免疫與生物技術(shù)實驗室09級-孫長勝生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)蛋白質(zhì)，酶學(xué)酶工程方向20092030312011年12月免疫與生物技術(shù)實驗室09級-孫長勝碩士期間主要研究的內(nèi)容總結(jié)按時間順序進(jìn)行如實記錄，其中有一些時間段幾項研究同時進(jìn)行記錄主要包括如下內(nèi)容：（參考本人實驗記錄5本，每個研究項目的PPT，及實驗圖片結(jié)果）時間內(nèi)容結(jié)果用途展望碩士期間主要研究的內(nèi)容總結(jié)按時間順序進(jìn)行2實驗1：lipB基因的克隆與表達(dá)時間：2009年9月4日-2009年12月4日（三個月）載體：pET30a-tev-rou-LipB，酶切位點BamHⅠ，HindⅢ菌株：DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：成功純化獲得10mL高純度LipB蛋白保存于-70℃冰箱（未使用）用途：幫助師姐（高緒娜）用于研究LipB與LipD蛋白之間關(guān)系（未做）實驗1：lipB基因的克隆與表達(dá)時間：2009年9月4日-23實驗1：lipB基因的克隆與表達(dá)核心技術(shù)：全面學(xué)習(xí)分子生物學(xué)相關(guān)實驗操作PCR（三輪），提取質(zhì)粒，瓊脂糖電泳，切膠回收，酶切連接，轉(zhuǎn)化，菌落PCR，搖菌，保種，送樣測序蛋白表達(dá)，測OD值提取周質(zhì)，超聲波破碎，Ni柱純化，SDS檢測分子篩G-25脫鹽，TEV蛋白酶切，離子交換柱DEAE純化，G250測蛋白含量，分光光度計測蛋白含量透析袋透析樣品，自動部分收集裝置，冷凍干燥裝置配置培養(yǎng)基及各種常用試劑實驗1：lipB基因的克隆與表達(dá)核心技術(shù)：全面學(xué)習(xí)分子生物學(xué)4實驗2：飼養(yǎng)果蠅時間：2009年12月5日-2011年6月（一年半）內(nèi)容：向師姐（狄廷娣）學(xué)習(xí)果蠅的基本知識及管理果蠅核心技術(shù)：配制果蠅培養(yǎng)基果蠅保種更換培養(yǎng)基（每月一次）清洗果蠅保種指管成功將所有轉(zhuǎn)基因果蠅分類整理果蠅受螨蟲污染一次，轉(zhuǎn)基因品系86死亡一次，成功解決。實驗2：飼養(yǎng)果蠅時間：2009年12月5日-2011年6月（5實驗3：構(gòu)建載體時間：2009年12月7日-2009年12月17日載體：pET28b-sp-hisYeb-ACP/P→A，酶切位點NcoⅠ，HindⅢ,構(gòu)建pBAD24-sp-hisYeb-ACP/P→A,檢測pBAD24-sp-hisYeb-BCCP,檢測pBAD24-sp-hisYeb-ACP-4A/6A/8A,4S/6S/8S菌株：DH5α菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：均成功用途：幫助師姐（高緒娜）做實驗實驗3：構(gòu)建載體時間：2009年12月7日-2009年12月6實驗4：突變groEL基因的克隆與表達(dá)1時間：2009年12月22日-2010年1月21日（放假前）載體：pET30a-tev-mutGroEL，酶切位點EcoRⅠ，HindⅢ結(jié)果：PCR擴(kuò)增出groEL后，利用定點突變技術(shù)突變第87號氨基酸。由于操作技術(shù)的不熟練及搖種管清洗不干凈（后購買超聲波清洗儀），及培養(yǎng)基染菌，感受態(tài)有問題等多方面原因?qū)е缕陂g沒有完成到測序正確這一實驗步驟。實驗4：突變groEL基因的克隆與表達(dá)1時間：2009年127實驗4：突變groEL基因的克隆與表達(dá)2時間：2010年2月27日-2010年5月19日（3個月）載體：成功構(gòu)建pET30a-tev-mutGroEL，酶切位點EcoRⅠ，HindⅢ菌株：DH5α和BL21相應(yīng)菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：成功獲得上述菌株，成功進(jìn)行融合蛋白表達(dá)純化，成功進(jìn)行TEV蛋白酶酶切，最后獲得目的蛋白失敗。該融合蛋白表達(dá)量很大，Ni純化效果好，TEV蛋白酶能酶切，但分子篩和離子交換柱純化導(dǎo)致降解，原因不明。之后Ni柱，分子篩，離子交換柱再生后，多次重復(fù)試驗后結(jié)果相同。至此純化該目的蛋白實驗失??！實驗4：突變groEL基因的克隆與表達(dá)2時間：2010年2月8實驗5：birA基因的克隆與表達(dá)時間：2010年3月15日-2010年4月17日（一個月）載體：pET28b-His6-BirA，酶切位點NcoⅠ，HindⅢ菌株：DH5α和BL21相應(yīng)菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：成功純化獲得8mL高純度BirA蛋白保存于-70℃冰箱（未使用）用途：幫助師兄（陳南）用于BirA的表達(dá)情況研究及pBAD34-hisbirA與含有BCCP的質(zhì)粒共表達(dá)情況的研究核心技術(shù)：常規(guī)構(gòu)建質(zhì)粒，常規(guī)表達(dá)純化（表達(dá)量大，易純化），分子篩脫鹽后保存實驗5：birA基因的克隆與表達(dá)時間：2010年3月15日-9實驗6：構(gòu)建載體時間：2010年4月11日-2010年5月17日（1個月）菌株：DH5α及JM109相關(guān)菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：成功獲得含pBAD24-sp-hisMBP-ACP，pBAD24-sp-hisYeb-ACP的菌并制備相應(yīng)感受態(tài)，成功獲得菌pBAD34-ACPS質(zhì)粒,成功轉(zhuǎn)化獲得上述兩種雙質(zhì)粒菌株，成功構(gòu)建pBAD24-sp-hisMBP-ACP（突變），pBAD24-sp-hisYeb-ACP（突變）質(zhì)粒，成功表達(dá)，提周質(zhì)，SDS檢測三種JM109菌株的pQE-sp-hisYeb-sulf原始菌及基因敲除菌。用途：幫助師姐（高緒娜）師兄（陳南）用于大腸桿菌分泌表達(dá)的研究實驗。實驗6：構(gòu)建載體時間：2010年4月11日-2010年5月110實驗7：果蠅理論學(xué)習(xí)時間：2010年6月-2010年12月（6個月）內(nèi)容：觀察并學(xué)習(xí)果蠅基本實驗技術(shù)詳細(xì)查看果蠅相關(guān)文獻(xiàn)（100篇左右）重點了解果蠅局部免疫相關(guān)知識背景，并制定研究果蠅氣管局部免疫實驗方案。廣州天河區(qū)政府農(nóng)業(yè)局農(nóng)業(yè)局實習(xí)-農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測員實驗7：果蠅理論學(xué)習(xí)時間：2010年6月-2010年12月（11實驗8：蛋白表達(dá)時間：2010年8月27日-2010年9月17日內(nèi)容：pBAD24-sp-hisMBP-ACP，pBAD24-sp-hisYeb-ACP與pBAD34-ACPS的共表達(dá)DH5a菌株pBAD24-sp-hisMBP-ACP，pBAD24-sp-hisYeb-ACP與pBAD34-ACPS的共表達(dá)BL21菌株pET28b-sp-hisMBP-ACP，pET28b-sp-hisYeb-ACP的表達(dá)，加疊氮化鈉大量表達(dá)，提周質(zhì)，用超濾柱濃縮，過Ni柱等用途：幫助師兄（陳南）用于大腸桿菌分泌表達(dá)的研究實驗。實驗8：蛋白表達(dá)時間：2010年8月27日-2010年9月112實驗9：果蠅氣管熒光觀察研究實驗時間：2010年9月13日-2010年11月23日（2個月）內(nèi)容：采用不同的誘導(dǎo)方式，及不同的菌探索，處理果蠅，進(jìn)行多次觀察果蠅氣管及全身用含有pET30-GFP的大腸桿菌飼喂果蠅，進(jìn)行熒光觀察合成引物，提取果蠅基因組進(jìn)行品系確認(rèn)結(jié)果及核心技術(shù)：成功掌握果蠅的誘導(dǎo)處理方法成功掌握三個實驗室的不同熒光顯微鏡使用方法成功得到一系列果蠅氣管熒光照片，并確定一些結(jié)論遺憾的是由于師姐（郝芬）畢業(yè)論文中的引物錯誤（2011年4月馬皖燕發(fā)現(xiàn)），導(dǎo)致PCR確定果蠅品系失敗，至此實驗失敗終結(jié)！實驗9：果蠅氣管熒光觀察研究實驗時間：2010年9月13日-13實驗10：重新表達(dá)純化GroEL蛋白時間：2010年11月11日-2011年8月27日（9個月）載體：pET30a-tev-mutGroEL，BL21菌株（3月7日保存）結(jié)果：此次按照常規(guī)表達(dá)純化方法很容易的就得到目的蛋白，未出現(xiàn)之前的講解現(xiàn)象至此終于成功純化獲得4mL高純度mutGroEL蛋白保存于-70℃冰箱用途：純化的mutGroEL蛋白用于本人關(guān)于SecA蛋白功能的體外研究實驗用融合蛋白用于本人關(guān)于重組His6-TEV，ACP-TEV蛋白酶特性的研究，作為底物蛋白實驗10：重新表達(dá)純化GroEL蛋白時間：2010年11月114實驗11：SecB表達(dá)與純化時間：2010年11月22日-2011年8月27日（9個月）載體：pET30a-His6-tev-SecB，酶切位點BamHⅠ，HindIII菌株：DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：多次表達(dá)純化結(jié)果表明，產(chǎn)量大，易純化，現(xiàn)成功純化獲得10mL高純度SecB蛋白保存于-70℃冰箱用途：純化的SecB蛋白用于本人關(guān)于SecA蛋白功能的體外研究實驗用實驗11：SecB表達(dá)與純化時間：2010年11月22日-215實驗12：sp-GFP融合蛋白的獲得時間：2010年12月1日-2011年7月18日（8個月）載體：成功構(gòu)建如下載體pET30a-his-tev-SP-Yeb-GFPpET30a-his-tev-SP-MBP-GFPpET28b-sp-hisMBP-tev-sp-GFPpET30a-his-tev-sp-GFPpET30a-hisMBP-tev-sp-GFPpET28b-sp-hisYeb-GFP-6HispET28b-sp-hisMBP-GFP-6His菌株：DH5α和BL21對應(yīng)菌株保存于-70℃冰箱實驗12：sp-GFP融合蛋白的獲得時間：2010年12月116實驗12：sp-GFP融合蛋白的獲得結(jié)果：成功構(gòu)建一系列載體，成功表達(dá)一系列融合蛋白，但部分菌體分泌表達(dá)量少，或胞內(nèi)表達(dá)量大但形成包涵體，可溶性目的蛋白少，不易純化。含有TEV酶切位點的融合蛋白不能很好酶切開。選擇pET28b-sp-hisMBP-GFP-6His進(jìn)行后續(xù)試驗。表達(dá)純化方法采用：NaN3抑制后，先提周質(zhì)，對剩余沉淀進(jìn)行破碎，過Ni柱純化，效果不錯！用途：純化的SP...GFP蛋白用于本人關(guān)于SecA蛋白功能的體外研究實驗用核心技術(shù)：設(shè)計引物，序列比對分析，蛋白表達(dá)純化實驗12：sp-GFP融合蛋白的獲得結(jié)果：成功構(gòu)建一系列載體17實驗13：SecA的表達(dá)及功能的研究時間：2010年11月22日-2011年8月27日（9個月）載體：pET30a-hisMBP-tev-SecApET30a-His-SecApET30a-HisMBP-tev-rou-SecA菌株：DH5α和BL21相關(guān)菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：第一個融合蛋白無法切開，單純表達(dá)SecA降解，第三個表達(dá)量大，易純化，能完全酶切，故選擇第三個表達(dá)純化?，F(xiàn)成功純化獲得4mL高純度SecA蛋白保存于-70℃冰箱實驗13：SecA的表達(dá)及功能的研究時間：2010年11月218實驗13：SecA的表達(dá)及功能的研究用途：研究SecA的功能用之前純化得到的SP-GFP先用不同濃度的尿素變性處理之后加入SceB結(jié)合反應(yīng)，熒光分光度計測量。之后加入SecA及GroEL，測值后，再次加入ATP，測值分析多次探索及重復(fù)實驗后，未得到預(yù)期結(jié)果，原因復(fù)雜核心技術(shù)引物設(shè)計，T栽連接，蛋白表達(dá)純化，濃縮脫鹽柱四種蛋白結(jié)合實驗，反應(yīng)體系確定，各組分含量確定熒光分光光度計使用非變性SDS，westrenblot實驗13：SecA的表達(dá)及功能的研究用途：19實驗14：純化系統(tǒng)及MBP柱摸索時間：2010年12月29日-2011年3月25日（3個月）內(nèi)容：新購買的電腦層析采集儀以及MBP親和層預(yù)裝柱探索使用熟悉整套蛋白純化分析系統(tǒng)（分子篩S-100，離子交換柱DEAE，Ni柱，MBP柱，恒流泵，凝膠蛋白檢測儀，電腦層析采集儀，自動部分收集器，梯度混合儀）利用上述裝置對所需要的目的蛋白進(jìn)行純化分析，結(jié)果證明MBP預(yù)裝柱有問題實驗14：純化系統(tǒng)及MBP柱摸索時間：2010年12月29日20實驗15：轉(zhuǎn)基因果蠅時間：2010年12月-2011年4月（5個月）內(nèi)容：幫助師姐（馬婉燕）進(jìn)行轉(zhuǎn)基因果蠅，同時自己也親自進(jìn)行一次轉(zhuǎn)基因果蠅操作，但失敗。學(xué)習(xí)激光共聚焦操作，成功！核心技術(shù)：轉(zhuǎn)基因果蠅相關(guān)操作激光共聚焦儀器使用轉(zhuǎn)基因果蠅雜交及形態(tài)學(xué)區(qū)分誘導(dǎo)處理熒光顯微觀察，激光共聚焦觀察果蠅總蛋白提取westernblot實驗15：轉(zhuǎn)基因果蠅時間：2010年12月-2011年4月（21實驗16：重組TEV蛋白酶的表達(dá)及特性研究時間：2011年1月17日-2011年5月3日（4個月）載體：pET30a-MBP-His6-TEV,師兄構(gòu)建（梁炯球）菌株：DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：經(jīng)過大量表達(dá)純化，兩次成功獲得共計約40mL的高純度重組His6-TEV蛋白酶存于-70℃冰箱。之后進(jìn)行的一系列TEV蛋白酶切活性分析都成功。用途：由于之前TEV蛋白酶切不開一些融合蛋白，本人懷疑之前的TEV蛋白酶失活，即開始進(jìn)行表達(dá)純化TEV蛋白酶實驗。同時由于本實驗室長期使用該酶，發(fā)現(xiàn)有一些性質(zhì)，即研究探索用于發(fā)表論文。用于本實驗酶切融合蛋白和本人研究TEV蛋白酶性質(zhì)用實驗16：重組TEV蛋白酶的表達(dá)及特性研究時間：2011年122實驗17：MBP-BCCP/BCCP87的表達(dá)時間：2011年3月28日-2011年11月27日（8個月）載體：pET28b-sp-hisMBP-tev-BCCPpET28b-sp-hisMBP-tev-BCCP87pET30a-hisMBP-tev-BCCPpET30a-hisMBP-tev-BCCP87菌株：DH5α和BL21相關(guān)菌株保存于-70℃冰箱結(jié)果：成功純化獲得5mL高純度融合蛋白MBP-BCCP及MBP-BCCP87保存于-70℃冰箱用途：MBP-BCCP用于重組TEV蛋白酶切底物MBP-BCCP87用于SecA體外實驗研究，替代sp-GFP，與SecA，SecB，GroEL相互作用，通過二次過Ni柱，膜胞透析，非變性SDS檢測與之前的表達(dá)的BirA蛋白做進(jìn)一步研究實驗17：MBP-BCCP/BCCP87的表達(dá)時間：201123實驗18：指導(dǎo)實驗時間：2011年4月-2011年5月（2個月）內(nèi)容：指導(dǎo)師弟（張哲民），師妹（何秋麗）實驗成功構(gòu)建載體，DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱pET28b-sp-hisYeb-PGRP（SA）pET30a-His-PGRP（SA）pET30a-his-MBP-Tev-PGRP（SA）pET30a--SecA-GFPpBAD34-SecA-GFPpBAD24-sp-His-Yeb-LacZpBAD24-sp-His-Yeb-ACP成功表達(dá)純化實驗18：指導(dǎo)實驗時間：2011年4月-2011年5月（2個24實驗19：整理實驗室時間：2011年5月-2011年8月（3個月）內(nèi)容：對本實驗室儀器進(jìn)行維護(hù)，并分類制定Word版記錄對本實驗試劑，耗材進(jìn)行分類整理，并分類制定Word版記錄整理4℃冰箱，-20℃冰箱，-70℃冰箱涉及物品復(fù)雜未進(jìn)行整理整理藥品試劑柜實驗19：整理實驗室時間：2011年5月-2011年8月（325實驗20：ACP-TEV的克隆與表達(dá)時間：2011年8月1日-2011年11月20日（3個月）載體：pET28-MBP--TEVpET28-MBP-His6-ACP-TEV原始（2C）與pBAD34-ACPs（共表達(dá)）pET28-MBP-His6-ACP-mTEV（1G）pET28-MBP-His6-ACP-mTEV（2G）突變（2G）與pBAD34-ACPs（共表達(dá)）pET28-MBP-His6-ACP-mTEV（2S）突變（2S）與pBAD34-ACPs（共表達(dá)）菌株：DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱實驗20：ACP-TEV的克隆與表達(dá)時間：2011年8月1日26實驗20：ACP-TEV的克隆與表達(dá)結(jié)果：成功表達(dá)上述不同類型的TEV蛋白酶，其中hisACP-TEV蛋白酶有3mL高濃度的存于-70℃冰箱各種蛋白酶均具有活性，原始的ACP-TEV表達(dá)量高，可溶性好，活性強(qiáng)，突變后性質(zhì)有所變化用途：用于本人酶切融合蛋白和進(jìn)行固定化實驗核心技術(shù)：定點突變，單表達(dá)，共表達(dá)，Ni柱，純化，脫鹽濃縮柱，分子篩S-100，蛋白濃度定量，蛋白酶活性檢測，TEV酶切體系，SDS實驗20：ACP-TEV的克隆與表達(dá)結(jié)果：成功表達(dá)上述不同類27實驗21：重組TEV蛋白酶的固定化