P2-7抗生素類藥物的分析

主講教師孫清榮教學目標知識目標：抗生素類藥物的分類；鑒別試驗；高分子雜質(zhì)的檢查；含量測定。技能目標：掌握β-內(nèi)酰胺類抗生素的化學結構特點，特殊雜質(zhì)的檢查和HPLC法；掌握氨基糖甙類藥物的鑒別和HPLC-蒸發(fā)光散射測定法；熟悉慶大霉素C組分測定的HPLC法；熟悉四環(huán)素類藥物的結構與性質(zhì)；熟悉抗生素類藥物中高分子雜質(zhì)的檢查方法。什么是抗生素一、

抗生素藥物的特點（一）定義抗生素（antibiotics）─在低微濃度下即可對某些生物的生命活動有特異抑制作用的化學物質(zhì)的總稱。（二）抗生素的來源1、生物合成（發(fā)酵）：生物包括微生物（真菌、放線菌、細菌等）、植物、動物。2、化學合成或半合成（三）抗生素質(zhì)量的復雜性同系物多；異構體多；降解物多生產(chǎn)工藝復雜，發(fā)酵過程不易控制分子結構大多不穩(wěn)定，降解后療效下降、失效或增加毒副作用化學純度低活性成分易發(fā)生變異產(chǎn)品穩(wěn)定性差二、抗生素藥物的質(zhì)量分析抗生素藥物的質(zhì)量控制方法與一般化學藥品一樣，通過鑒別、檢查、含量（效價）測定三個主要方面來判斷其質(zhì)量的優(yōu)劣。（一）鑒別實驗（理化方法）1．官能團的顯色反應2．光譜法3．色譜法4．生物學法（抑菌能力）（二）檢查1．影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的指標2．控制有機和無機雜質(zhì)的指標3．與臨床安全性密切相關的指標4．其他指標（三）含量測定或效價測定1．微生物檢定法─以抗生素對微生物的殺傷或抑制程度為指標來衡量抗生素效價（potency）的一種方法。其測定方法有稀釋法、比濁法、管碟瓊脂擴散法優(yōu)點1、與臨床效果一致2、靈敏度高3、干擾物質(zhì)少缺點1、操作繁瑣2、培養(yǎng)時間長2、測定誤差大微生物檢定法2．理化方法根據(jù)抗生素的分子結構特點，利用其特有的化學或物理化學及反應而進行的。優(yōu)點1、準確度高2、簡單、快速1、不一定代表生物效價缺點2、易受雜質(zhì)干擾3、抗生素活性表示方法抗生素的活性以效價單位表示，即指每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。用單位（u）表示或微克（μg）表示。三、抗生素的分類（按結構與性質(zhì)）β–內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、多烯大環(huán)類、多肽類

苯烴胺類、蒽環(huán)類?-內(nèi)酰胺類抗生素本類抗生素包括青霉素族和頭孢霉素族，它們的分子結構中均含有?-內(nèi)酰胺環(huán)，因此統(tǒng)稱為?-內(nèi)酰胺類抗生素。（一）青霉素類青霉素（青霉素G、芐青霉素）阿莫西林（羥氨芐青霉素）普魯卡因青霉素（二）頭孢菌素類母核（7-氨基頭孢菌烷酸）頭孢氨芐頭孢拉啶頭孢羥氨芐一、化學性質(zhì)（一）羧基：酸性1、與堿金屬(Na+、K+)成鹽，易溶于水2、與有機堿（普魯卡因）成鹽普魯卡因青霉素（二）手性C：旋光性1、青霉素類C3C5C62、頭孢菌素類C6C7（5%頭孢唑啉鈉溶液

–18～–24°）（三）共軛體系：UV吸收特性1、青霉素類母核無明顯UV

多數(shù)有苯環(huán)取代基2、頭孢菌素類母核有共軛體系（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)：不穩(wěn)定性不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大酰胺鍵易水解干燥純凈穩(wěn)定水溶液不穩(wěn)定（某些金屬離子）（溫度）某些氧化劑失效降解青霉素類酸、堿、青霉素酶????????青霉素的降解反應內(nèi)酰胺酶-b失效降解頭孢菌素類酸、堿、胺類???????β例：頭孢噻吩鈉水溶液25℃24h失活8%二、鑒別反應（一）呈色反應1、羥肟酸鐵反應:β-內(nèi)酰胺類NaOH呈色Fe3+/3H+羥肟酸衍生物???????-b·2HClNOHH內(nèi)酰胺類2、類似肽鍵的反應（1）茚三酮反應:

α-氨基△藍紫色氨基茚三酮?????-α（2）雙縮脲反應:

β-內(nèi)酰胺類似肽鍵（開環(huán)分解）紫紅色內(nèi)酰胺類堿性酒石酸銅???????-b3、其他呈色反應（1）與重氮苯磺酸反應:酚羥基（偶合）橙黃色重氮苯磺酸???????-56OHHC例：頭孢哌酮（2）與變色酸-硫酸反應:

青霉素

阿莫西林氨芐西林活潑“-CH2-”△（分解）變色酸顯色HCHOCHSOH?????--422”羰基側鏈含“150℃（縮合）??????????42變色酸阿莫西林HCHOSOH色褐NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH（3）與H2SO4-HNO3反應：頭孢菌素類亮黃紅棕黃色頭孢噻肟鈉頭孢噻吩鈉頭孢氨芐???????3-42HNOSOH（4）與銅鹽反應頭孢氨芐→HAc

→堿性硫酸銅→橄欖綠色（專屬反應）二、鑒別（二）各種鹽的反應1、K+、Na+的火焰反應焰色→鮮黃色

+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+焰色→紫色

+0.1%四苯硼鈉+Ac→↓白

K+2、重氮化-偶合反應：芳伯氨基重氮化-偶合反應青霉素普魯卡因普魯卡因青霉素+????+H紅ˉ3、遇酸→↓白青霉素青霉素鈉青霉素鉀ˉ????+H在過量HCl或有機溶劑中溶解（三）光譜法1、IR法117501800-=cm~VOC115251680-=cm、VOCNHV=13300-cmCOOHV-114101600-cm、β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺羧基2、UV法：樣品、分解產(chǎn)物A,Emin,max,,%cm11λ光譜圖λ頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉A280nm/A264nm=1.30～1.50苯唑青霉烯酸苯唑西林鈉????+HnmA339?氯唑青霉素3410.682雙氯青霉素3420.653苯唑青霉素3391.328(nm)（四）色譜法對照品對照法1、TLC法和斑點顏色比較供試品對照品相同條件fR?????2、HPLC法Rt比較供試品對照品相同條件?????三、特殊雜質(zhì)的檢查本類抗生素的特殊雜質(zhì)主要有高分子聚合物、有關物質(zhì)、異構體等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用測定雜質(zhì)的吸收度來控制雜質(zhì)量的。（一）聚合物中國藥典對頭孢他啶、頭孢哌酮鈉、頭孢噻肟鈉等規(guī)定了各自聚合物的檢查。（二）有關物質(zhì)和異構體通常采用色譜法（HPLC、反相TLC法等）檢查β-內(nèi)酰胺類抗生素中的有關物質(zhì)和異構體。（三）吸收度藥典常采用測定雜質(zhì)吸收度的方法來控制本類抗生素的雜質(zhì)含量。例如：將青霉素鈉（鉀）配成1.80mg/ml的溶液，在280nm處的A≦0.10（控制雜質(zhì)量）；264nm處的A為0.80～0.88（檢查藥物量）。四、含量測定本類藥物多采用理化測定方法進行含量測定，Chp收載的主要方法有：碘量法、電位配位滴定法、可見–紫外分光光度法、HPLC法等。（一）碘量法1、原理β-內(nèi)酰胺類反應分兩步進行：（1）水解反應(按化學計算量進行)（2）氧化-還原反應(無固定的量關系，受溫度、PH值和時間等因素影響，應嚴格控制反應條件并采用標準品平行對照測定)2、方法V樣空V樣對照液+緩沖液+碘液+回滴+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴V對空V對供試液+緩沖液+碘液+回滴+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴空白試驗以未經(jīng)水解的樣品作空白測定A、消除樣品已降解產(chǎn)物的干擾B、消除樣品中其他消耗碘的雜質(zhì)的干擾C、消除碘揮發(fā)造成的誤差采用標準品平行對照測定：A、可消除溫度、pH、操作、環(huán)境等條件的影響B(tài)、使本法測定結果與微生物檢定法一致3、條件（1）弱酸性pH4.5堿↑I2→IO3-+I-酸↑普魯卡因與碘在酸性條件下會產(chǎn)生復鹽沉淀（2）溫度24～26℃溫度＞38℃

未水解的供試品亦消耗碘（3）水解時間以水解20分鐘后的耗碘量最大（4）反應時間反應20分鐘后，耗碘量隨時間的變化較小，可減少含量測定的誤差。4、特點（1）靈敏度高:4I2→8I-樣品:碘=1:8（2）反應條件、實驗操作要求高V對、V對空V樣、V樣空1份含量加試劑次序、反應時間、滴定速度相同5、計算占標示量％＝×平均裝量樣品稀釋倍數(shù)%WCVVVV對照品）（）（樣對對對空樣樣空××--×樣品標示量×100%×（二）電位配位滴定法─汞量法1、原理：青霉素族SHROH-????-青霉素族HgRS2）（64.pH+2Hg2、方法pH4.6滴定樣品醋酸鹽緩沖液pH4.6滴定水解()總樣VNOHgHNONaOH????????????????233以未經(jīng)水解的樣品作空白測定例：苯唑西林鈉的含量測定取本品約50mg，精密稱定，加水5ml溶解后，加1mol/L氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，放置15分鐘，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸鹽緩沖液(pH4.6)20ml及水20ml，搖勻，照電位滴定法(附錄ⅦA),用鉑電極為指示電極，汞-硫酸亞汞電極為參比電極，在35～40℃，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)緩慢滴定,（控制滴定過程約為15分鐘），不計第一個等當點，計算第二個等當點時消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相當于8.029mg的總苯唑西林(按C19H19N3O5S計算)。

另取本品約0.5g，精密稱定，加水與上述醋酸鹽緩沖液各25ml，振搖使完全溶解，在室溫下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，終點判斷方法同上。每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當于8.029mg的降解物（按C19H19N3O5S計算）?？偙竭蛭髁值陌俜趾颗c降解物的百分含量之差值即為苯唑西林的含量。3、討論（1）以第二次滴定突躍為終點電位法指示終點（2）反應摩爾比1:1（3）空白試驗消除已降解產(chǎn)物干擾（4）優(yōu)點不需標準品4、計算（三）可見-紫外分光光度法1、硫醇汞鹽法：青霉素族（1）原理（咪唑）青霉烯酸硫醇汞鹽青霉素族????2HgClnmmax345324λ～（2）方法：對照品法標樣咪唑硼酸緩沖液標準液供試液AAHgCl??????????????-2（3）討論a、咪唑催化的水解產(chǎn)率高，硫醇汞鹽穩(wěn)定（≥3h）b、側鏈有-NH2時，需加醋酐先將其乙

?；蟛拍馨l(fā)生上述反應（4）特點a、簡便快速b、用標準品對照，重現(xiàn)性良好，RSD≤1%2、酸水解─銅鹽法：青霉素族（1）原理nmCupHA3204????????+2青霉烯酸青霉素族穩(wěn)定劑（2）方法：標準品對照法△標樣枸櫞酸硫酸銅標準液供試液AAnmA?????????????-320（3）特點實驗條件隨各藥物穩(wěn)定性不同而定3、羥肟酸比色法：β-內(nèi)酰胺類Fe3+/3H+紅色NaOH??????-b·2HClNOHH內(nèi)酰胺類羥肟酸衍生物（四）HPLC法內(nèi)標法＋校正因子外標法特點快速、高效、靈敏專屬性強、重現(xiàn)性好一法多用（鑒別、檢查、含量檢測）頭孢菌素類哌拉西寧原料藥含量測定色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇–0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液–10％氫氧化四乙基銨溶液–水（400︰50︰3︰547）用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.5為流動相。檢測波長為254nm。氨基糖苷類抗生素氨基糖苷苷元氨基糖縮合????+鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素鏈霉素鏈霉胍+鏈霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元鏈霉雙糖胺糖鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺慶大霉素絳紅糖胺+脫氧鏈霉胺+加洛糖胺

糖苷元

糖絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺慶大霉素C復合物慶大霉素C1R=HR1、R2=CH3

慶大霉素C2R=R2=HR1=CH3

慶大霉素C1aR、R1、R2=H

慶大霉素C2aR=CH3R1=R2=H

慶大霉素C2bR=R1=HR2=CH3一、化學性質(zhì)鏈霉素3個慶大霉素5個堿性中心多與硫酸成鹽堿性（一）水溶性溶解性（二）旋光性（三）鏈霉素pH5～7.5慶大霉素pH2～12穩(wěn)定UV（五）穩(wěn)定性（四）鏈霉素水解產(chǎn)物反應（六）鏈霉素λmax230nm坂口反應N-甲基葡萄糖胺反應麥芽酚反應二、鑒別試驗茚三酮反應（一）羥基胺結構△藍紫色慶大霉素鏈霉素茚三酮?????

α-氨基（二）Molisch試驗（糖類反應）

藍紫色慶大霉素（六碳糖）鏈霉素（五碳糖）α-萘酚H???+糠醛羥甲基糠醛蒽酮紅紫色N-甲基葡萄糖胺反應（三）（Elson-Morgan反應）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紅色甲基葡萄糖胺慶大霉素鏈霉素水解-????N鏈霉糖特有反應麥芽酚反應（四）H+分子重排鏈霉糖鏈霉素????-OH麥芽酚紫紅色????+3Fe8-羥基喹啉α-萘酚（或α-萘酚）橙紅羥基喹啉鏈霉胍鏈霉素次溴酸鈉?????-????-8OH鏈霉胍特有反應坂口反應（五）（六）硫酸鹽反應UV法（七）IR法（八）慶大霉素無UV吸收TLC法（九）H+白ˉ????4-24+2BaSOSOBanmmax230=λ鏈霉素三、特殊雜質(zhì)檢查及組分分析鏈霉素雜質(zhì)（一）鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）2、方法TLC中的對照品法（BP）1、來源反應中間體對微生物的活性無明顯差異毒副作用和耐藥性不同發(fā)酵菌種不同工藝差別C組分比例不一致規(guī)定控制各組分的相對百分含量ChPUSPBPJP慶大霉素C組分的測定（二）衍生化原理1、λmax=330nm??????++410.pH吲哚衍生物巰基醋酸鄰苯二醛氨基1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物RP－HPLC方法2、規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%計算3、峰面積歸一化法%100%2211×+++=CCCCiiAAAAAAaa四、含量測定鏈霉素、慶大霉素（一）微生物檢定法

本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用量反應平行線原理的設計，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。（二）HPLC法：血清中慶大霉素的測定血漿樣品的預處理離子對色譜法的目的：除去氨基酸、肽、胺的干擾選用OPA為熒光衍生化試劑采用柱后衍生化法

四環(huán)素類抗生素ABCD123456789101112四環(huán)素（TC）tetracycline金霉素(CTC)chlortetracycline氯四環(huán)素土霉素(OTC)oxytetracycline氧四環(huán)素兩性（一）1、與酸、堿均能成鹽2、強酸或強堿中溶解度↑

酚羥基、烯醇型羥基弱酸性二甲胺基弱堿性一、結構與性質(zhì)吸濕性（二）多含結晶水與金屬離子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+UV和熒光（四）與金屬離子絡合（五）旋光性（三）不穩(wěn)定性（六）1、差向異構化：A環(huán)淡黃→黑藍色熒光差向金霉素差向四環(huán)素金霉素四環(huán)素～-4-4?????62pH差向四環(huán)素（土霉素、多西環(huán)素不易差向異構化）2、降解反應：C環(huán)（1）酸性下降解λmax=445nmλmax=435nm橙黃色脫水金霉素脫水四環(huán)素金霉素四環(huán)素＜?????2pH脫水四環(huán)素～～TCETCATCEATC＜＜（2）堿性下降解（熒光）異四環(huán)素四環(huán)素????-OH二、鑒別試驗H2SO4反應（一）黃色朱紅色綠藍深紫色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素??????42SOH（二）FeCl3反應褐色橙褐色深褐色紅棕色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素????3FeCl（三）Cl-反應（四）TLC法白ˉ?????+3+-AgClAgClHNO正相分配薄層色譜EDTA克服痕量金屬造成的拖尾現(xiàn)象（五）熒光法UV綠色熒光H+UV土霉素金霉素四環(huán)素綠色熒光藍色熒光黃色熒光三、特殊雜質(zhì)檢查

·4-差向四環(huán)素（ETC）

·脫水四環(huán)素（ATC）

·差向脫水四環(huán)素（EATC）

·鹽酸金霉素（CTC）有關物質(zhì)（一）TLC法（1995版）HPLC法（2000版）標準品對照法例：鹽酸四環(huán)素四環(huán)素有關物質(zhì)TLC圖I.供試液(5mg/ml)ETC(0.2mg/ml)

ATC(0.025mg/ml)IV.EATC(0.025mg/ml)CTC(0.1mg/ml)VI.混合液4％0.5％0.5％2％吸收度（二）nmmax355268λ、鹽酸四環(huán)素雜質(zhì)吸收度EATCATC.Anm、控制????50￡430異四環(huán)素控制????120￡530.Anm()注射用CTC).~