第21章基因診斷GeneDiagnosis

References《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)》（七年制統(tǒng)編教材）馮作化主編人民衛(wèi)生出版社

《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)》（第3版）藥立波主編人民衛(wèi)生出版社

2實驗室診斷技術(shù)發(fā)展簡史第四類20世紀(jì)80年代第三類20世紀(jì)60年代第二類20世紀(jì)50年代第一類基因診斷免疫學(xué)檢驗代謝產(chǎn)物、酶活性變化細(xì)胞學(xué)檢查3基因變異致病

（1）內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常

（2）外源基因的入侵

點突變、缺失、插入易位、重排、擴(kuò)增基因變異疾病4先天遺傳性疾患——如鐮刀型貧血、白化病、紅綠色盲后天基因突變引起的疾病——如癌癥、心血管疾病基因變異致病5腫瘤的早期基因診斷6基因診斷一、基因診斷概述二、常用技術(shù)與方法三、應(yīng)用概念基本原理特點臨床意義7第一節(jié)

基因診斷概述指利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方法，通過檢測基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)功能的異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程?；蛩降牟∫蛟\斷基因診斷對象：DNA/RNA前提：已確定疾病表型與基因型的關(guān)系1.概念92.特點（2）特異性強(qiáng)、靈敏度高：由于基因診斷采用核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)；（3）適用范圍廣：健康預(yù)警、產(chǎn)前診斷、疾病易感性、藥物敏感性、病原體基因分型等。（1）直接檢測基因，屬病因診斷，針對性強(qiáng)；103.臨床意義

對有表型出現(xiàn)的疾病作出明確診斷

早期快速診斷

確定個體對疾病的易感性疾病的分期分型、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷等11癥狀前篩查檢查對象：晚發(fā)型、高易感性、高風(fēng)險性疾病或惡性腫瘤。

類型疾病名稱易感、或致病基因可選擇的預(yù)防、治療措施晚發(fā)型遺甲狀腺髓質(zhì)瘤RET預(yù)防性手術(shù)切除傳病成人型多囊腎多囊腎基因預(yù)防性手術(shù)切除、其他治療遺傳病易肝血色素病HFE預(yù)防性換血治療感基因攜靜脈血栓性梗凝血因子Ⅴ避免吸煙、口服避孕藥帶者塞基因(R506Q)

遺傳性癌遺傳性乳腺癌BRCA1、BRCA2監(jiān)測、預(yù)防性手術(shù)切除

癥易感基遺傳性非息肉MLH1、MSH2

因腸癌(HNPCC)12預(yù)測性遺傳篩查在個體的不同時期，針對不同對象進(jìn)行新生兒篩查以便早診斷、治療和預(yù)防育齡(婚前)對象篩查對發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重疾病基團(tuán)攜帶者進(jìn)發(fā)病風(fēng)險估計，防止遺傳病發(fā)生在后代。產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷提供終止患病胎兒繼續(xù)發(fā)育的選擇。預(yù)植入基因診斷(PGD)，又稱受精卵子宮著床前診斷，是針對體外授精、試管嬰兒等輔助生殖技術(shù)的基因診斷。13第二節(jié)

基因診斷的常用技術(shù)和方法(一)基因診斷的常用技術(shù)

樣品的核酸抽提目的序列的擴(kuò)增（PCR)分子雜交

（Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、點雜交、ASO、原位雜交和DNA芯片技術(shù)）信號檢測15TargetsandMolecularTechniquesDNASouthernblot,FISH,PCR,Sequencing,microarray,restrictionanalysis,RFLP，SSCPRNANorthernblot,RT-PCR,microarrays16BasicPrincipleDenatureHybridizeSouthern,FishPCRDNA:

denaturationandhybridizationofthehelixstructure17基本原理：核酸變性、復(fù)性復(fù)性RNADNA1.核酸分子雜交18核酸分子雜交的應(yīng)用

研究DNA分子中特異基因的定位及檢測確定兩種核酸分子間的序列相似性檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)19核酸分子雜交的流程示意圖待測核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未參與雜交的探針檢測雜交信號制備探針核酸片段探針標(biāo)記加入標(biāo)記核酸探針20探針（probe）探針：一段能與待測核酸片段互補(bǔ)結(jié)合、經(jīng)過特殊標(biāo)記的特異核苷酸序列。制備探針的方法：基因文庫法、逆轉(zhuǎn)錄法、人工合成法等通常為單鏈核苷酸片段探針一般帶有標(biāo)記物21探針的種類基因組DNA

探針cDNA探針（應(yīng)用最廣泛）寡核苷酸探針(Oligonucleotideprobes)RNA探針22探針序列的選擇致病微生物核酸中最保守、最特異的序列突變基因中含突變位點或突變區(qū)的序列待測基因編碼的mRNA序列23探針的標(biāo)記物放射性標(biāo)記物（放射自顯影）32P，35S，125I，3H非放射性標(biāo)記物（化學(xué)顯色）生物素，地高辛，熒光素，酶，金屬24常用的固相核酸雜交的方法

Southern印跡雜交法(Southernblotting)Nouthern印跡雜交法(Nouthernblotting)

斑點雜交(dotblothybridization)或狹縫雜交法(slotblothybridization)

菌落雜交法(clonyhybridization)原位雜交法(nucleicacidhybridizationinsitu)25SouthernblotNNTTNTT26FISHN2728／原位雜交可檢出被檢基因的空間位置狀況，即細(xì)胞的具體定位、數(shù)目及類型。29

2、聚合酶鏈反應(yīng)體外基因擴(kuò)增技術(shù)

（PolymeraseChainReaction，PCR）30基本原理變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C在體外不斷進(jìn)行DNA復(fù)制的過程31PCR技術(shù)的優(yōu)點特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡單、省時對待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率的基因擴(kuò)增技術(shù)32PCR引物設(shè)計的一般原則引物的特異性（與非擴(kuò)增區(qū)的同源性＜70%）引物長度（15-30bp）G+C含量（45%-55%）引物自身/之間不能形成二級結(jié)構(gòu)3’3’5’5’5’5’33PCR的種類多重PCR(multiplexPCR）套式PCR（NestedPCR）PCR結(jié)合寡核苷酸探針斑點雜交法PCR-RFLP原位PCRRealtimePCR34PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析法凝膠電泳PCR/點雜交PCR/SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism）

PCR/sequencingPCR/RFLP35三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析疑膠電泳分析法通過凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，若特異擴(kuò)增出一條帶，該法即可判斷結(jié)果。注意平行對照：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物陽性對照陰性對照內(nèi)參照36限制性酶切分析法設(shè)計的引物，使擴(kuò)增片段包括某一種或數(shù)個限制酶識別序列，PCR反應(yīng)后用限制酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳檢測酶切片段長度的變化。37

采用能與擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部核苷酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針，實施斑點雜交或Southern印跡雜交當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶時，適用該法。核酸雜交法383.DNAsequencing最直接、最準(zhǔn)確39DNA芯片技術(shù)

DNAchipsormicroarray40基因芯片技術(shù)的流程BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayer

MicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysis41基因芯片打印儀42自動化4344單色熒光雜交結(jié)果Cye3Cye545雙色熒光疊加結(jié)果46DNA序列分析基因突變檢測及多態(tài)性分析基因表達(dá)譜分析基因診斷新藥研發(fā)及藥物篩選基因芯片基因芯片技術(shù)的應(yīng)用47基因芯片技術(shù)的優(yōu)勢微型化和自動化高度平行性巨大的信息產(chǎn)出率高度敏感性和專一性強(qiáng)大的類比性48（二）基因診斷的基本方法基因突變的檢測多態(tài)性分析基因表達(dá)異常的檢測外源基因的檢測49檢測已知的點突變：

PCR/ASO探針法

ASO：等位基因特異性寡核苷酸檢測未知的點突變：

PCR/SSCP/sequencingSSCP：單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析singlestrandconformationpolymorphism1.基因突變的檢測50等位基因的特異寡核苷酸（ASO)探針

當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針，用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時一般需要合成兩種探針，與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來.

51PCR/ASO探針法52通過PCR同時擴(kuò)增待測基因和野生型對照基因的DNA片段，將擴(kuò)增的雙鏈DNA變性成單鏈，用非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。待測基因的單鏈DNA上單個堿基的改變可導(dǎo)致構(gòu)象的改變，其電泳遷移率也會發(fā)生改變。通過比較這兩者的遷移率，即可判斷是否發(fā)生基因突變。PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR/SSCP53正常人純合突變雜合突變PCR/SSCP分析+—54PCR結(jié)合序列分析不僅可以檢出有無突變，還能檢測突變的具體位置和突變類型、獲得堿基組成和順序改變的詳細(xì)信息。PCR/Sequencing552.多態(tài)性分析人群中不同個體間基因的核苷酸序列存在著差異性，稱為DNA的多態(tài)性，是生物多樣性的遺傳基礎(chǔ)。DNA多態(tài)性的發(fā)生可導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶識別位點的增加、缺失或易位，使DNA分子的限制性酶切位點數(shù)目、位置發(fā)生改變。用限制酶切割基因組時，所產(chǎn)生的限制性片段的數(shù)目和每個片段的長度就不同，即所謂限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,

RFLP）56RFLP分析法（1）限制性酶切圖譜直接分析法（2）RFLP間接分析法

PCR/RFLP連鎖分析法57限制性內(nèi)切酶酶譜分析原理：某些疾病的發(fā)生是由于基因內(nèi)單一堿基的改變引起，當(dāng)此突變正好發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點時，會導(dǎo)致內(nèi)切酶圖譜的改變，根據(jù)這一改變，綜合其它因素，可對疾病的發(fā)生診斷。MSTII識別位點：

CCTNAGG正常

-珠蛋白基因：5’－CCTGAGG－3’鐮刀型貧血：5’－CCTGTGG－3’實例分析：鐮刀型紅細(xì)胞性貧血58MMMMM正常－Hb鐮刀型貧血－Hb1.1kb0.2kb1.3kbAAASSS1.3kb1.1kb0.2kb5960DNA重復(fù)序列多態(tài)性分析可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）：小衛(wèi)星DNA；DNA指紋法短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat,STR):1~4bp，微衛(wèi)星DNA數(shù)量多、分布均勻、易于檢測613.基因表達(dá)異常的診斷mRNA的定量分析：點雜交、逆轉(zhuǎn)錄PCR法、競爭性PCRmRNA定性分析：Northern印跡法DNA芯片技術(shù)：通過一次雜交即可平行檢測成千上萬個基因的表達(dá)狀況，從而在RNA診斷上具有顯著的優(yōu)越性。624.表觀遺傳學(xué)(epigenetic)DNA甲基化：DNA胞嘧啶(C)的第五位碳原子加上甲基(mC)

甲基化酶S-腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸CH3胞嘧啶5-甲基化胞嘧啶CpG二聯(lián)體基因組整體水平的甲基化檢測基因特異位點甲基化的檢測新甲基化位點的尋找。63三、基因診斷的應(yīng)用

遺傳疾病的基因診斷（產(chǎn)前、產(chǎn)后診斷）感染性疾病的基因診斷（早期診斷）腫瘤的基因診斷（分類分型與預(yù)后監(jiān)測）基因診斷在法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用（個體識別、親子鑒定）判斷個體疾病易感性器官移植組織配型64(一)遺傳性疾病基因診斷直接基因診斷的前提是被檢測基因必須已被克隆，基因的正常順序和結(jié)構(gòu)已被闡明，致病突變也已經(jīng)清楚。直接診斷策略檢測已知的致病基因較長的DNA片段的突變：Southernblot已知點突變：RFLP,PCR/ASO未知點突變：PCR/SSCP先尋找點突變，再用序列分析652.間接診斷策略：

檢測與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)記限制性片段長度多態(tài)性、微衛(wèi)星DNA序列和單核苷酸多態(tài)性（SNP)。尋找具有基因缺陷的染色體，并判斷被檢者是否具有這條染色體。(一)遺傳性疾病基因診斷66(二)感染性疾病的基因診斷核酸分子雜交PCRDNA芯片技術(shù)外源基因的檢測67(三)腫瘤的基因診斷1.腫瘤相關(guān)基因的檢測（1）檢測腫瘤相關(guān)基因的突變癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因等（2）檢測腫瘤相關(guān)病毒的基因①與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤有關(guān)的EB病毒②與宮頸癌有關(guān)的人類乳頭瘤病毒（HPV）③與肝癌有關(guān)的HBV、HCV

（3）檢測腫瘤標(biāo)志物基因2.腫瘤相關(guān)基因表達(dá)譜分析68腫瘤相關(guān)基因的檢測p53基因突變的檢測①PCR-SSCP法：可檢測有無突變；②

PCR-sequencing：可檢出有無突變，突變的密碼子及突變、缺失或插入的堿基數(shù)及其部位；③PCR-RFLP法：可對突變后有酶切位點的消失或增加的突變進(jìn)行檢測。④p53寡核苷酸芯片69(四)基因診斷在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用通過人類遺傳基因分析來判斷父母與子女是否親生關(guān)系，稱之為親子鑒定。親子鑒定方法

目前國內(nèi)外進(jìn)行親子鑒定的試驗手段主要有：①血型檢驗（人類白細(xì)胞抗原分型）②DNA多態(tài)性檢驗親子鑒定70DNA指紋法（DNAfingerprints）提取人基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶切成不同長度的片段（各種VNTRs上都沒有酶切位點），然后以VNTRs中的特異序列為探針進(jìn)行Southern雜交，可發(fā)現(xiàn)陽性片段的長度各不相同。由于不同個體的這種串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目和位置都不相同，所以VNTRs的Southern雜交帶譜就具有高度的個體特異性，稱其為DNA指紋，可用于親子鑒定、法醫(yī)鑒定等。71在親子鑒定中，小孩的DNA指紋均可在父親或母親指紋中找到相同位置的條紋，(用黑點虛線表示)，由此可看出，子代的DNA指紋均來自父親和母親的DNA指紋，而他人的指紋、與小孩的指紋無一相符。親子鑒定72DNA指紋分析法①一個DNA指紋探針可同時檢測十幾個，甚至幾十個位點的變異，因而DNA指紋更能反映基因組的特異性；②