cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

主要內(nèi)容一、基因文庫(kù)的概念及意義文庫(kù)〔library〕：指一種全體的集合?；蛭膸?kù)〔genelibrary〕:是某一生物類型全部基因的集合，這些基因以克隆的形式存在〔人工構(gòu)建〕。基因文庫(kù)與基因庫(kù)〔genebank〕區(qū)別基因文庫(kù)與基因克隆基因庫(kù)是指某一生物群體中的全部基因?；蚩寺∈侵话承┨囟ɑ蚧駾NA片段的克隆。基因文庫(kù)中包含著為數(shù)眾多的克隆，建成后可供隨時(shí)選取其中任何一個(gè)基因克隆之用。構(gòu)建基因文庫(kù)的意義☆使生物的遺傳信息以穩(wěn)定的重組體形式貯存起來;☆是一種別離克隆目的基因的主要途徑；☆基因文庫(kù)也是復(fù)雜基因組作圖的重要依據(jù)。根據(jù)基因類型〔重組DNA片段的供體〕基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)1、基因組文庫(kù)構(gòu)建流程抽提基因組DNA鳥槍法制備DNA片段DNA片段與載體重組轉(zhuǎn)化宿主菌篩選目的基因〔核酸探針法、免疫結(jié)合法〕基因文庫(kù)限制性內(nèi)切酶……克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝特點(diǎn)及應(yīng)用：包含所有遺傳信息構(gòu)建難度大〔單拷貝基因、長(zhǎng)片段基因〕篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況基因組物理圖譜的構(gòu)建基因組序列分析基因在染色體上的定位克隆鑒定基因調(diào)控元件基因組中基因的結(jié)構(gòu)和組織形式分析基因組DNA文庫(kù)應(yīng)用結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA2、cDNA文庫(kù)cDNA是指以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ)DNA(簡(jiǎn)稱cDNA)。cDNA文庫(kù)(complementaryDNAlibrary)以組織細(xì)胞中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫(kù)。代表特定細(xì)胞或組織中mRAN的文庫(kù)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA自20世紀(jì)70年代中期首例

cDNA

克隆問世以來，構(gòu)建

cDNA

文庫(kù)已成為研究功能基因組學(xué)的根本手段之一。cDNA

便于克隆和大量表達(dá)，它不像基因組含有內(nèi)含子而難于表達(dá)，因此可以從

cDNA

文庫(kù)中篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達(dá)。通過構(gòu)建

cDNA

表達(dá)文庫(kù)不僅可保護(hù)瀕危珍惜生物資源，而且可以提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜的所用探針，更重要的是可以用于別離全長(zhǎng)基因進(jìn)而開展基因功能研究。因此，cDNA

在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方便具有特殊的優(yōu)勢(shì)，從而使它在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值，是研究工作中最常使用到的基因文庫(kù)。

cDNA文庫(kù)優(yōu)點(diǎn)(1)使遺傳物質(zhì)為RNA病毒可建立文庫(kù)；(2)因克隆數(shù)比基因組文庫(kù)少得多，易于篩選；(3)從分化特異的細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中可別離到特異表達(dá)的基因。(4)建庫(kù)時(shí)已排除了其它的RNA，使假陽性率減低。(5)cDNA文庫(kù)可在細(xì)菌中表達(dá)，可用多種策略進(jìn)行篩選。cDNA文庫(kù)便于克隆和大量擴(kuò)增，可以從cDNA文庫(kù)中篩選到所需目的基因，并用于該目的基因的表達(dá)。一個(gè)細(xì)胞在任何時(shí)間可以產(chǎn)生幾千種不同的蛋白質(zhì)，所有的蛋白質(zhì)都有相應(yīng)的mRNA分子。為了鑒別其中任何一個(gè)mRNA分子，每一單獨(dú)mRNA的克隆都得考慮，但是mRNA不能直接用于克隆，因?yàn)樗懿环€(wěn)定，因此，可以合成與選定組織中所有mRNA互補(bǔ)的DNA分子〔complementaryDNA，cDNA〕。信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫(kù)注意(1)細(xì)胞中不同mRNA的豐度不同，低豐度的mRNA要求很高的克隆數(shù)(要用公式來計(jì)算)。(2)有的基因表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空性，要獲得其mRNA并非易事。用不同發(fā)育階段，或不同組織細(xì)胞中的mRNA制備的cDNA文庫(kù)會(huì)包含一些共同和特異序列。這可用于別離差異表達(dá)的基因。(3)cDNA文庫(kù)的DNA無內(nèi)含子、調(diào)節(jié)元件和基因間DNA。不能用于基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的研究。一個(gè)基因經(jīng)不同的剪接可產(chǎn)生不同的局部重疊的cDNA克隆。3、cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)的區(qū)別

時(shí)效性cDNA文庫(kù)代表某一時(shí)期特定細(xì)胞或組織中mRAN，是轉(zhuǎn)錄水平，僅反映某一時(shí)期特定組織表達(dá)的功能基因，不是全部基因；而基因組文庫(kù)包含該生物所有基因，序列組成不同cDNA文庫(kù)無間隔序列和調(diào)控區(qū)等非編碼區(qū)；基因組文庫(kù)可真實(shí)顯示基因組的全部結(jié)構(gòu)信息，由于制備DNA片段的切點(diǎn)是隨機(jī)的，所以每一克隆內(nèi)所含的DNA片段既可能是一個(gè)或幾個(gè)基因，也可能是一個(gè)基因的一局部或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近DNA順序。兩種文庫(kù)均有應(yīng)用，如何選擇根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康模趧e離植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、別離植物特定發(fā)育階段或特特異表達(dá)的基因時(shí)應(yīng)用cDNA文庫(kù)；在研究mRNA不存在的序列及基因組作圖時(shí)必須構(gòu)建基因組文庫(kù)。亞克隆文庫(kù)將人工染色體文庫(kù)或粘粒文庫(kù)中克隆的大片段DNA用鳥槍法〔shotgun〕隨機(jī)小片段化，然后用這些隨機(jī)小片段建立的DNA文庫(kù)二、cDNA基因文庫(kù)的類型

依據(jù)起始mRNA是否經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理：非標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)文庫(kù)功能：克隆文庫(kù)和表達(dá)文庫(kù)載體類型：質(zhì)粒、噬菌體、粘粒和人工染色體文庫(kù)根據(jù)文庫(kù)構(gòu)建過程中是否對(duì)克隆進(jìn)行過全長(zhǎng)選擇分為普通cDNA文庫(kù)和全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)依據(jù)第一鏈反轉(zhuǎn)錄引物不同分為隨機(jī)引物cDNA文庫(kù)和Oligod(T)cDNA文庫(kù)〔一〕非標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)依據(jù)起始mRNA是否經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理，可將文庫(kù)分為非標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)(unnormalizedcDNAlibrary)和標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)(normalizedcDNAlibrary);前者反映了組織中所有基因的表達(dá)水平，適于基因表達(dá)譜分析，但文庫(kù)中冗余較高，發(fā)現(xiàn)新基因效率低。后者往往經(jīng)過雜交〔均一化〕、扣除雜交(subtractivehybridization)、抑制性扣除雜交(suppressionsubtractivehybridization)處理，不能反映建庫(kù)材料的基因表達(dá)情況，不能用于表達(dá)譜構(gòu)建，但是新基因發(fā)現(xiàn)效率提高了。在研究基因功能和表達(dá)調(diào)控時(shí)，建立減法文庫(kù)是一個(gè)很好的策略。它是通過野生行DNA和缺失型DNA，或不同時(shí)空、不同環(huán)境條件下的兩種CDNA樣品反復(fù)雜交，去處雜交體后，將剩余的DNA或CDNA片段進(jìn)行克隆而構(gòu)建的文庫(kù)?！捕掣鶕?jù)文庫(kù)的功能分：克隆文庫(kù)和表達(dá)文庫(kù)〔1〕克隆文庫(kù)由克隆載體構(gòu)建，載體具有復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)及選擇標(biāo)記，可通過細(xì)菌培養(yǎng)使克隆片段大量增殖?？寺』蛑饕煤怂崽结槪捎玫鞍踪|(zhì)序列或同源序列。〔2〕表達(dá)文庫(kù)由表達(dá)載體構(gòu)建，載體除具有克隆載體的元件外，還具有控制基因表達(dá)的序列，如啟動(dòng)子、SD序列、ATG、終止子等，可在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出克隆片段的編碼序列，它可分為融合蛋白表達(dá)載體和天然蛋白表達(dá)載體。別離基因時(shí)，由于克隆片段的基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)具有抗原性和生物活性，所以除核酸探針外，還可用免疫學(xué)探針和生物功能進(jìn)行篩選。表達(dá)文庫(kù)適合于那些不知道蛋白質(zhì)的氨基酸序列、不能用核酸類探針篩選的目的基因別離?！踩巢煌d體文庫(kù)主要有質(zhì)粒、噬菌體、粘粒和人工染色體四大類，每類中由有許多不同的載體，不同的載體適于構(gòu)建不同的基因文庫(kù)。質(zhì)粒文庫(kù)噬菌體文庫(kù)粘粒文庫(kù)人工染色體文庫(kù)構(gòu)建文庫(kù)的載體1.λ噬菌體載體根底：裸露的噬菌體重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或包裝后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。載體篩選：在細(xì)菌菌苔中形成噬菌斑。重組篩選：插入載體—通過可見標(biāo)記的插入失活(cI基因的打斷阻止溶源性，產(chǎn)生的噬菌體更清澈；現(xiàn)代的載體攜帶lacZ基因，以蘭-白篩選)。置換載體—Spi-表型(對(duì)P2感染敏感性消失)是中心“填充片段〞gam和red基因座喪失引起的。供體DNA的大?。翰迦胼d體：0-10kbp;置換載體：9-23kbp。插入大小范圍被有效形成噬菌斑的野生型基因組75-105％所限制。主要應(yīng)用：插入載體:cDNA克隆和表達(dá)文庫(kù);噬菌體展示。置換載體:基因組DNA克隆。2.粘粒(cosmid)載體根底：包含λ噬菌體cos位點(diǎn)的質(zhì)粒；導(dǎo)入宿主：經(jīng)體外包裝，再轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；載體篩選：類似于質(zhì)粒重組篩選：可見標(biāo)記插入失活和小片段插入的陽性篩選；供體DNA大小：30-45kbp。插入大小范圍被有效形成噬菌斑的野生型基因組75-105％所限制。主要應(yīng)用：基因組文庫(kù)構(gòu)建。3.質(zhì)粒載體構(gòu)建cDNA文庫(kù)4.大容量克隆載體(1)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosomes,BACs,fosmids)根底：大腸桿菌F質(zhì)粒導(dǎo)入宿主：電轉(zhuǎn)化載體篩選：顯性選擇標(biāo)記重組篩選：插入片段大小供體DNA大?。?gt;300kbp主要應(yīng)用：大基因組分析評(píng)論：低頻率的重排和嵌合分子。載體在每個(gè)細(xì)胞中維持一個(gè)或兩個(gè)拷貝，產(chǎn)生少量供體DNA。(2)P1載體和P1人工染色體(P1artificialchromosomes,PACs)根底：噬菌體P1導(dǎo)入宿主：體外包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)載體篩選：顯性選擇標(biāo)記重組篩選：應(yīng)用對(duì)致死標(biāo)記的打斷進(jìn)行陽性篩選供體DNA大小：約100kbp主要應(yīng)用：大基因組分析評(píng)論：重排和嵌合分子少。載體維持低拷貝，但可以通過誘導(dǎo)噬菌體P1溶菌循環(huán)擴(kuò)增。(3)酵母人工染色體(yeastartificialchromsomes,YACs)根底：釀酒酵母中心粒、端粒和ARS導(dǎo)入宿主：轉(zhuǎn)化酵母原生質(zhì)體載體篩選：顯性篩選標(biāo)記(營(yíng)養(yǎng)缺陷型的恢復(fù))重組篩選：插入片段大小供體DNA大小：>2000kbp主要應(yīng)用：大基因組分析，YAC轉(zhuǎn)基因小鼠評(píng)論：YAC的缺點(diǎn)是高頻率的自發(fā)缺失，和克隆的嵌合化。重組載體的大小，需要電泳分析，有時(shí)難以區(qū)分內(nèi)源性染色體。YAC維持低拷貝。隨機(jī)引物cDNA文庫(kù)和Oligod(T)cDNA文庫(kù)三、幾種cDNA文庫(kù)的介紹經(jīng)典cDNA文庫(kù)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)均一化cDNA文庫(kù)差減cDNA文庫(kù)(SubtractivecDNAlibrary)全長(zhǎng)差減均一化cDNA文庫(kù)

固相cDNA文庫(kù)構(gòu)建〔一〕經(jīng)典cDNA文庫(kù)構(gòu)建的根本原理用Oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的cDNA加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫(kù)。其根本步驟包括：〔1〕RNA的提取(例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機(jī)溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定)，要構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)，獲得高質(zhì)量的mRNA是至關(guān)重要的，所以處理mRNA樣品時(shí)必須仔細(xì)小心。由于RNA酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個(gè)無RNA酶的環(huán)境對(duì)于制備優(yōu)質(zhì)RNA很重要?！?〕合成cDNA在獲得高質(zhì)量的mRNA后，用反轉(zhuǎn)錄酶Oligo(dT)引導(dǎo)下合成cDNA第1鏈，cDNA第2鏈的合成(用RNA酶H和大腸桿菌DNA聚合酶I，同時(shí)包括使用T4噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌DNA連接酶進(jìn)行的修復(fù)反響)，〔3〕合成接頭的參加、將雙鏈DNA克隆到載體中去、分析cDNA插入片斷，擴(kuò)增cDNA文庫(kù)、對(duì)建立的cDNA文庫(kù)進(jìn)行鑒定。這里強(qiáng)調(diào)的是對(duì)載體的選擇，常規(guī)用的是λ噬菌體，這是因?yàn)棣薉NA兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源DNA。高質(zhì)量mRNA的制備反轉(zhuǎn)錄生成cDNA與噬菌粒載體分子相連接噬菌粒的包裝cDNA噬菌粒文庫(kù)的主要步驟：1、高質(zhì)量mRNA的制備用試劑盒提取總RNA參加與生物素相連的寡聚(dT)引物溫育參加與微磁球相連的抗生物素蛋白用磁場(chǎng)吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強(qiáng)力微磁球相連的mRNA洗脫得到mRNA2、反轉(zhuǎn)錄生成cDNA以寡聚dT或隨機(jī)6核苷酸為引物反轉(zhuǎn)錄酶cDNA第一鏈以cDNA第一鏈為模板合成cDNA第二鏈加接頭準(zhǔn)備與載體連接為了得到有方向性的cDNA應(yīng)該接上不同的接頭參加帶有酶切位點(diǎn)的寡聚dT引物高活性的反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈合成cDNA第二鏈用RNaseH分解RNA鏈加EcoRI接頭用XhoI內(nèi)切酶切割得到雙接頭有方向性的cDNA(5'C↓TCGAG)3、與噬菌體載體分子相連接帶有接頭的cDNA噬菌粒DNA經(jīng)內(nèi)切酶切割含有cDNA插入片段的重組噬菌粒DNA4、噬菌粒的包裝含有cDNA插入片段的重組噬菌粒DNA體外蛋白質(zhì)外殼的包裝反響有侵染和復(fù)制能力的成熟噬菌體進(jìn)行基因組學(xué)的研究含有某種組織或器官的噬菌粒文庫(kù)經(jīng)典cDNA文庫(kù)優(yōu)缺點(diǎn)經(jīng)典cDNA文庫(kù)的構(gòu)建雖然高效、簡(jiǎn)便，但文庫(kù)克隆的片段一般較小，單個(gè)克隆上的DNA片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個(gè)克隆才能覆蓋一個(gè)完整的全基因的cDNA。〔二〕全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建的原理為了克隆到真正的cDNA全長(zhǎng)，建立富含全長(zhǎng)的cDNA文庫(kù)具有重要意義。為此，必須克服僅用mRNA的Poly〔A〕尾合成以及由普通逆轉(zhuǎn)錄酶作用特點(diǎn)所導(dǎo)致的局限性。全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，是指從生物體內(nèi)一套完整的mRNA分子經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而得到的DNA分子群體，是mRNA分子群的一個(gè)完整的拷貝。全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)不僅能提供完整的mRNA信息，而且可以通過基因序列比對(duì)得到mRNA剪接信息，此外，還可以對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)及進(jìn)行體外表達(dá)和通過反向遺傳學(xué)研究基因的功能等?；蛑亟M反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNAcDNA文庫(kù)的組建：反轉(zhuǎn)錄引物和反轉(zhuǎn)錄酶為了防止oligo(dT)作為cDNA第一鏈合成的引物造成的cDNA短截現(xiàn)象，人們對(duì)第一鏈引物末端的兩個(gè)堿基作了改進(jìn)(dT)nVN，其中V可以是A,C或G,N那么為A.T.C,G中的任意一種堿基，這就防止了由于mRNA內(nèi)部存在寡聚(T)而造成的cDNA對(duì)應(yīng)于mRNA的3’端出現(xiàn)的短截現(xiàn)象。傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄酶AMV和MMLV等都不能逆轉(zhuǎn)錄出很長(zhǎng)的cDNA.SuperscriptIITM(GibcoBRL)的推出，使逆轉(zhuǎn)錄出更長(zhǎng)的cDNA成為可能。(Camincieta1.,2000)研究說明一些糖類如海藻糖能有效提高反轉(zhuǎn)錄酶和其它一些酶類的活性，并能提高酶的最適反響溫度，從而為打破mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高反轉(zhuǎn)錄的效率提供了可能。5’端帽子結(jié)構(gòu)真核生物的mRNA與原核生物不同，其5’端有一個(gè)特殊的甲基化帽子結(jié)構(gòu)，5’端帽子結(jié)構(gòu)就成為人們構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，尋找突破口的主要目標(biāo)。全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法都是基于5'端帽子結(jié)構(gòu)的特殊性研究出來的。其中代表性的方法有:Oligo-capping(Suzukieta1.,1997;Marugamaeta1.,1994),CAPture法(Ederyeta1.,1995),SMARTTM法(Y.Yeta1.,2001),CAP-Trapper法(Carnincieta1.,1996),Capselect(Schmidteta1.,1999)Oligo-capping此方法又叫做寡聚核糖核酸單鏈連接法(SSLLM)(Single-StrandLinkerLigationMethod/SSLLM).1994年，Maruyama等人首先取得了突破。他們利用5’帽子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，用細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)去除無5’端mG保護(hù)的、局部降解的、不完整mRNA末端的游離磷酸基團(tuán)，再用煙草酸性磷酸酶(TAP)去除5’的mG結(jié)構(gòu)僅保存一個(gè)5'P，合成一段寡核糖核酸，用T4RNA連接酶連接到經(jīng)過處理的mRNAS’端的5'P上，然后利用修飾的oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行PCR反響，稱為oligocapping。CAPture法Ederly等(1995)報(bào)道了一種稱為CAPture的方法，據(jù)稱能夠非常有效地建立全長(zhǎng)的。DNA文庫(kù)。他們利用“帽結(jié)合蛋白〞專門結(jié)合mRNA的帽結(jié)構(gòu)，含有完整帽子結(jié)構(gòu)的mRNA被富集，逆轉(zhuǎn)錄后用RNase作用于mRNA/DNA雜合子，未被帽結(jié)合蛋白結(jié)合的‘局部降解〞的不完整mRNA，有一些雖結(jié)合了“帽結(jié)合蛋白〞但DNA并不完整的mRNA都被降解，僅完整mRNA又有全長(zhǎng)cDNA第一鏈結(jié)合保護(hù)的那些mRNA被保護(hù)，進(jìn)一步純化富集后建庫(kù)，獲得的克隆全長(zhǎng)比例很高，但每次需極其大量的mRNA(1OOug)，另外，被帽結(jié)合蛋白結(jié)合的mRNA5'端約10-50bp被喪失。所以嚴(yán)格來講所謂的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)并不是全長(zhǎng)的。

SMART法

SMART法(SwitchingMechanismat5‘EndofRNATranscriptSMART)CLONTECH公司推出的試劑盒CapFinder(現(xiàn)又命名為SMARTTM〕是利用帽子結(jié)構(gòu)特征。SMART法充分利用了反轉(zhuǎn)錄酶PowerscriptTMRT末端轉(zhuǎn)移酶活性和限制性內(nèi)切酶sfiⅠ的特性。PowerscriptTMRT是MMLU反轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)過點(diǎn)突變而得來的，它喪失了RNaseH活性，但仍然保存著野生型的聚合酶活性，并且具有較好長(zhǎng)距離反轉(zhuǎn)錄能力，另外它還具有在雙鏈核酸的3’端添加oligo(dC)的末端轉(zhuǎn)移酶活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，在合成第一鏈cDNA的oligo(dT)引物的5'端加上了Sfil(A)的識(shí)別位點(diǎn)。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄到達(dá)mRNA的5'端時(shí)，借助PowerscriptTMRT的末端轉(zhuǎn)移酶活性，可以在全長(zhǎng)的cDNA末端加上幾個(gè)(dC)，而截短的cDNA，由于反轉(zhuǎn)錄延伸沒有到達(dá)mRNA的5'端，PowerscriptTMRT不能以它為底物在截短的cDNA末端加上oligo(dC)，所以在合成第二鏈時(shí)，帶有sfiⅠ(B)的oligo(dG)引物不能與它結(jié)合，不能合成第二鏈，因此，理論上所得到的dsDNA都是全長(zhǎng)cDNA。全長(zhǎng)dscDNA在經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sfil切割，由于兩端的粘性末端不同，所以可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的定向克隆。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于不存在對(duì)mRNA進(jìn)行處理的酶促反響，不僅操作簡(jiǎn)單，而且一定程度上提供了全長(zhǎng)cDNA合成的可能性。但是，該方法也存在以下缺乏:a.理論上，只有當(dāng)反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA到達(dá)模板mRNA的5'末端帽子結(jié)構(gòu)時(shí)，末端轉(zhuǎn)移酶活性才能發(fā)生，但實(shí)際上，在反轉(zhuǎn)錄并未到達(dá)帽子結(jié)構(gòu)就終止的第一鏈cDNA的末端，反轉(zhuǎn)錄酶末端轉(zhuǎn)移酶的活性照樣表達(dá)，因此，文庫(kù)中會(huì)有一定數(shù)量的非全長(zhǎng)克隆，不利于以后的分析研究。b.末端轉(zhuǎn)移酶活性低，加dC量小，從而導(dǎo)致在CapSwitch這一步中，寡核昔酸作為模板的效率不高，導(dǎo)致克隆的喪失。CAP-Trapper法CAP-Trapper法該方法首先由Carninci(1996)等報(bào)道。CAP-Trapper法合成全長(zhǎng)的原理是:依據(jù)mRNA的5’端和3’端存在的二醇結(jié)構(gòu)來開展工作。首先將二醇結(jié)構(gòu)進(jìn)行氧化，在進(jìn)行生物素修飾之后經(jīng)過沉淀、酒精洗滌、無RNase的滅菌水重新懸浮等篩選步驟，得到生物素化的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，接著進(jìn)行RNase1處理，未被cDNA保護(hù)的mRNA(包括非全長(zhǎng)cDNA與RNA雜交體中暴露的mRNA5'端及所有的未被cDNA保護(hù)的mRNA)即被降解。經(jīng)鏈青霉素磁珠吸附并使用弱堿降解mRNA，如此得到單鏈cDNA，在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下進(jìn)行5’端Oligod(G)加尾，之后再進(jìn)行第二鏈的合成，連接載體即可得到全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。這種方法后來又進(jìn)行了許多改進(jìn)。Capselect法Capselect法防止了模板轉(zhuǎn)移的要求，開發(fā)了SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶在錳離子存在下具有很高的末端轉(zhuǎn)移酶活性，然后利用此活性和rATP將一段controlled核昔酸尾巴連接到第一鏈cDNA末端，然后通過T4連接酶將adaptor連接上，起始第二鏈的合成，從而進(jìn)行以后的步驟進(jìn)行建庫(kù)。優(yōu)點(diǎn):a由于開發(fā)了末端轉(zhuǎn)移酶的活性，使加dC的數(shù)目增加，同時(shí)又防止了模板轉(zhuǎn)移的要求，所以效率大大增加。b.需要的起始材料很少。c.處理mRNA的過程較少，這在一定程度上減少了mRNA降解的風(fēng)險(xiǎn)。d.簡(jiǎn)單，易行。缺點(diǎn):無法剔除cDNA混合樣中非全長(zhǎng)cDNA。

〔三〕均一化cDNA文庫(kù)它是指某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中，且在cDNA文庫(kù)中表達(dá)基因?qū)?yīng)的cDNA的拷貝數(shù)相等或接近。優(yōu)點(diǎn)均一化cDNA文庫(kù)具有以下4方面的優(yōu)點(diǎn)：第一，在經(jīng)濟(jì)上具有廣泛的應(yīng)用空間，可以節(jié)約大量試驗(yàn)本錢。第二，增加克隆低豐度mRNA的時(shí)機(jī)，適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達(dá)及突變檢測(cè)。第三，與原始豐度的mRNA拷貝數(shù)相對(duì)應(yīng)的cDNA探針與均一化的cDNA文庫(kù)作雜交，可以估計(jì)出大多數(shù)基因的表達(dá)水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫(kù)構(gòu)建，忽略了mRNA豐度的影響。第四，可以用于遺傳圖譜的制作和進(jìn)行大規(guī)模的原位雜交，作為優(yōu)化的文庫(kù)系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測(cè)序或芯片制作等研究?！菜摹巢顪pcDNA文庫(kù)(SubtractivecDNAlibrary)差減文庫(kù)也稱扣除文庫(kù)，使用兩種遺傳背景相同或大致相同但在個(gè)別功能或特性上不同的材料(如不同處理細(xì)胞系或植物的近等基因系等)提取mRNA(或反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA)，在一定條件下用大大過量不含目的基因的一方作為驅(qū)動(dòng)子(Driver)與含有目的基因的試驗(yàn)方(Tester)進(jìn)行雜交，選擇性的去除兩局部共同基因雜交形成的復(fù)合物，往往進(jìn)行屢次的雜交—去除過程，最后將含有相關(guān)目的基因的未雜交局部收集后，并連接到載體形成文庫(kù)。方法提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組mRNA合成雙鏈cDNA，經(jīng)識(shí)別4堿基的限制性內(nèi)切酶切割實(shí)驗(yàn)組cDNA平均分為2份，分別連接2個(gè)接頭進(jìn)行2輪差減雜交和抑制性PCR獲得富集的目的基因2.抑制性差減雜交(SSH)抑制性差減雜交(SSH)流程圖檢測(cè)組(Tester)—含目的基因cDNA，加接頭驅(qū)逐組(Driver)—不含目的基因cDNA，不加接頭

*接頭含PCR引物正向SSH:易感者(Tester)+不易感者(Driver)

易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因反向SSH:不易感者(Tester)+易感者(Driver)

不易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因

2.抑制性差減雜交(SSH)

評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)采用兩次差減雜交和兩次PCR，保證了高特異性(假陽性率可降至6％);在雜交過程中可使不同豐度基因均衡化，從而獲得低豐度差異表達(dá)基因;操作相對(duì)簡(jiǎn)便，是目前別離新基因的主要方法缺點(diǎn)起始材料需要g級(jí)量mRNA;SSH差減克隆片段較小，獲取cDNA全長(zhǎng)序列有一定難度2.抑制性差減雜交(SSH)SSH應(yīng)用HighWire/Abstract/Title:SuppressionSubtractiveHybridization，SSH〔截止2004年9月20日〕671篇1996.01.01—12.311篇1997.01.01—12.318篇1998.01.01—12.3123篇1999.01.01—12.3148篇2000.01.01—12.3165篇2001.01.01—12.31120篇2002.01.01—12.31126篇2003.01.01—12.31156篇2004.01.01—09.20117篇2005?篇合計(jì)?篇2.抑制性差減雜交(SSH)〔五〕全長(zhǎng)差減均一化cDNA文庫(kù)全長(zhǎng)均一化/差減cDNA文庫(kù)(mRNAnomalizationandsubtractionoffull-lengthcDNAlibrary)最早由Carninci(2000)等人提出的，整個(gè)文庫(kù)構(gòu)建過程可分為三個(gè)步驟:第一步，全長(zhǎng)cDNA的獲得。這一階段的方法與cap-trapper法相同。第二步，均一化/差減雜交。用上步得到的全長(zhǎng)單鏈cDNA作為tester與用生物素標(biāo)記的過量的drivermRNA雜交，用磁珠別離法將高表達(dá)的cDNA除去，最終得到稀有表達(dá)的單鏈cDNA(sscDNA)。第三步，第二鏈的合成和文庫(kù)構(gòu)建(方法同cap-trpper法)。以第一鏈為模板，合成dscDNA，然后經(jīng)酶切，連接，包裝，轉(zhuǎn)染，得到全長(zhǎng)差減的一化處理的cDNA文庫(kù)。Carninci(2000)等用這種方法構(gòu)建了多個(gè)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，全長(zhǎng)基因的比例到達(dá)了95%以上。CarninciP,ShibataY,HayastuN,etal.Normalizationandsubtractionofcap-trapper-selectedcDNAstopreparefull-lengthcDNAlibrariesforrapiddiscoveryofnewgenes[J].GenomeResearch,2000，10:1617-1630.〔六〕固相cDNA文庫(kù)構(gòu)建固相cDNA合成法的主要優(yōu)點(diǎn)是可以簡(jiǎn)便cDNA合成的操作。在進(jìn)行緩沖液更換時(shí)既沒有cDNA的喪失之憂，也無其它物質(zhì)污染之憂。另外，用此方法可以得到真實(shí)的代表性文庫(kù)，它包含有短小的cDNA，這是因?yàn)樵诳寺≈笆∪チ朔旨?jí)別離的步驟?？傊?，固相法結(jié)合了傳統(tǒng)的cDNA合成的優(yōu)點(diǎn)并彌補(bǔ)了其缺乏。這種方法簡(jiǎn)便易行，可靠低廉，所建文庫(kù)高質(zhì)量，因此它可能會(huì)替代目前應(yīng)用的cDNA文庫(kù)操作方法。SwitchingMechanismAt5‘endoftheRNATranscript原理：在合成cDNA的反響中事先參加的3'末端帶Oligo〔dG〕的SMART引物，由于逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達(dá)mRNA的5'末端時(shí)碰到真核mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)〞，即甲基化的G時(shí)會(huì)連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個(gè)〔dC〕，SMART引物的Oligo〔dG〕與合成cDNA末端突出的幾個(gè)C配對(duì)后形成cDNA的延伸模板，逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo〔dT〕的起始引物序列，另一端有的SMART引物序列，合成第二鏈后可以利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。由于有5'帽子結(jié)構(gòu)的mRNA才能利用這個(gè)反響得到能擴(kuò)增的cDNA，因此擴(kuò)增得到的cDNA就是全長(zhǎng)cDNA。這個(gè)專利的方法是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端轉(zhuǎn)移酶活性，利用酶的天然屬性，經(jīng)巧妙設(shè)計(jì)而成為，研究只要單管，一步即可完成，不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀，或者額外的酶反響，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的TotalRNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA庫(kù)，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應(yīng)用于直接擴(kuò)增基因、構(gòu)建cDNA文庫(kù)、序列釣全長(zhǎng)cDNA〔RACE〕，和用于芯片檢測(cè)的cDNA探針的擴(kuò)增等。SMARTcDNASynthesisSMARTλTrip1Ex2Ligation〔一〕、SMARTcDNA文庫(kù)構(gòu)建一般程序總RNA的提取LD-PCR合成cDNA蛋白酶K酶切Sfi1酶切CHROMASPIN-400Columns層析柱分級(jí)別離cDNASfi1酶切的cDNA片段與λTrip1Ex2載體連接cDNA文庫(kù)構(gòu)建一般程序包裝反響未擴(kuò)增文庫(kù)滴度的鑒定未擴(kuò)增文庫(kù)重組率的測(cè)定cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增擴(kuò)增cDNA文庫(kù)滴度、庫(kù)容量及重組率的鑒定基因文庫(kù)的保存和利用：SMARTcDNALibraryConstructionKit1、總RNA的提取與純化

1d2d3d4d5d6d7d

←28S←18S28S→18S→

2、cDNA

第一鏈的合成

取500μl的離心管，依次參加以下反響成分：總RNA1.0μlSMARTIVTMOligonucleotide1.0μlCSDIII/3′PCRPrimer1.0μlDeionizedH2o(Milli-Q-filtered)2.0μlTotalvolume5.0μl混合均勻，輕微低速離心，72℃恒溫水浴2min；迅速冰浴2min；混合均勻，輕微低速離心，依次參加以下反響成分：5ХFirst-StrandBuffer2.0μlDTT1.0μldNTPMix1.0μlPowerScriptTMReverseTranscriptase1.0μlTotalvolume5.0μl混合均勻，輕微低速離心，42℃恒溫水浴1hr〔如果使用水浴或熱循環(huán)溫浴，應(yīng)參加一滴礦物油，防止水分蒸發(fā)，引起體積減少〕；迅速置于冰上終止第一鏈cDNA的合成反響。如果第一鏈cDNA混合物不立即進(jìn)行PCR反響，那么應(yīng)立即放在-20℃貯藏〔可以貯藏3個(gè)月〕。①、95℃預(yù)熱PCR儀；②、RelationshipbetweenamountofRNAstartmaterialandoptimalnumberofthermalcyclesTotalRNA(μgPolyA+RNA(μgNumberofCycles18-2020-2222-2424-263、LD-PCR合成

cDNA第二鏈③取500μl的離心管，依次參加以下反響成分：2μlFirst-StrandcDNA80μlDeionizedH2o10μl10хAdvantage2PCRBuffer2μl50хdNTPMix2μl5′PCRPrimer2μlCSDIII/3′PCRPrimer2μl50хAdvantage2PolymeraseMix100μlTotalVolume④、混合均勻反響成分，輕微低速離心，如果需要注意加礦物油。⑤、PCR擴(kuò)贈(zèng)反響程序：95℃預(yù)變性1min，95℃15sec，68℃6min,22個(gè)循環(huán)。⑥、反響結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物在1.1℅瓊脂糖凝膠上電泳，加0.1μg1-KbDNASizeMarkers,EB染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。⑦、把dscDNA貯藏于-20℃的條件下。3000bp→2000bp→1500bp→1200bp→1030bp→900bp→800bp→700bp→600bp→500bp→LD-PCR合成dscDNA1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果1.DNAMarkers;2.dscDNA4、蛋白酶K酶切①、取500μl離心管參加50μldscDNA〔2~3μg〕；②、參加2μl蛋白酶K〔20μg/μl〕剩余的dscDNA貯藏于-20℃的條件下，蛋白酶K抑制DNA聚合酶的活性；③、混勻離心，42℃溫育20min，簡(jiǎn)單離心；④、參加50μlDeionizedH2o到離心管中；⑤、參加100μl酚：氯仿：異戊醇，輕微倒轉(zhuǎn)1~2min；⑥、4℃，14000rpm,離心5min；⑦、取上清液至500μl離心管，棄下層溶液；⑧、加10μlSodiumAcetate(3M;Ph4.8)，1.3μlGlycogen(20μg/μl)；⑨、參加260μl室溫95℅乙醇，立即室溫條件下14000rpm離心20min；〔注意在離心前不要把離心管放在-20℃或冰浴〕⑩、小心去掉上清液，用100μl80℅乙醇洗滌沉淀；加79μlDeionizedH2O重新溶解沉淀。5、Sfi1酶切①、取500μl的離心管，依次參加以下反響成分：79μlcDNA10μl10хSfi1Buffer10μlSfi1Enzyme(20units/μl)1μl100ХBSA100μlTotalVolume②、混勻，參加2μl二甲基苯腈藍(lán)染料，混勻；6、CHROMASPIN-400Columns層析柱分級(jí)別離cDNA①、取16支1.5ml離心管按順序作好標(biāo)記；②、取出CHROMASPIN-400Columns，顛倒柱子幾次使凝膠基質(zhì)重懸；③、用1000μl移液器輕輕地重懸凝膠基質(zhì)，防止產(chǎn)生氣泡，然后去掉凝膠柱底部的蓋子，使凝膠緩沖液自然流盡〔3min后，如果柱中的緩沖液不能排盡，重新蓋尚頂部的蓋子，固定好柱子〕；④、調(diào)整好流速為1滴/40~60sec，1滴的體積大約為40μl，如果流速太慢因該重新重懸基質(zhì)，并且重復(fù)上述的滴定程序，到達(dá)上述參數(shù)為止；⑤、當(dāng)柱子中的貯藏緩沖液滴盡為止，輕輕地沿柱子頂部的內(nèi)壁加700μl柱緩沖液直到緩沖液滴盡為止；⑥、當(dāng)停止滴定15~20min后，把100μlcDNASfi1酶切液和二甲基苯腈藍(lán)混合液參加到層析柱中，進(jìn)行分級(jí)別離〔樣品要充分被基質(zhì)吸附〕，用100μl的層析柱緩沖液來洗含有cDNA片段的層析柱，使液滴流盡為止；⑦、然后取標(biāo)記好的離心管，放在層析柱下，加600μl層析柱緩沖液，開始收集液滴，大約每管35μl，直到16支管收完為止；⑧、檢測(cè)分級(jí)別離效果，從每個(gè)管中取3μl收集液，在1.1℅瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)所收集的cDNA片段范圍，以確定所需的收集液；⑨、把所需dscDNA大于0.5Kb以上的8~12號(hào)管收集液倒在一起，然后加1/10體積的SodiumAcetate(3M;Ph4.8)，1.3μlGlycogen(20μg/μl)，2.5倍體積95℅乙醇〔-20℃〕，充分混勻，前后倒置搖動(dòng)。⑩、然后放在-40℃沉淀過夜；室溫，14000rpm離心20min；去掉上清液，室溫枯燥沉淀10min；用7μlDeionizedH2o溶解沉淀，經(jīng)Sfi1酶切的cDNA片段便可以用來進(jìn)行連接反響。7、Sfi1酶切的cDNA片段與λTrip1Ex2載體連接8、包裝反響①、取50μl包裝提取物〔EpicentrecomponyMaxplaxTMPackagingExtract〕室溫融化；②、取出25μl參加含5μl連接產(chǎn)物的1.5ml離心管中，剩余暫放于-70℃冰箱；③、輕輕混勻，防止產(chǎn)生氣泡，輕微離心，使溶液收集于管低；④、30℃水浴，90min；⑤、反響結(jié)束后，再參加25μl包裝提取物，在30℃水浴，90min⑥、包裝反響結(jié)束后，加600μlphagedilutionbuffer，輕輕混勻離心；⑦、加25μl氯仿，輕輕混勻離心，放4℃貯藏〔可以放2周〕；⑧、共獲得680μl未擴(kuò)增文庫(kù)。9、未擴(kuò)增文庫(kù)滴度的鑒定①、制備90mmLB/MgSO4/Tet固體平板6個(gè)，37℃預(yù)熱和枯燥1hr；②、取40μl未擴(kuò)增文庫(kù)參加360μl1хLambdadilutionbuffer〔1：10稀釋〕；③、分別取上述稀釋后文庫(kù)1μl、10μl的包裝混合物同200μl過夜培養(yǎng)的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包裝后的噬菌體吸附細(xì)菌20min；④、反響結(jié)束后，加3ml融化的LB/MgSO4頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入LB平板上鋪平，室溫冷卻10min讓底層LB平板鞏固；⑤、倒置平板，37℃過夜培養(yǎng)15hr，計(jì)算噬菌斑數(shù)目。⑥、稀釋后文庫(kù)1μl平均噬菌斑數(shù)目為29個(gè)，10μl平均噬菌斑數(shù)目310個(gè)；未擴(kuò)增文庫(kù)的滴度〔pfu/ml〕=(2.9+3.1)х10х1000μl/ml2х1μl=3.0х105pfu/ml原始cDNA文庫(kù)滴度和重組率的鑒定插入cDNA片段大小分析

M1234567891011

M1213141516171819202122圖4-4重組質(zhì)粒DNA的SfiI酶切電泳結(jié)果M：DNAMarkers;1-22:重組質(zhì)粒2000bp→1500bp1000bp700bp400bp200bp123456789101112131415161718

圖2-4重組質(zhì)粒的PCR檢測(cè)電泳結(jié)果泳道9：DNAMarkers;泳道1-8,泳道10-18:重組質(zhì)粒

未擴(kuò)增文庫(kù)重組率的測(cè)定

①、制備100mmLB/MgSO4/Tet固體平板2個(gè)，37℃預(yù)熱和枯燥1hr；②、取40μl未擴(kuò)增文庫(kù)參加360μl1хLambdadilutionbuffer〔1：10稀釋〕；③、取上述稀釋后文庫(kù)100μl的包裝混合物參加200μl過夜培養(yǎng)的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包裝后的噬菌體吸附細(xì)菌20min；④、反響結(jié)束后分別參加50μlIPTG〔100mM〕、50μlX-Gal〔100mM〕混勻后加3ml融化的LB/MgSO4頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入LB平板上鋪平，室溫冷卻10min讓底層LB平板鞏固；⑤、倒置平板，37℃過夜培養(yǎng)15hr，計(jì)算藍(lán)、白斑噬菌斑數(shù)目；⑥、兩個(gè)LB平板的藍(lán)、白斑分別為4個(gè)藍(lán)斑、720個(gè)白斑；31個(gè)藍(lán)斑、379個(gè)白斑；未擴(kuò)增文庫(kù)的重組率=1099(白斑)1134(總噬菌斑)=96.9%cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增

①、制備15個(gè)150mmLB/MgSO4/Tet固體平板；②、挑一個(gè)別離良好的XL1–Blue單菌落接種到15mlLB/MgSO4/Maltose液體培養(yǎng)基上，140rpm，37℃培養(yǎng)過夜直至OD600=2.0，在4℃，5000rpm離心5min，用7.5mlMgSO4〔10mM〕重懸沉淀菌液；③、取未擴(kuò)增文庫(kù)38μl的包裝混合物參加500μl過夜培養(yǎng)的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包裝后的噬菌體吸附細(xì)菌20min；④、反響結(jié)束后，加5ml融化的LB/MgSO4頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入LB平板上鋪平，室溫冷卻10min讓底層LB平板鞏固；倒置平板，37℃過夜培養(yǎng)15hr，直至噬菌斑相互接觸；⑤、每一平板加12ml1хLambdadilutionbuffer，在4℃過夜培養(yǎng)；室溫下50rpm振蕩培養(yǎng)1hr；⑥、收集噬菌體裂解液于500ml燒杯中，參加10ml氯仿溶液，旋渦振蕩2min，7000rpm，離心5rpm；收集上清液，此時(shí)獲得一個(gè)擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)。擴(kuò)增cDNA文庫(kù)滴度、庫(kù)容量及重組率的鑒定①、制備100mmLB/MgSO4/Tet固體平板1個(gè)，37℃預(yù)熱和枯燥1hr；②、取10μl擴(kuò)增cDNA文庫(kù)參加990μl1хLambdadilutionbuffer〔1：100稀釋〕；③、取10μl上述稀釋后的擴(kuò)增cDNA文庫(kù)參加200μl過夜培養(yǎng)的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包裝后的噬菌體吸附細(xì)菌20min；④、反響結(jié)束后分別參加50μlIPTG〔100mM〕、50μlX-Gal〔100mM〕混勻后加3ml融化的LB/MgSO4頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入LB平板上鋪平，室溫冷卻10min讓底層LB平板鞏固；⑤、倒置平板，37℃過夜培養(yǎng)15hr，計(jì)算藍(lán)、白斑噬菌斑數(shù)目；⑥、擴(kuò)增cDNA文庫(kù)的滴度〔pfu/ml〕=196х100х1000μl/ml10μl=1.96х106pfu/mlcDNA文庫(kù)擴(kuò)增后的總體積為160ml，因此，擴(kuò)增cDNA文庫(kù)的容量為3.136х108pfu；擴(kuò)增文庫(kù)的重組率=1848(白斑)1900(總噬菌斑)=97.3%⑦、擴(kuò)增cDNA文庫(kù)的長(zhǎng)期保存：把擴(kuò)增cDNA文庫(kù)分裝成每份1ml，參加DMSO終濃度為7%，放-70℃長(zhǎng)期保存。重組質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

重組質(zhì)粒DNA的SfiI酶切電泳結(jié)果

〔二〕cDNA文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)代表性序列完整性其他cDNA文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)文庫(kù)的代表性cDNA文庫(kù)的代表性是指文庫(kù)中包含的重組cDNA是否能完整地反映出來源細(xì)胞中表達(dá)的全部信息〔即mRNA種類〕，它是表達(dá)文庫(kù)質(zhì)量的最重要指標(biāo)。文庫(kù)的代表性好壞可用一個(gè)量化的指標(biāo)來衡量，即文庫(kù)的庫(kù)容量，它是指構(gòu)建的原始cDNA文庫(kù)中所包含的獨(dú)立的重組子克隆數(shù)。具備完好代表性的cDNA文庫(kù)所需的庫(kù)容量取決于來源細(xì)胞中表達(dá)的基因的總復(fù)雜度，具體來講就是來源細(xì)胞中的mRNA種類和每種mRNA序列的拷貝數(shù)滿足實(shí)驗(yàn)最低要求的cDNA文庫(kù)的庫(kù)容量可用以下公式：N=ln(1-p)/ln(1-n/T)其中P為文庫(kù)中包含細(xì)胞中任何一種mRNA序列信息的概率，通常設(shè)為99%；N為文庫(kù)中以概率P出現(xiàn)細(xì)胞中任何一種mRNA序列理論上應(yīng)具有的最少重組子克隆數(shù)；n為細(xì)胞中最稀少的mRNA序列的拷貝數(shù)；T為細(xì)胞中表達(dá)出的所有mRNA的總拷貝數(shù)。以人類細(xì)胞為例，人類基因組攜帶的遺傳基因總數(shù)約為3-4萬個(gè)，而某一特定類型的細(xì)胞中，表達(dá)出的基因種類僅占基因組全部基因的15%。因此，對(duì)于絕大局部的人類細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)具體表達(dá)的mRNA種類約為15000種，全體mRNA序列的總拷貝數(shù)約為5000000個(gè)，而細(xì)胞中最稀有的mRNA種類的拷貝數(shù)平均為8個(gè)。因此，用人類細(xì)胞來構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)，要以99%的概率保證文庫(kù)中包含有細(xì)胞表達(dá)出的任何一種mRNA的序列信息，構(gòu)建出的原始cDNA文庫(kù)理論上應(yīng)具有的最少獨(dú)立克隆數(shù)為2.9×105。但在實(shí)際工作中，由于在cDNA文庫(kù)構(gòu)建過程中存在多種操作誤差和系統(tǒng)誤差，一個(gè)具有完好代表性的cDNA文庫(kù)至少應(yīng)具有106以上的庫(kù)容量。2、重組cDNA片段的序列完整性構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中，重組cDNA片段的序列完整性也是反映文庫(kù)質(zhì)量的一個(gè)重要因素。在細(xì)胞中表達(dá)出的各種mRNA盡管具體的序列不同，但根本上都是由三個(gè)局部組成，即5’端非翻譯區(qū)〔5’UTR〕、中間的編碼序列和3’端非翻譯區(qū)〔3’UTR〕。非翻譯區(qū)的序列特征對(duì)基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。編碼序列那么是合成基因產(chǎn)物—蛋白質(zhì)的模板。對(duì)于大多數(shù)真核基因，其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上都具有相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，存在于同一分子上的結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ磉_(dá)出蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞中所行使的生物學(xué)功能是必需的。這些結(jié)構(gòu)域在基因的編碼區(qū)上也有對(duì)應(yīng)的編碼序列。因此，要從文庫(kù)中別離獲得的目的基因完整的序列信息和功能信息，要求文庫(kù)中的重組cDNA片段應(yīng)盡可能完整地反映出原始基因的結(jié)構(gòu)?；诖耍壳安簧傺芯空咴跇?gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)，都十分注重全長(zhǎng)cDNA克隆的重要性。但在實(shí)際研究中，cDNA文庫(kù)中重組的cDNA片段是否為全長(zhǎng)，對(duì)文庫(kù)使用價(jià)值的影響并不是絕對(duì)的，如大多數(shù)真核mRNA的5’端非翻譯區(qū)都含有與編碼區(qū)處于同一閱讀框的終止密碼子，這些序列的存在會(huì)嚴(yán)重影響克隆的全長(zhǎng)cDNA序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，從而在目的基因的別離鑒定中，限制了一些極有價(jià)值的篩選方法的使用。此外，一些較長(zhǎng)序列的基因，其全長(zhǎng)cDNA片段可能會(huì)超出克隆載體的裝載容量，影響得組子在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，這局部克隆在文庫(kù)擴(kuò)增過程中很容易喪失，從而影響文庫(kù)的代表性。因此，在實(shí)際工作中，如何使用文庫(kù)中cDNA序列完整性這一指標(biāo)，應(yīng)按研究者自己的研究目的及具體采用的篩選方法來錄活考慮，并無固定的模式。在細(xì)胞中表達(dá)出的各種mRNA片段的序列完整性。在細(xì)胞中表達(dá)出的各種mRNA盡管具體序列不同，但根本上都是由3局部組成，即5'端非翻譯區(qū)，中間的編碼區(qū)和3'端非翻譯區(qū)。非翻譯區(qū)的序列特征對(duì)基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用，編碼序列那么是合成基因產(chǎn)物—蛋白質(zhì)模板。因此，要從文庫(kù)中別離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫(kù)中的重組cDNA片段足夠長(zhǎng)以便盡可能地反響出天然基因的結(jié)構(gòu)。5'端：如果有同源全長(zhǎng)基因的比較，可以通過與其它生物的對(duì)應(yīng)基因5'末端進(jìn)行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，那么首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第1個(gè)ATG上游有無同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，一般加在5'帽結(jié)構(gòu)后有一段富含嘧啶的區(qū)域，或者是cDNA5'序列與基因組序列中經(jīng)過酶切保護(hù)的局部相同，那么可以確定得到的cDNA的5'端是完整的。3'端：同樣可以用其它生物的對(duì)應(yīng)基因3'末端進(jìn)行比較來判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個(gè)以上的PolyA加尾信號(hào)，或無明顯加尾信號(hào)的那么也有PolyA尾。其它標(biāo)準(zhǔn)基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)具備以下條件：

重組克隆的總數(shù)不宜過大

以減輕篩選工作的壓力

載體的裝