關(guān)于瘦肉精在大鼠體內(nèi)的代謝瘦肉精簡介理化性質(zhì)：通常我們所說的瘦肉精是指克倫特羅(Clenbuterol)，學名為鹽酸克侖特羅，簡稱克侖特羅，又名克喘素、氨哮素、氨必妥、氨雙氯喘通。為白色結(jié)晶狀粉末，味略苦。結(jié)構(gòu)簡式：分子式：C12H18Cl2N2O

理化特性：白色或類白色的結(jié)晶粉末，無臭、味苦，熔點161℃，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。

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當鹽酸克林特羅以超過治療劑量5-10倍的用量用于家畜飼養(yǎng)時，即有顯著的營養(yǎng)“再分配效應”——促進動物體蛋白質(zhì)沉積、促進脂肪分解抑制脂肪沉積，能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率，因此曾被用作牛、羊、禽、豬等畜禽的促生長劑、飼料添加劑。1ug/mL的鹽酸克倫特羅添加于豬飼料中用于促生長，人食用豬肝或豬肺足夠引起中毒。世界沒有任何正規(guī)機構(gòu)批準克倫特羅作為飼料添加劑用于動物促生長?！笆萑饩卑}酸克侖特羅在我國已經(jīng)被禁用。由于美國人不吃畜禽的內(nèi)臟，因此允許使用一定量的瘦肉精。第4頁,共26頁，2024年2月25日，星期天摘要

本實驗研究了14C標記的克倫特羅在雌雄大鼠體內(nèi)的代謝。喂食每只大鼠200μg/kg體重的14C克倫特羅，并在之后8天期間研究其代謝產(chǎn)物和過程。發(fā)現(xiàn)有大約60%的放射性物質(zhì)（14C）從尿液中排出，雄鼠和雌鼠分別有20%和30%的放射性物質(zhì)（14C）從糞便中排出。利用HPLC（高效液相色譜法）檢測放射性物質(zhì)（14C）可以對克倫特羅的代謝產(chǎn)物進行鑒定和定量，發(fā)現(xiàn)尿液中的一些代謝產(chǎn)物是不穩(wěn)定的。大部分尿液和糞便中的克倫特羅代謝產(chǎn)物可以使用各種MS（質(zhì)譜）分析技術(shù)進行分離和鑒定。在大鼠被給藥后，分析方法也可以建立克倫特羅在糞便和組織中代謝產(chǎn)物長達72h的圖譜?？藗愄亓_的主要代謝過程包括：N-脫烷基化（仲胺），N-氧化和硫酸共軛（伯胺）。另外，對不同性別大鼠的克侖特羅代謝產(chǎn)物中N-脫烷基化比率的差異進行觀察。大鼠尿液中檢測到的主要代謝產(chǎn)物是4-N-羥胺，而糞便中的放射性物質(zhì)（14C）大多與氨基磺酸克侖特羅有關(guān)。第5頁,共26頁，2024年2月25日，星期天實驗材料和方法1.實驗試劑：克倫特羅和用于標記的分子[14C]CL[4-氨基-3,5-二氯-α-[（叔丁基氨基甲基）]芐基醇。甲酸、乙酸、解旋酶、VI型硫酸、D型葡糖二酸-1,4-內(nèi)酯。2.實驗動物：8只成年大鼠（4只雄性和4只雌性）。第6頁,共26頁，2024年2月25日，星期天3.實驗樣品的采集：大鼠的排泄物的采集：8只成年大鼠被單獨飼養(yǎng)在不銹鋼籠中。允許大鼠自由飲水并且有一個標準的日常飲食。大鼠的平均重量分別為42721g（雄性）和29924g（雌性）。一周的環(huán)境適應期后，每只大鼠被強制喂食200μg/kg體重的14C標記的克倫特羅。后面的8天，每天把尿液和糞便收集起來備用。最后，大鼠被放血致死。鼠籠要單獨用500ml的甲醇/水（1：1，v/v）清洗干凈，并從中取1ml作為樣品做放射性物質(zhì)測定。取下肝臟，如果不立即使用，這些樣品都要儲存在-20℃下。第7頁,共26頁，2024年2月25日，星期天組織樣品的采集：4只雄性大鼠（年齡，10周）被安置在如上文所述的環(huán)境中。分別在喂食克侖特羅后12h，24h，48h和72h通過放血處死大鼠。切除肝，肺和腎并存儲在-20℃下。鹽酸克倫特羅劑量的影響：3只雄性大鼠（年齡，10周）被安置在如上所述環(huán)境中。分別強制喂食5，20，40mg/kg體重14C標記的克侖特羅。3天內(nèi)，每天收集3次尿液和糞便并儲存在-20℃下用于研究。第8頁,共26頁，2024年2月25日，星期天4.儀器設備：主要有HPLC（高效液相色譜儀）、放射性物質(zhì)檢測器、吉爾森模型202餾分收集器、UV（紫外）分光光度計、帕卡德液體閃爍計數(shù)器。第9頁,共26頁，2024年2月25日，星期天5.實驗過程：尿液：尿液樣品與甲醇混合（1：2，v/v），攪拌，以10000rpm（4℃）離心10min，將沉淀物丟棄，上清液在真空下濃縮并用微孔濾膜（0.5g，0.45μm）過濾，最后用HPLC進行分析。糞便：通過初步分析這4只大鼠的糞便來確定大鼠組織中瘦肉精代謝產(chǎn)物的概況，目的是判斷大鼠糞便中是否存在不穩(wěn)定或揮發(fā)性的克侖特羅代謝產(chǎn)物。冷凍干燥前后的這些糞便樣品中的放射性物質(zhì)含量需要通過完全燃燒和液體閃爍計數(shù)器來確定。通過對糞便提取物進行分析，比較新鮮和凍干樣品中克侖特羅代謝產(chǎn)物。第10頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

研究期間將每天收集到的大鼠糞便進行冷凍干燥，然后利用球磨床均質(zhì)化，再對每個樣品中的14C進行測定。將大約0.5g的冷凍干燥樣品與甲醇/100mM的乙酸銨混勻2min，pH值3.2（1：6：3，w/v/v），然后在10000rpm下（4℃）離心10min。將沉淀再用相同的溶劑混合萃取兩次，再與甲醇/1mM的氫氧化銨（1：6：3，w/v/v）混均萃取一次。放射性物質(zhì)計數(shù)完成后，將4個上清液合并，用異辛烷去脂，并在N2條件下濃縮。將所得提取物在微濾膜（0.5g，0.45μm）下進行過濾，然后利用HPLC進行分析，最后通過燃燒分析來確定離心沉淀中的放射性物質(zhì)殘留。對每只大鼠的2天和3天的糞便以及雌性大鼠4天的糞便分別進行處理并分析，以確定糞便中代謝產(chǎn)物的組成和變化。喂食大鼠較高劑量的克侖特羅并對其糞便進行同樣的分析流程。第11頁,共26頁，2024年2月25日，星期天組織：提取約5g的肝臟組織對肝臟代謝產(chǎn)物進行分析。將樣品切成小片，并使用6ml/g的乙腈/甲醇/50mM乙酸銨緩沖液均質(zhì)化，pH3.2（6：3：1，v/v/v），然后在10000rpm和4℃離心10min。將上清液立即存儲在-20℃下，將沉淀物再進行5次萃取，即2次使用同樣的溶劑，1次用乙腈/甲醇/50mM的碳酸氫鈉緩沖液在pH8.35（6：3：1，v/v/v）條件下進行萃取，最后2次用乙腈/甲醇/1mM的氫氧化鈉（6：3：1，v/v/v）進行萃取。最后殘留的每個樣品的離心沉淀通過燃燒分析測定放射性物質(zhì)殘留。合并上述6個上清液，用乙腈飽和異辛烷去脂，真空濃縮，并在如上所述的條件下過濾，最后用HPLC分析。肺和腎臟中的代謝產(chǎn)物的檢測是使用相同的提取方法。腎樣品使用前，要用水洗滌兩次再進行提取。第12頁,共26頁，2024年2月25日，星期天酶解：將粗制尿20μl（或2μl純化代謝產(chǎn)物加入20μl水中）與480μl0.1M乙酸鈉緩沖液（pH4.8）和20μl的培養(yǎng)液（即2000菲什曼單位B-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶活性的20000羅伊單位）混合，并在42℃酶解16h。對酶解后的產(chǎn)物進行離心，然后用微濾膜（0.5g，0.45μl）過濾，再用放射性-HPLC進行分析。復測定在相同的條件下進行，不同的是加入了10μlD-葡糖二酸-1,4-內(nèi)酯來抑制b-葡糖醛酸酶的活性。更具體的是通過對純化后的代謝產(chǎn)物進行測定，來檢測是否有硫化反應的發(fā)生。在每個2μl代謝產(chǎn)物樣品中加入450μl20mMTris緩沖液和50ml產(chǎn)氣桿菌、VI型硫酸酯酶在pH為7.1和37℃的條件下培養(yǎng)16h，然后進行和上文中同樣的分析。第13頁,共26頁，2024年2月25日，星期天尿液中代謝產(chǎn)物的分離：主要有兩種方法1.使用HPLC結(jié)合餾分收集器進行分離。2.使用C8柱進行分離。第14頁,共26頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果分析與討論1.大鼠的代謝平衡。每只大鼠被喂食200μg/kg的克倫特羅，并通過8天的研究發(fā)現(xiàn)：雄性大鼠代謝了87.12.5％的14C，雌性大鼠代謝了90.24.2％的14C。放射性物質(zhì)(14C）主要通過尿液排出，而通過糞便排出的14C比較少（見表1），雌性大鼠尿液中的14C所占比例更高（P<0.05）。與雄性大鼠比較，14C通過雌性大鼠尿液的排泄較慢。并且直到第5天（見圖1），14C在雌性大鼠糞便中的含量還是比較可觀的。在研究結(jié)束時，雄性大鼠尸體中殘留的放射性物質(zhì)含量相當于克侖特羅3.620.36ng/g,而雌性大鼠尸體中放射性物質(zhì)含量只有相當于瘦肉精2.200.62ng/g（P<0.05）。大鼠呼出的14CO2占總喂食劑量的比例小于1%。第15頁,共26頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共26頁，2024年2月25日，星期天2.尿液中克侖特羅代謝產(chǎn)物的放射性-HPLC分析和定量。由圖1可知：在大鼠尿液中檢測到14個不同的放射峰。一些峰在采集的新鮮尿液中是從來沒有檢測到的（或者僅檢測到微量）。對被喂食200μg/kg克侖特羅的大鼠的尿液進行放射性-HPLC分析，結(jié)果見圖2，由此研究克侖特羅代謝產(chǎn)物完整的分布狀況。由于尿液在進行分析時，已經(jīng)在4℃下貯存了24h，因此，化合物M9和M12出現(xiàn)在了色譜圖上。如果相同的樣品在采集后立即進行分析，它們就不能被檢測到。

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對大鼠代謝平衡研究期間收集的尿液樣本進行了放射性-HPLC分析。表2列出各組動物在被給藥后0-24h獲得的結(jié)果。由表2可知：M5和M11，以及含量較少的M1和M3，是檢測到的主要代謝產(chǎn)物。另外，M5是雄性和雌性大鼠的主要代謝產(chǎn)物。第5個代謝物M8占雄性大鼠尿液中放射性物質(zhì)的15％，而在相同的時間（約26min），雌性尿液中M8的峰區(qū)信號卻很弱。觀察其他代謝物信號的差異，代謝物M2從未在雌性大鼠尿液中被檢測到。在這一組中，雌性大鼠未代謝的克侖特羅的比例比在雄性大鼠要（分別為37%和16％，）大得多。第18頁,共26頁，2024年2月25日，星期天克侖特羅喂給量對大鼠尿液中代謝產(chǎn)物的影響。給3只大鼠單次喂食更高劑量的克侖特羅，在給藥后的前96h期間收集尿液樣本。在將代謝產(chǎn)物分離前，對這些樣品進行放射性-HPLC分析。母體化合物各成分組成和其主要代謝產(chǎn)物在尿液中的總放射性物質(zhì)含量和計算（見圖3）。除了沒有被代謝的瘦肉精，M5是被喂食5-40mg/kg克侖特羅的大鼠尿液中檢測到的主要代謝產(chǎn)物。另外，M5在尿液中的所占比例較高且含量也很高。第19頁,共26頁，2024年2月25日，星期天酶解。在雄性大鼠尿液與培養(yǎng)液培養(yǎng)16h后，原來所有檢測到的放射性代謝產(chǎn)物M5都轉(zhuǎn)變?yōu)榭藖鎏亓_。此外，檢測不到M7，而增加了相應含量的放射性代謝產(chǎn)物M9。另外，發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物M5與硫酸混合或與培養(yǎng)液和D-葡糖酸-1,4-內(nèi)酯混合時會部分或全部轉(zhuǎn)化為克侖特羅，在沒有酶參與的相同條件下進行的對照培養(yǎng)試驗也獲得了同樣的結(jié)果。第20頁,共26頁，2024年2月25日，星期天3.大鼠糞便中代謝產(chǎn)物的放射性-HPLC分析和定量。初步實驗結(jié)果表明，冷凍干燥不會引起大鼠糞便中放射性代謝產(chǎn)物的流失，也不會對放射性-HPLC分析的結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，在對所有收集的糞便利用溶劑萃取前，都可以進行冷凍干燥。冷凍干燥主要是用于放射性水平最高的樣品，即雄性大鼠的第2天和第3天的糞便和雌性大鼠2-4天的糞便。本次研究中85％的放射性物質(zhì)可以在雄性大鼠第2天或第3天的糞便中被發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表明雌性大鼠也有類似的結(jié)果（在第3天的糞便中發(fā)現(xiàn)86％的放射性物質(zhì)），并且在2-4天后放射性物質(zhì)沒有顯著變化。前兩次酸性提取物中的放射性物質(zhì)含量占總放射性代謝產(chǎn)物的比例始終超過95％。

第21頁,共26頁，2024年2月25日，星期天M3是雄性和雌性大鼠糞便中的主要代謝產(chǎn)物。通過放射性-HPLC分析發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠第3天的糞便中，M3和克侖特羅占總放射性代謝產(chǎn)物的比例分別為67.612.4和28.313.2％。另外，觀察到一種（或多種）非常少量的極性代謝產(chǎn)物，峰區(qū)有4-5min的停留時間。雌性大鼠糞便中的代謝產(chǎn)物也有相似的組成（見圖4），在第3天，雌性大鼠糞便中M3和克侖特羅占總放射性代謝產(chǎn)物的比例分別為78.13.5和15.84.0％。數(shù)量有限的M9，M11和極性代謝產(chǎn)物，也在一些提取物中被檢測到。對第2和第4天糞便分析后得到了非常類似的結(jié)果。喂食大鼠高劑量的克侖特羅并不能改變大鼠糞便中代謝產(chǎn)物的組成和成分。第22頁,共26頁，2024年2月25日，星期天4.組織中放射性物質(zhì)殘留。由圖5A可知：肝是靶器官，但在肺和腎臟中也測到顯著水平的放射性物質(zhì)殘留。超過48h，所有組織中放射性物質(zhì)含量迅速下降，但在肝和肺中仍能檢測到。肝結(jié)合的放射性物質(zhì)占各組織中總放射性物質(zhì)的32％（12和24h），39％（48h），和64％（72h）。8天的代謝平衡研究表明：雄性和雌性大鼠肝臟中殘留的14C水平分別相當于14.2和12.8ng的克侖特羅當量/g（P>0.05）。第23頁