關(guān)于生物合成核酸類(lèi)藥物核酸類(lèi)物質(zhì)藥物一般可分為兩大類(lèi)：一類(lèi)具天然結(jié)構(gòu)的核酸類(lèi)物質(zhì)，另一類(lèi)是自然結(jié)構(gòu)堿基、核苷、核苷酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或聚合物。第2頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天前者是生物體合成原料或蛋白質(zhì)、脂肪、糖生物合成與降解以及能量代謝的輔酶，這一類(lèi)藥物有助于改善機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量平衡，加速受損組織的修復(fù)，促使缺氧組織恢復(fù)正常生理機(jī)能，臨床上已廣泛使用于放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎縮等病癥的治療，包括肌苷、輔酶A、GTP、CTP、UTP、ATP、腺苷、輔酶I、輔酶Ⅱ等，多數(shù)是生物體自身能夠合成的物質(zhì)，具有一定臨床功能，毒副作用小，基本都可經(jīng)微生物發(fā)酵或從生物資源中提取。第3頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天后一類(lèi)藥物是治療病毒感染性疾病、腫瘤的重要手段，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制的臨床藥物。正式用于臨床的抗病毒核苷類(lèi)藥物有三氮唑核苷、疊氮胸苷、阿糖腺苷等。第4頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天核酸類(lèi)物質(zhì)生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶解法和發(fā)酵法三種?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)，工藝比較復(fù)雜，設(shè)備條件要求較高；酶解法受到酶源及原材料的局限；發(fā)酵法以糖質(zhì)原料生產(chǎn)核苷酸類(lèi)物質(zhì)，符合食用習(xí)慣，生產(chǎn)成本低、效益高，特別是目前基因工程育種技術(shù)及高產(chǎn)優(yōu)化控制技術(shù)的采用，使發(fā)酵法生產(chǎn)成本大大降低，優(yōu)勢(shì)更為明顯。第5頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天主要核酸類(lèi)發(fā)酵產(chǎn)物及其應(yīng)用第6頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天13.1肌苷的發(fā)酵法生產(chǎn)1．概述肌苷是近年來(lái)生產(chǎn)發(fā)展較快的一種生化藥品，對(duì)不同類(lèi)型的心臟病及肝臟病都有較好療效，并具有無(wú)毒、無(wú)副作用的特點(diǎn)。另外，它還是唯一能代替人體內(nèi)輔酶A功能的藥物。肌苷經(jīng)磷酸酯化后生成5`-肌苷酸，用作鮮味劑的前體物質(zhì)。主要生產(chǎn)國(guó)是日本，試驗(yàn)室產(chǎn)量已達(dá)80g/L以上，我國(guó)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)量30g/L左右，生產(chǎn)水平在20g/L左右。第7頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天肌苷化學(xué)名是次黃嘌呤核苷，是次黃嘌呤和核糖的縮合物，其磷酸酯為肌苷酸。在次黃嘌呤核苷中，核糖連在N-9位置上，以糖苷鍵的形式連接在以呋喃形式存在的核糖第一位碳原子上，分子式為C10H12N4O5，相對(duì)分子質(zhì)量為268.23。肌苷為白色結(jié)晶或呈無(wú)水粉末狀，無(wú)嗅，味微苦，熔點(diǎn)約為218℃，易溶于水，pH近中性。在飽和水溶液中約含肌苷15g/L，在稀鹽酸或氫氧化鈉溶液中易溶，在氯仿、乙醇中不溶。第8頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天肌苷的結(jié)構(gòu)式第9頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．生產(chǎn)菌種主要為細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)氨短桿菌、谷氨酸棒桿菌、谷氨酸小球菌、節(jié)桿菌、銅綠色假單胞菌、大腸桿菌等。此外，一些酵母和霉菌也可產(chǎn)生肌苷。第10頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天3．培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1.0％、牛肉膏1.4％、蛋白胨1.0％、酵母膏1.0％、氯化鈉0.5％，pH7.0~7.2。種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.0％、酵母膏1.5%、蛋白胨1.0％、玉米漿0.5％、氯化鈉0.5％，pH7.0~7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖12％、酵母粉1.4％、硫酸銨1.3％、玉米漿0.5％、尿素0.2%、氯化鉀0.6%、磷酸氫二鈉0.5％、硫酸鎂0.22％、碳酸鈣2.0％、pH7.0~7.2。滅菌條件：斜面培養(yǎng)基0.1MPa，20min，種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基0.08MPa，15min。第11頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天4．生產(chǎn)工藝第12頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天5．發(fā)酵控制碳源大多使用葡萄糖，在發(fā)酵生產(chǎn)中也可利用淀粉水解液。常用氮源有氯化銨、硫酸銨或尿素等。因肌苷的合氮量很高(20.9％)，所以須供應(yīng)足夠的氮源，工業(yè)發(fā)酵常用氨水來(lái)調(diào)節(jié)pH，這樣既可以供氮源，又可調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH。第13頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天磷酸鹽對(duì)肌苷生成有很大影響。采用短小芽孢桿菌的腺嘌呤缺陷型發(fā)酵時(shí)，可溶性磷酸鹽如磷酸鉀顯著抑制肌苷累積，不溶性磷酸鹽如磷酸鈣可促進(jìn)肌苷的生成。采用產(chǎn)氨短桿菌變異株時(shí)，肌苷發(fā)酵不需要維持低水平無(wú)機(jī)磷，即使添加2％磷酸鹽，也能累積大量肌苷。第14頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天肌苷生產(chǎn)菌株一般為腺嘌呤缺陷型菌株，培養(yǎng)基中須加入適量腺嘌呤，如酵母膏等。由于腺嘌呤是肌苷酸的前體，而腺苷酸又是控制IMP生物合成的主要因子，所以加入腺嘌呤的多少，不僅影響菌體的生長(zhǎng)，更影響肌苷積累。腺嘌呤對(duì)肌苷積累最適濃度比菌體生長(zhǎng)所需要的最適濃度小一些，稱(chēng)為亞適量。第15頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

氨基酸促進(jìn)肌苷積累、節(jié)約腺嘌呤用量。其中組氨酸是必需的，異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸及賴(lài)氨酸等8種氨基酸也有促進(jìn)作用。除組氨酸外的其他8種氨基酸可以用高濃度的苯丙氨酸一種來(lái)代替。氨基酸可通過(guò)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)使肌苷產(chǎn)量增加。第16頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天發(fā)酵條件，如pH值、溫度、通氣攪拌等都是影響肌苷積累的重要因素。肌苷積累的最適pH值為6.0~6.2；最適溫度對(duì)枯草桿菌為30℃，對(duì)短小芽孢桿菌為32℃；供氧不足可使肌苷生成受到顯著的抑制，而積累一些副產(chǎn)物；通氣攪拌可減少CO2對(duì)肌苷發(fā)酵的抑制作用。第17頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天6．肌苷的生理作用和藥用價(jià)值肌苷可直接透過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，使處于低能缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞恢復(fù)正常水平，繼續(xù)進(jìn)行新陳代謝，并能活化丙酮酸氧化酶類(lèi)，參與人體細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，具有激活細(xì)胞、刺激代謝等作用。第18頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著或持續(xù)下降時(shí)，細(xì)胞功能低下，此時(shí)細(xì)胞進(jìn)入低能狀態(tài)，ATP的加入可以解除這種低能狀態(tài)。但ATP不能透過(guò)細(xì)胞膜，而肌苷對(duì)細(xì)胞有高度的滲透性，因此，肌苷是唯一代替人體增加ATP的藥物。肌苷進(jìn)入細(xì)胞后生成丙酮酸，丙酮酸可轉(zhuǎn)化為輔酶A和乳酸。第19頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天肌苷主要應(yīng)用于心臟疾病、肝臟病、白細(xì)胞減少癥、放射性照射病、貧血病、血吸蟲(chóng)病、視網(wǎng)膜炎、神經(jīng)萎縮、毛地黃中毒等癥。肌苷可制成肌苷二醛、異丙肌，對(duì)精巢上皮瘤、麥粒細(xì)胞癌以及某些病毒性疾患都可以起緩解或抵抗作用，還可制造干擾素的誘導(dǎo)劑。此外，肌苷磷酸化后生成肌苷酸，是制造強(qiáng)力味精的前體物質(zhì)。第20頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天13.2肌苷酸的生產(chǎn)肌苷酸由核糖、磷酸和次黃嘌呤組成，其中磷酸結(jié)合在核酸的第5位羥基上。肌苷酸的結(jié)構(gòu)式第21頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

肌苷酸為白色結(jié)晶粉末狀或顆粒狀，味鮮，無(wú)臭，易溶于水，在乙醇或其他有機(jī)溶劑中溶解度極小。核苷和堿基容易透過(guò)細(xì)胞膜而核苷酸卻難以透過(guò)，因此由微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸比較困難?？山獬⑸镒陨矸答佌{(diào)節(jié)、改變細(xì)胞膜通透性，在發(fā)酵液中積累肌苷酸。發(fā)酵法得到的是肌苷酸鈉鹽。第22頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天1．生產(chǎn)菌種有短小芽孢桿菌、產(chǎn)氨短桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、某些鏈霉菌等。肌苷酸產(chǎn)生菌在Mn2+限量(20μg/L以下)的條件下，菌體會(huì)產(chǎn)生膨脹異常形態(tài)，積累肌苷酸，因此認(rèn)為細(xì)胞膜對(duì)肌苷酸存在透過(guò)性障礙。Mn2+使細(xì)胞通透性降低。第23頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．肌苷酸生物合成途徑最初起作用的酶是PRPP氨基轉(zhuǎn)移酶，該酶受AMP、ATP及GMP的反饋抑制，被腺嘌呤阻遏。還有腺苷酸琥珀脫氫酶（SAMP脫氫酶）和GMP還原酶。誘變處理可獲得SAMP脫氫酶缺失的腺嘌呤缺陷型突變株和缺失XMP氨化酶的鳥(niǎo)嘌呤缺陷型菌株更多地積累肌苷酸。第24頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天肌苷酸合成途徑第25頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天3．肌苷酸的生產(chǎn)工藝肌苷酸的生產(chǎn)方法（1）將生物細(xì)胞內(nèi)的呈味核苷酸用化學(xué)方法抽提和精制。（2）從微生物（例如酵母）細(xì)胞提取核酸后，再通過(guò)有關(guān)酶系進(jìn)行核酸降解。（3）用發(fā)酵法或合成工藝制得肌苷酸的前體物質(zhì)，再經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化而成。（4）選育肌苷酸高產(chǎn)變異菌株，直接發(fā)酵生產(chǎn)。第26頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天一般采用方法（2）和方法（4）生產(chǎn)肌酸。國(guó)外采用枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氨短桿菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗代謝類(lèi)似物、Mn2+不敏感抗生物素菌株，以糖類(lèi)等為基質(zhì)的發(fā)酵法得到穩(wěn)步發(fā)展，效益顯著。工藝路線如下：試管斜面培養(yǎng)→搖瓶種子培養(yǎng)→二級(jí)種子罐培養(yǎng)→三級(jí)種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵→板框壓濾→脫色→活性炭吸附→濃縮結(jié)晶→精制第27頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天4．肌苷酸的用途肌苷酸可參與機(jī)體能量代謝以及蛋白質(zhì)合成，活化丙酮酸氧化酶，能使細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下繼續(xù)進(jìn)行代謝。肌苷酸的主要醫(yī)用價(jià)值為白細(xì)胞或血小扳減少癥、各種急慢性肝炎、肺原性心臟病、中心性視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮癥、放射線照射病、毛地黃中毒癥以及血吸蟲(chóng)病等的治療。第28頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天肌苷酸更主要用途是作為助鮮劑，制成強(qiáng)力味精(第二代味精)和復(fù)合調(diào)味料(第三代味精)。肌苷酸單獨(dú)存在時(shí)，鮮味并不顯著，但與谷氨酸鈉(味精)并存時(shí)，該混合物鮮味隨肌苷酸含量的增加而增強(qiáng)。此外肌苷酸可提高醬油品質(zhì)。第29頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天13.3鳥(niǎo)苷酸的生產(chǎn)鳥(niǎo)苷酸由鳥(niǎo)嘌呤、核糖和磷酸三部分組成，磷酸結(jié)合在核糖的5`位羥基上，又名5`-單磷酸鳥(niǎo)苷，分子式為C10H12N5O6P。鳥(niǎo)苷酸的結(jié)構(gòu)式第30頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天鳥(niǎo)苷酸為白色晶體或粉末，溶于冷水中，能完全溶于堿溶液中，在冷的酸性溶液中緩慢分解。生產(chǎn)中多以鈉鹽形式出現(xiàn)。鳥(niǎo)苷酸在菌體內(nèi)的濃度超過(guò)一定限度，就會(huì)引起反饋調(diào)節(jié)，抑制鳥(niǎo)苷酸合成。尤其是使PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶、IMP脫氫酶及GMP合成酶等受到抑制。而且微生物中還普遍存在催化由GMP向?yàn)貘B(niǎo)苷、鳥(niǎo)嘌呤降解的酶系。因此必須利用相關(guān)營(yíng)養(yǎng)缺陷型進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。

鳥(niǎo)苷溶解度很低，發(fā)酵中容易析出結(jié)晶，減弱了反饋調(diào)節(jié)的效果，有可能積累鳥(niǎo)苷。第31頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天GMP生產(chǎn)方法除RNA分解外，還有：（1）生物和化學(xué)合成并用：利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)AICAR（S），然后AICAR(S)經(jīng)過(guò)有機(jī)化學(xué)合成的方法制成GMP。（2）利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)鳥(niǎo)苷，然后以酶法或化學(xué)合成法將鳥(niǎo)苷進(jìn)行磷酸化，得到GMP。（3）雙菌混合發(fā)酵：利用XMP或黃苷生產(chǎn)菌與能將XMP或黃苷轉(zhuǎn)化為