16ppt課件16第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)PolymeraseChainReaction17ppt課件第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)PolymeraseChainReac17

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美國科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。18ppt課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)KaryB.Mull185

Primer15

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TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理5

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19ppt課件5Primer15Primer2Cycle2Cyc19Cycle35

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。20ppt課件Cycle3555555555520PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

PCR的反應(yīng)體系：

10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul21ppt課件PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件21ppt課件21PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C22ppt課件PCR的基本反應(yīng)步驟變性延伸退火22ppt課件22PCR反應(yīng)循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸23ppt課件PCR反應(yīng)循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸23p23PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y=2n

(n為循環(huán)次數(shù))24ppt課件PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y=2n24ppt課件24PCR擴增有限性-平臺期及平臺效應(yīng)（plateaueffect）PCR擴增的平臺效應(yīng)25ppt課件PCR擴增有限性-平臺期及平臺PCR擴增的平臺效應(yīng)25ppt25PCR技術(shù)的特點1.高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍26ppt課件PCR技術(shù)的特點1.高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個262.高度的特異性引物引物

引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。27ppt課件2.高度的特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異27引物設(shè)計：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴格限制。28ppt課件引物設(shè)計：28ppt課件283.操作簡便易行

利用PCR擴增,只需要數(shù)小時,就可以擴增出可用電泳法檢出的DNA，可用于檢測基因組中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣

29ppt課件3.操作簡便易行利用PCR擴增,只需要數(shù)小時,就可以擴增29

既可是DNA，也可是RNA；既可是純化的，又可是粗制的；既可是新鮮組織，也可是陳舊樣品；既可是細胞(刮片細胞、培養(yǎng)細胞、血細胞），又可是體液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA。4.適用樣品的廣泛性30ppt課件既可是DNA，也可是RNA；既可是純化的，又30利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆31ppt課件利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因31利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突變32ppt課件利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、32將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。（四）DNA序列測定（五）基因突變分析33ppt課件將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了33逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)34ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionP34原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細胞涂片上的單個細胞內(nèi)進行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。原位PCR方法彌補了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)35ppt課件原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細胞涂片上35（三）實時PCR技術(shù)實時PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。36ppt課件（三）實時PCR技術(shù)實時PCR(real-timePCR)36實時PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)記引物RQ3'3'5'5'37ppt課件實時PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)37第三節(jié)核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis38ppt課件第三節(jié)核酸序列分析38ppt課件38核酸序列分析的基本原理：化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(Sanger法)39ppt課件核酸序列分析的基本原理：化學(xué)裂解法(Maxam-Gillb39一、DNA鏈末端合成終止法40ppt課件一、DNA鏈末端合成終止法40ppt課件40GATC

測序反應(yīng)

電泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

正極負極ddGddAddTddC鏈末端合成終止法測定DNA序列的原理41ppt課件GATC測序反應(yīng)電泳5'3'正極負極ddGddA41二、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。42ppt課件二、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實現(xiàn)DNA序列42ddGddAddTddC紅色熒光綠色熒光黃色熒光藍色熒光電泳DNA序列自動分析原理及結(jié)果圖43ppt課件ddGddAddTddC紅色熒光綠色熒光黃色熒光藍色熒光電泳43第四節(jié)基因文庫GeneLibrary44ppt課件第四節(jié)基因文庫44ppt課件44基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。45ppt課件基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)45一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫的載體有

噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。46ppt課件一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的46建立基因組文庫的一般程序1．載體DNA片段的制備

DNA分離純化

限制酶切脫磷酸化反應(yīng)2．供體DNA片段的制備總DNA分離純化機械剪切法分離特定大小DNA片段酶法部分酶切分離特定大小DNA片段（完全酶切）

47ppt課件建立基因組文庫的一般程序1．載體DNA片段的制備47ppt課473.供體與載體DNA連接要提高重組頻率，應(yīng)注意連接反應(yīng)體系中的總DNA濃度和兩種DNA分子的克分子比率。4.重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫的擴增利用轉(zhuǎn)化或感染方法將連接DNA分子導(dǎo)入宿主細胞，讓其自主復(fù)制，重組DNA分子被擴增（重組子比率可能發(fā)生變化）。48ppt課件3.供體與載體DNA連接48ppt課件48基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選49ppt課件基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選49ppt課件49cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。二、cDNA文庫50ppt課件cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRN50cDNA文庫的特點1.基因特異性

常來自結(jié)構(gòu)基因，因此僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表那些正在表達的基因的遺傳信息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，10—15%tRNA。2.器官特異性

不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結(jié)構(gòu)基因的表達就具有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫也就不同。51ppt課件cDNA文庫的特點1.基因特異性51ppt課件513.代謝或發(fā)育特異性處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結(jié)構(gòu)基因表達亦不相同

4.不均勻性在同一個cDNA文庫中，不同類型的cDNA分子的數(shù)目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉(zhuǎn)錄而來的。這與基因組文庫中的單拷貝基因均具有相同的克隆數(shù)相較，這是兩種文庫的另一差別。

5.各cDNA均可獲得表達（一般選用的載體都是表達型的）

52ppt課件3.代謝或發(fā)育特異性52ppt課件52第五節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique53ppt課件第五節(jié)生物芯片技術(shù)53ppt課件53是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物（多聚賴氨酸硅膠）上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)54ppt課件是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支54

基因芯片的工作原理：與經(jīng)典的核酸分子雜交方法（southern

、northern）是一致的，都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子識別探針，能夠在同一時間內(nèi)平行分析大量的基因，進行大信息量的篩選與檢測分析。

基因芯片主要技術(shù)流程包括：芯片的設(shè)計與制備；靶基因的標(biāo)記；芯片雜交與雜交信號檢測。

55ppt課件基因芯片的工作原理：與經(jīng)典的核酸分子雜交方法（so55基因芯片工作流程示意圖56ppt課件基因芯片工作流程示意圖56ppt課件56是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理57ppt課件是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)57第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy58ppt課件第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)58ppt課件58一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)59ppt課件一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交常用蛋白質(zhì)相互作用的研究59標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。60ppt課件標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外60標(biāo)簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖61ppt課件標(biāo)簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖61ppt課件61（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途62ppt課件（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途62ppt課件62酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。63ppt課件酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用63電泳遷移率變動測定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動測定64ppt課件電泳遷移率變動測定(electrophoreticmobi64放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未標(biāo)記探針10X凝膠遷移實驗結(jié)果示意圖65ppt課件放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針1X1X1X1X65染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法66ppt課件染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprec66染色質(zhì)免疫沉淀實驗流程及結(jié)果示意圖67ppt課件染色質(zhì)免疫沉淀實驗流程及結(jié)果示意圖67ppt課件6768ppt課件68ppt課件68遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第七節(jié)69ppt課件遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmen69轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細胞或胚胎干細胞，然后將細胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體。

轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)——目的基因的受體動物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)70ppt課件轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)70ppt7071ppt課件71ppt課件71核轉(zhuǎn)移技術(shù)

即動物整體克隆技術(shù)，將動物的一個體細胞核全部導(dǎo)入另一個體的去胞核的的激活的卵細胞內(nèi)，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)72ppt課件核轉(zhuǎn)移技術(shù)二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)72ppt課件72基因剔除技術(shù)(geneknockout)

也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)73ppt課件基因剔除技術(shù)(geneknockout)三、基因剔除技73將滅活的基因放入胚胎干細胞(embryonicstemcell，ES)中，使這一滅活基因通過同源重組取代原有的目的基因，篩選到基因已定點滅活的細胞后，通過顯微注射將細胞注入小鼠囊胚中。細胞在小鼠囊胚中參與胚胎的發(fā)育，最終形成嵌合體小鼠。操作方式74ppt課件將滅活的基因放入胚胎干細胞(embryonicstemc74建立動物模型①單基因決定疾病模型基因剔除獲得性突變(gain-of-functionmutation)②多基因決定疾病模型四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的作用75ppt課件建立動物模型四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的作用75pp75基本步驟a．基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，成為重組載體?；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴テ渖砉δ埽砸话阍O(shè)計為置換型載體。b．ES細胞的獲得：現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細胞也有使用。常用的鼠的種系是１２９及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎干細胞系也逐漸被發(fā)展應(yīng)用。

76ppt課件基本步驟a．基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異7677ppt課件77ppt課件77ｃ．同源重組：將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導(dǎo)入同源的胚胎干細胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達。一般地，顯微注射命中率較高，但技術(shù)難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用。ｄ．選擇篩選已擊中的細胞：由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動物的重組概率為10－2～10-5。因此如何從眾多細胞中篩出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細胞非常重要。目前常用的方法是正負篩選法（PNS法），標(biāo)記基因的特異位點表達法以及PCR法。其中應(yīng)用最多的是PNS法。

78ppt課件ｃ．同源重組：將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)78ｅ．表型研究：通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的。

f．得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。79ppt課件ｅ．表型研究：通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解目7980ppt課件80ppt課件80第八節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes81ppt課件第八節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定CloningandIde81功能克隆(functionalcloning)定位克隆(positionalcloning)克隆疾病相關(guān)基因的策略82ppt課件功能克隆(functionalcloning)克隆疾病相關(guān)82定義

從對一種致病基因的功能的了解出發(fā)來克隆該致病基因。（一）功能克隆應(yīng)用