SNPs的檢測方法唐敏2005.8.121精選課件ppt主要內容SNPs的定義SNPs的研究意義SNPs的研究進展和方向SNPs的檢測方法2精選課件pptSNPs的定義定義：單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。(99.9%)3精選課件pptSNPs的研究意義1.SNPs作為第三代遺傳標記（已知性、可遺傳性、可檢測性），用于疾病基因的定位、克隆和鑒定。___路標的作用傳統(tǒng)研究策略（表征、蛋白、基因）逆向遺傳學（表型、基因、蛋白），4精選課件ppt2.基因多態(tài)性研究研究SNPs本身對機體的影響（生理特征、病理條件下的千差萬別）

5精選課件pptSNPs研究進展和方向1.SNPs數據庫的構建發(fā)現2.SNPs功能的研究（在1的基礎上）6精選課件pptSNPs檢測方法1.理想的檢測SNPs的方法

——發(fā)現未知的SNPs，或檢測已知的SNPs(1)靈敏度和準確度的要求（反應原理嚴緊）(2)快速、簡便、高通量(操作和分析的自動化程度高）(3)費用相對低廉7精選課件ppt2.現狀：到現在還沒有一個符合以上條件的理想方法出現,但根據實際情況,可以選擇出較合適方法。8精選課件ppt3.每種SNPs的檢測方法都可將之看成由

區(qū)分SNPs特異位點的原理方法

和

數據的檢測分析手段

兩部分組成。9精選課件pptSNPs檢測方法的分類一、區(qū)分SNPs位點的方法

1.基于雜交的方法2.基于酶的方法3.以構象為基礎的方法4.直接測序的方法二、檢測分析技術

1.凝膠分析技術2.熒光檢測技術3.DNA芯片4.質譜檢測技術10精選課件ppt1.基于雜交的方法原理:短的核苷酸探針在和互補的目的片段進行雜交時，完全匹配和有錯配兩種情況下，根據雜交復合體穩(wěn)定性的不同而將SNPs位點檢測出來。（差異越大，檢測的特異性就越好）11精選課件ppt1）利用△Tm固定溫度等位基因特異核苷酸探針(Allele-specificoligonucleotide，ASO)。修飾過的探針：引入一個錯配的堿基、PNA、

LNAs

等

動態(tài)的加熱過程——動態(tài)等位基因特異雜交(dynamicallele-specifichybridization,DASH)12精選課件ppt核酸肽探針

（Peptidenucleicacids，PNA)其骨架是肽鍵特點：1、與靶分子高特異性地結合（3個方面的影響）2、鏈擠入（形成三鏈復合結構）（表達調控以及反義治療方面）3、對核酸酶和蛋白酶均不敏感（體外應用）13精選課件ppt1、與靶分子高特異性地結合Tm值高受鹽濃度影響小（低鹽濃度的體系）△Tm更大（一個PNA堿基的錯配會使其Tm值降低8-20度）所以，PNA/DNA的非特異結合能得到很好的排除。14精選課件ppt

LNA(lockednucleicacids)其結構是在RNA分子的2′羥基和核糖環(huán)的4′碳原子間連入一個亞甲基的“橋”。特點：1.能以很高的親和性和互補的DNA、RNA或LNA結合（構象更利于雜交的穩(wěn)定）

2.匹配和不匹配的△Tm增加15精選課件pptDASH

(dynamicallele-specifichybridization）16精選課件ppt2）雜交+熒光共振分子信標（雙分子間雜交）蝎狀探針（分子內雜交）17精選課件ppt分子信標（Molecularbeacons）18精選課件ppt蝎狀探針（Scorpionprimer）19精選課件ppt2.基于酶的方法1）DNA聚合酶2）連接酶3）限制性內切酶4）外切酶FEN5）RNaseH20精選課件ppt1）DNA聚合酶等位基因特異性PCR多重等位基因特異性PCRTaqman法引物延伸法焦磷酸測序法21精選課件ppt等位基因特異性PCR22精選課件pptTaqman法23精選課件ppt微測序法/引物延伸法24精選課件ppt基本步驟（液相）1.設計PCR擴增含SNPs位點的一段DNA2.對PCR產物進行純化（去除引物和dNTP)3.引物延伸4.延伸產物檢測（放射性同位素標記法、發(fā)光檢測法、凝膠為基礎的熒光檢測法、質譜分析法、變性高壓液相色譜法等）25精選課件pptAPEX

(arrayedprimerextension)——固相26精選課件ppt焦磷酸測序法

(Pyrosequencing)DNA聚合酶、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)。原理：DNA聚合酶在一種dNTP的存在下進行引物延伸反應,而引物的成功延伸將伴隨焦磷酸的釋放,焦磷酸在熒光素酶的存在下能引一種發(fā)化學發(fā)光反應,通過發(fā)光計的實時監(jiān)測來達到檢測的目的。27精選課件ppt基本步驟1.測序引物和DNA模板雜交（PCR擴增的、單鏈的），與酶和底物孵育。2.四種dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反應體系，如與模板配對，與引物的末端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團（PPi）釋放出來。3.一系列的酶學反應，發(fā)出可見光信號。每個光信號的峰高與反應中摻入的核苷酸數目成正比。4.ATP和未摻入的dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應體系。5.然后加入下一種dNT