關(guān)于狂犬病毒基礎(chǔ)知識(shí)及生產(chǎn)工藝目錄第2頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

狂犬病病毒歸屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae），病毒形態(tài)是一端平坦或略凹狀，另

一端為半原形，酷似子彈，故得名彈狀病毒，病毒大小75*175nm經(jīng)組織培養(yǎng)后，病毒的形態(tài)多呈兩端平坦?fàn)畹念w粒。單鏈RNA病毒.

狂犬病毒的特點(diǎn)第3頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天狂犬病毒形狀第4頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天狂犬病病毒電鏡照片第5頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

狂犬病毒對(duì)外界的抵抗力很弱，對(duì)溫度敏感，60℃30~60min，100℃2min即可滅活。病毒對(duì)陽(yáng)光、紫外線敏感，各

種常見(jiàn)的消毒劑如肥皂水、碘酒、3%來(lái)蘇爾、75%酒精等均可使其滅活。

抗生素對(duì)其卻無(wú)滅活作用。

狂犬病毒的特點(diǎn)第6頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

狂犬病病毒最大的特點(diǎn)是對(duì)神經(jīng)組織的嗜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他組織。在神經(jīng)組織內(nèi)病毒復(fù)制的比率遠(yuǎn)比在其他組織內(nèi)高?？袢《镜奶攸c(diǎn)第7頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、狂犬病毒形狀為子彈形，一端為橢圓形，另一端平整。2、狂犬病毒具有嗜神經(jīng)性，主要在中樞神經(jīng)內(nèi)繁殖。3、狂犬病毒最初進(jìn)入傷口時(shí)，不進(jìn)入血液循環(huán)，而是在被咬傷的肌肉組織中復(fù)制，然后侵入神經(jīng)系統(tǒng)。4、狂犬病毒在神經(jīng)軸中的移動(dòng)速度約5~100mm/天，如一定范圍內(nèi)（10um-2cm）的軸突同時(shí)受感染，病毒移行速度甚至?xí)?。狂犬病毒的特點(diǎn)第8頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

野生動(dòng)物與家畜是狂犬病的傳染源。人類狂犬病由狗、貓直接傳染者占90%以上，其次為牛（主要是水牛）、豬、兔、馬、驢騾以及野生動(dòng)物。

狂犬病毒的宿主動(dòng)物

第9頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天通過(guò)神經(jīng)進(jìn)入分泌腺體：在唾液中排出病毒進(jìn)入大腦細(xì)胞引起全腦炎在神經(jīng)系統(tǒng)中向心性移動(dòng)通過(guò)肌肉周圍神經(jīng)末梢進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)病毒在傷口周圍肌肉細(xì)胞中復(fù)制被動(dòng)物咬傷而感染病毒狂犬病致病機(jī)理第10頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天一般20–60天從暴露后數(shù)天到數(shù)年，差別非常大主要的影響因素感染的病毒數(shù)量

感染的病毒株

暴露的嚴(yán)重程度

暴露的部位

一般20-60天1月內(nèi)發(fā)病71%

3月內(nèi)發(fā)病87%7-10天10-20天21-28天1-3月3-6月6-12月1年3.25%41.87%25.88%16.12%3.25%3.25%6.38%潛伏期第11頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天人用狂犬病疫苗發(fā)展史第12頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天1882年，巴斯德成功在牛腦中分離到狂犬病毒株，并在兔腦內(nèi)連續(xù)傳90代，成為固定毒。1885年，巴斯德嘗試研制減毒活疫苗1911年，Semple在巴斯德的研究基礎(chǔ)上，研制出腦組織滅活疫苗；1956年，Peck研究制備鴨胚疫苗（DEV）。該疫苗在美國(guó)和其他國(guó)家用作狂犬病暴露后處理并廣泛使用了27年，很少觀察到嚴(yán)重的副作用，但中和性抗體水平不如腦組織疫苗。1964年，美國(guó)研制出人二倍體細(xì)胞疫苗，并于1978年開(kāi)始商品化，目前在美國(guó)、加拿大、大多數(shù)歐洲國(guó)家和幾個(gè)亞洲國(guó)家使用。1984年由法國(guó)Merieun研究所研制成功Vero細(xì)胞疫苗國(guó)外疫苗發(fā)展史第13頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天國(guó)內(nèi)疫苗發(fā)展史1949年，羊腦組織疫苗1980年，原代地鼠腎細(xì)胞疫苗（淡苗）之后經(jīng)歷了濃縮苗、精致苗、無(wú)佐劑純化苗90年代，引進(jìn)Vero細(xì)胞疫苗2005年6月30日，無(wú)佐劑疫苗第14頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天人用狂犬疫苗生產(chǎn)工藝第15頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第16頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天原始種子（3aG4）→豚鼠腦內(nèi)傳代（3aG5）→地鼠腎細(xì)胞傳代（4aG）→豚鼠腦內(nèi)傳2代（4aG2）→建立主代毒種庫(kù)主代毒種庫(kù)（4aG2）→豚鼠腦內(nèi)傳1代（4aG3）→建立主工作毒種庫(kù)毒種制備工藝：第17頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天毒種制備工藝：地鼠→消毒、解剖、取腎、消化→細(xì)胞制備→接種病毒→洗換→收獲病毒液→滅活病毒→超濾濃縮→純化→半成品配制→洗瓶、灌裝、軋蓋→目檢→包裝→入庫(kù)第18頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天地鼠的挑揀清洗：純化水4~6遍，注射用水3遍消毒：2%甲醛溶液2遍，0.1%新潔爾滅2遍解剖：扒皮、剪肌、取腎洗腎：消化：0.1%胰蛋白酶每對(duì)腎加入3~4ml，置2~8℃消化15~18小時(shí)。解剖消化工藝第19頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天地鼠消毒第20頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天解剖地鼠第21頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)液配制：Hanks’液＋營(yíng)養(yǎng)液＋小牛血清＋硫酸慶大霉素細(xì)胞制備：棄去消化液，洗滌腎塊，搖振分散細(xì)胞，反復(fù)收集數(shù)次。細(xì)胞培養(yǎng)：37±1℃培養(yǎng)90-100小時(shí)細(xì)胞制備工藝第22頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)第23頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天地鼠腎細(xì)胞第24頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞觀察毒種配制接種培養(yǎng)吸附：34±1℃培養(yǎng)吸附18-24小時(shí)接種病毒工藝第25頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天維持液配制：199＋0.2~0.4%人血白蛋白＋碳酸氫鈉洗滌細(xì)胞換維持液病毒培養(yǎng)：34±1℃培養(yǎng)96～120小時(shí)洗換工藝第26頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞觀察收獲病毒液：收獲標(biāo)準(zhǔn)加液：加維持液取樣檢定保存：收獲液置2~8℃保存、待檢；細(xì)胞瓶置34±1℃繼續(xù)培養(yǎng)96～120小時(shí)多次收獲病毒液、加液工藝第27頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天收獲液檢查無(wú)菌轉(zhuǎn)入加滅活劑：終濃度甲醛溶液250μg/ml滅活過(guò)程：滅活罐內(nèi)混勻，于34℃±1℃恒溫滅活18～20小時(shí)取樣檢定病毒滅活工藝第28頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天采用截留分子量為300KD的濾膜超濾濃縮至蛋白質(zhì)含量在2000～3000μg/ml范圍內(nèi)（濃縮倍數(shù)為50±10倍）按照病毒收獲液體積的0.3～0.6倍的滅菌PBS對(duì)濃縮液進(jìn)行分段洗濾超濾濃縮工藝第29頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天濃縮液離心層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠Sepharose4FF純化：以pH7.5的PBS洗脫，洗脫液流速240～280ml/分鐘，280nm紫外檢測(cè),收集第一峰。取樣檢定純化工藝第30頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天配方計(jì)算：抗原含量≥4.5IU/ml，蛋白質(zhì)含量應(yīng)不高于80μg/ml配制：將純化后原液及終濃度為1%的人血白蛋白、40μg/ml的硫柳汞轉(zhuǎn)入合并罐內(nèi)混勻。取樣配制工藝第31頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天西林瓶清洗、滅菌：經(jīng)超聲波清洗后350℃5分鐘干熱滅菌分裝：疫苗每支裝量不少于標(biāo)示量軋蓋：通過(guò)傳輸帶傳至軋蓋間，自動(dòng)上機(jī)進(jìn)行加蓋封口。灌裝工藝第32頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天外觀檢查：雙眼平視西林瓶，首先檢查裝量是否準(zhǔn)確；再移至目檢臺(tái)黑、白色底板處檢查是否有異物。目檢工藝第33頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天包裝規(guī)格:小盒：5瓶/人份中盒：10人份/盒大箱：120人份/箱包裝工藝1第34頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天包材噴印按包裝指令上內(nèi)容對(duì)小盒、中盒、大箱、合格證進(jìn)行調(diào)試印制，“產(chǎn)品批號(hào)”、“生產(chǎn)日期”及“有效期至”印制位置適中，字體應(yīng)清晰。包裝前核對(duì)對(duì)所有包材印制“產(chǎn)品批號(hào)”、“生產(chǎn)日期”及“有效期至”內(nèi)容的核對(duì)應(yīng)與包裝指令內(nèi)容一致無(wú)誤。包裝工藝2第35頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天裝盒：將計(jì)數(shù)后西林瓶逐一進(jìn)行標(biāo)簽印制貼附；取5只貼簽后西林瓶裝入白色盒托，上放一份說(shuō)明書裝入小盒，貼上封口簽；取10小盒裝入一中盒，貼上封口簽；取12中盒裝入一大箱。最后放一張產(chǎn)品合格證進(jìn)行封箱捆扎轉(zhuǎn)入2～8℃冷庫(kù)整齊擺放。包裝工藝3第36頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天電子監(jiān)管碼生成及貼附對(duì)10小盒產(chǎn)品進(jìn)行一級(jí)電子條碼掃描生成一個(gè)二級(jí)條碼貼附在對(duì)應(yīng)的中盒包裝指定位置；對(duì)12中盒產(chǎn)品進(jìn)行二級(jí)電子條碼掃描生成兩個(gè)三級(jí)條碼貼附在對(duì)應(yīng)的大箱包裝指定位置。包裝工藝4第37頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、外觀：依法進(jìn)行檢查，結(jié)果為無(wú)色澄明液體，無(wú)異物。2、裝量：依法進(jìn)行裝量檢查，應(yīng)不低于標(biāo)示量1.0ml/劑。3、化學(xué)檢定（1）pH值：依法進(jìn)行檢測(cè)，pH值應(yīng)為7.2～8.0。（2）硫柳汞含量：依法進(jìn)行硫柳汞含量檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)為30～50μg/ml。（3）游離甲醛含量：依法進(jìn)行游離甲醛含量檢測(cè)，結(jié)果不得高于40μg/ml。成品檢定第38頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、效價(jià)測(cè)定：依法檢查，放行標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)不低于4.0IU/劑。有效期內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)不低于2.5IU/劑。5、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：疫苗出廠前應(yīng)進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。于37℃放置14天后依法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，應(yīng)不低于2.5IU/劑。6、牛血清白蛋白殘留量測(cè)定：依法進(jìn)行牛血清白蛋白殘留量測(cè)定，結(jié)果應(yīng)不高于50ng/劑。成品檢定第39頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天成品檢定7、抗生素殘留量測(cè)定：依法進(jìn)行硫酸慶大霉素殘留量測(cè)定，結(jié)果應(yīng)不高于50ng/劑。8、地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定：依法進(jìn)行地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定，結(jié)果應(yīng)不高于24μg/劑。9、無(wú)菌檢查：依法進(jìn)行無(wú)菌檢查，結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。第40頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天成品檢定10、異常毒性試驗(yàn)：依法進(jìn)行異常毒性試驗(yàn)檢查，結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。11、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查：依法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果應(yīng)不高于25EU/劑12