第3章

第2節(jié)、基因工程的基本操作程序目錄CONTENTS一二第一步：目的基因的篩選與獲取三第四步：目的基因的檢測和鑒定第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建第三步：將目的基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞四從社會中來

我國自上世紀(jì)80年代起就使用菊酯類農(nóng)藥殺滅棉鈴蟲。但到了1992年，棉鈴蟲產(chǎn)生了極強(qiáng)的耐藥性，可以在農(nóng)藥中游泳，雞吃蟲卻被毒死，從過量撒藥到人工捉蟲，傳統(tǒng)手段已經(jīng)對棉鈴蟲束手無策，不僅農(nóng)民收成全無，還產(chǎn)生了大量農(nóng)藥中毒的例子，這時(shí)候我們把目光轉(zhuǎn)向了新型的生物技術(shù)--轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。

1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟(jì)效益450億元。思考：1.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎?通過實(shí)驗(yàn)將細(xì)菌的“殺蟲基因”轉(zhuǎn)到棉花里，產(chǎn)生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。P77轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（使棉鈴蟲死亡，左）與非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（右）蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測與鑒定培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。1.目的基因2.目的基因的篩選方法（1）從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。（較為有效的方法）如科學(xué)家知道蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)并掌握了Bt基因的序列信息；Bt抗蟲蛋白只在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才表現(xiàn)出毒性，對人和牲畜無影響。（2）利用測序技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列對比工具（如BLAST）等，找到合適的目的基因。

利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增目的基因（常用）閱讀P77，獲取PCR的定義、條件、大致過程。3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取解旋酶DNA聚合酶母鏈(模板鏈)子鏈(新合成的鏈)四種脫氧核苷酸3’3’5’3’5’5’3’5’回顧：體內(nèi)DNA復(fù)制(2)條件:4種游離的脫氧核苷酸DNA的兩條鏈DNA解旋酶、DNA聚合酶等ATP(3)復(fù)制原則:堿基互補(bǔ)配對原則（A與T、C與G配對保證復(fù)制的準(zhǔn)確進(jìn)行）能量：模板：原料：酶：半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制(1)特點(diǎn):CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPDNA聚合酶作用下形成磷酸二酯鍵子鏈延伸合成的方向？只能從5′－端→3′－端延伸，細(xì)胞內(nèi)有RNA引物結(jié)合到模板3′－端引發(fā)子鏈的延伸015'端到3'端ATP1.原理：DNA半保留復(fù)制2.條件：模板（目的基因）、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、緩沖溶液（含Mg2+)3.過程：耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（dNTP）引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）5’5’變性復(fù)性延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）1）變性（不需要解旋酶）：當(dāng)溫度上升到_______以上時(shí)，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA待擴(kuò)增的DNA片段第一步：變性3’3’5’5’3’5’3’5’變性90℃思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個(gè)溫度范圍，而不是95℃？因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時(shí)，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時(shí)，所需溫度也就越低。PCR反應(yīng)的過程012）復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

第二步：復(fù)性引物1引物2DNA引物3’5’3’5’堿基互補(bǔ)配對5’5’思考：為什么需要引物？引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因?yàn)門aq酶不能從0開始添加核苷酸。②引物結(jié)合在DNA模板鏈

3'端位置，引導(dǎo)子鏈從5'端→3'端方向復(fù)制。3’3’PCR反應(yīng)的過程013）延伸：當(dāng)溫度上升到______左右時(shí)，溶液中的4種____________在耐高溫的____________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脫氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’思考1：為什么溫度要上升至72℃？思考2：Taq酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？72℃是Taq酶的最適溫度Taq酶結(jié)合在引物的3’端PCR反應(yīng)的過程01要保證目的基因能與載體相連接，還要對引物進(jìn)行什么操作？要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識別序列4.優(yōu)點(diǎn)：可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因

由于一個(gè)循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。

即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’問題探究：（1）PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因（開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段）？（2）如果循環(huán)n次，則共需消耗

個(gè)引物。

則共需消耗

對引物。2n+1－22n－1PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原則原料條件不同點(diǎn)解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子思考·討論(1)PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？不是，PCR擴(kuò)增的僅僅是兩種引物之間所對應(yīng)的特定DNA片段。(2)經(jīng)過第幾輪擴(kuò)增后，循環(huán)產(chǎn)物中出現(xiàn)位于兩種引物之間的DNA片段？

比例是多少？31/4(3)如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴(kuò)增出該目的基因的關(guān)鍵是什么？以指數(shù)方式擴(kuò)增，即2n（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。補(bǔ)充——引物設(shè)計(jì)原則P77：1.長度適當(dāng)（20-30bp）；2.引物內(nèi)部不發(fā)生堿基互補(bǔ)配對；3.引物之間不發(fā)生堿基互補(bǔ)配對；4.GC含量適宜。知識回顧（1）PCR的概念:PCR是__________________的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)__________________的原理，在______提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對________________________進(jìn)行__________的技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外目的基因的脫氧核苷酸序列大量復(fù)制DNA半保留復(fù)制（2）擴(kuò)增過程:

目的基因DNA___________后解為單鏈，_____與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；然后以__________為模板在______________作用下進(jìn)行______，即將4種____________加到_____________，如此重復(fù)循環(huán)多次。受熱變性引物延伸單鏈DNADNA聚合酶引物的3’端脫氧核苷酸每次循環(huán)一般可以分為_______、_____、_____三步。變性復(fù)性延伸4種脫氧核苷酸【實(shí)際上是4種dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）】，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，也需要引物，一般為RNA片段；PCR引物一般為DNA片段。P79·用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。cDNA【課堂練習(xí)】設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。(1）第1組：

；

第2組：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對而失效引物Ⅰ′自身內(nèi)部部分堿基發(fā)生互補(bǔ)配對而失效（2）在DNA聚合酶的作用下，兩條子鏈的延伸方向都是

。DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于

之間的DNA序列，若這個(gè)過程中消耗了引物62個(gè),則進(jìn)行了

輪的DNA復(fù)制。（3）若用PCR技術(shù)擴(kuò)增圖示目的基因，應(yīng)選用的引物是

。兩個(gè)引物從子鏈的5′端向3′端延伸5引物甲、引物丙62個(gè)引物=形成62條新單鏈=31個(gè)新DNA，加上原有的模板DNA，現(xiàn)在一共有32個(gè)DNA，即復(fù)制5次的結(jié)果。PCR中的數(shù)量關(guān)系①n代后，DNA分子有_____個(gè)；②n代后，DNA鏈有_____條；③第____代出現(xiàn)完整的目的基因；④n代后，含引物的DNA分子有_____個(gè)；⑤n代后，含其中一種引物的DNA數(shù)________；⑥n代后，兩條脫氧核苷酸等長的DNA數(shù)_______。第1代第2代第3代第4代2n2n+132n2n-12n-2n解析：等長目的基因=總DNA數(shù)-不等長的不等長的=（長鏈·中鏈）+（中鏈·短鏈）

中鏈數(shù)每次循環(huán)增加兩個(gè)，共2n個(gè)（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。目的基因＋啟動子＋終止子＋標(biāo)記基因+復(fù)制原點(diǎn)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）1.基因表達(dá)載體的目的2.基因表達(dá)載體的組成（1）啟動子：（2）終止子：（3）標(biāo)記基因：（4）復(fù)制原點(diǎn)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；①本質(zhì)：②位置：位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)；③功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；①本質(zhì)：②位置：位于基因的下游；③功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來作用：便于重組DNA分子的篩選DNA復(fù)制開始的地方，使能完成自主復(fù)制二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）2.基因表達(dá)載體的組成啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比項(xiàng)目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)_________________________位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能_________________________________________________________________________________________________________________________DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(不編碼氨基酸)載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種載體基因表達(dá)載體二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程（1）原核生物基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子：RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)終止子：終止轉(zhuǎn)錄基因的結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段非編碼區(qū)組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)（2）真核生物基因P80旁欄思考：將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡便么？如果這樣做，效果會怎樣？這種方法針對性差，完全靠運(yùn)氣也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。思考·討論使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，是否只會得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對目的基因和質(zhì)粒切割，防止目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質(zhì)粒，可得到2條DNA片段B.不能用AluⅠ酶切割質(zhì)粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶會破壞目的基因C.構(gòu)建重組DNA時(shí)，需選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時(shí)切割質(zhì)粒和外源DNAD.導(dǎo)入了重組DNA的細(xì)菌能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長而不能在含氯霉素的

培養(yǎng)基上生長√4.(2023·江蘇蘇州高二期末)某科研小組利用質(zhì)粒(圖甲)和目的基因(圖乙)構(gòu)建重組DNA。下列分析不正確的是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)（常用）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）花粉管通道法（我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪▽?dǎo)入外源DNA三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。②特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞導(dǎo)入三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法③過程：兩次拼接和兩次導(dǎo)入a.兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的

上；第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞

上。b.兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入

；

第二次導(dǎo)入（非人工操作）是指含目的基因的

導(dǎo)入受體細(xì)胞。T-DNA染色體DNAT-DNA農(nóng)桿菌1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關(guān)系？T-DNA不是目的基因，但它將來會被整合到宿主細(xì)胞染色體的DNA上，只要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞并整合到宿主細(xì)胞的染色體上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因只能進(jìn)入植物的一個(gè)體細(xì)胞，但基因工程最終要的是一個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，如何實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)？得到含有目的基因的植物細(xì)胞后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)問題探討三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞（1）導(dǎo)入方法：（2）受體細(xì)胞:顯微注射法受精卵原因：①體積大，易操作；

②易表現(xiàn)出全能性。（3）過程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）常用方法：Ca2+處理原核細(xì)胞（常選擇大腸桿菌）可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。（3）過程：（目的？）（2）受體細(xì)胞：（優(yōu)點(diǎn)？）繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)。Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收重組DNA增加細(xì)胞壁的通透性一般利用溫度變化導(dǎo)入將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法總結(jié)細(xì)胞種類植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射Ca2＋處理法(CaCl2)受體細(xì)胞受精卵或體細(xì)胞受精卵常用原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中→表達(dá)目的基因表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2+處理細(xì)胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細(xì)胞→重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中四、目的基因的檢測與鑒定

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。1.檢測與鑒定的方法分子水平的檢測個(gè)體水平的鑒定四、目的基因的檢測與鑒定（1）分子水平的檢測①電泳檢測法方法2：可以以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后再進(jìn)行電泳檢測。設(shè)計(jì)PCR的一對引物時(shí)，最好一個(gè)引物與質(zhì)粒DNA互補(bǔ)結(jié)合，另一個(gè)引物與目的基因DNA互補(bǔ)結(jié)合，這樣只有以重組DNA為模板才能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物（也可以都跟目的基因互補(bǔ)結(jié)合，這樣只有含有目的基因，才能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物），之后再進(jìn)行電泳檢測；方法1：體細(xì)胞中的質(zhì)粒直接進(jìn)行電泳檢測或者選擇合適的限制酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切后再進(jìn)行電泳檢測，同時(shí)可借助指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物來進(jìn)一步確認(rèn)目的基因。方法3：提取受體細(xì)胞的mRNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，用上述方法2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后再進(jìn)行電泳檢測；重組質(zhì)粒四、目的基因的檢測與鑒定（1）分子水平的檢測②核酸雜交檢測法（原理）

在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交（遵循堿基互補(bǔ)配對原則），若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因插入成功或轉(zhuǎn)錄出mRNA。四、目的基因的檢測與鑒定（1）分子水平的檢測③抗原-抗體雜交技術(shù)在抗原-抗體雜交中，目的蛋白是作為抗原還是抗體？

從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質(zhì)。抗原蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交脫分化四、目的基因的檢測與鑒定（2）個(gè)體水平的檢測轉(zhuǎn)基因生物檢測方法觀察目標(biāo)抗蟲植物害蟲吞食害蟲是否死亡抗病植物病毒(菌)感染是否出現(xiàn)病斑抗鹽植物鹽水澆灌是否正常生長抗除草劑植物噴灑除草劑是否正常生長獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物提取細(xì)胞產(chǎn)物，與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較細(xì)胞產(chǎn)物的功能活性是否正常1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細(xì)胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（

）（2）構(gòu)建含有afp基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。（

）（3）只要檢測出番茄細(xì)胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功。（

）√××練習(xí)與應(yīng)用(P83)2.利用PCR既可以快速擴(kuò)增特定基因，也可以檢測基因的表達(dá)。下列有關(guān)PCR的敘述

錯(cuò)誤的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶C.復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對原則D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸D一、概念檢測研究人員在研究轉(zhuǎn)基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)44株轉(zhuǎn)基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德爾遺傳規(guī)律，在它們的自交后代中出現(xiàn)了較多的沒有卡那霉素抗性的植株。請查找相關(guān)資料，嘗試對這個(gè)問題作出解釋。二、拓展應(yīng)用外源基因插入基因組中可能為單位點(diǎn)插入，或者同一染色體多位點(diǎn)插入，或者不同染色體多位點(diǎn)插入。大多數(shù)情況下，插入的位點(diǎn)難以做到定點(diǎn)插入；插入的拷貝數(shù)也是隨機(jī)的。因此，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳是很復(fù)雜的。例如，科研人員在對轉(zhuǎn)GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的煙草進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株的染色體DNA中整合了多個(gè)拷貝的基因，從而導(dǎo)致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性。探究·實(shí)踐

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.PCR在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增原理：DNA的熱變性原理;DNA半保留復(fù)制的原理。2.DNA片段的擴(kuò)增過程：移液用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分

離心待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）反應(yīng)參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min可根據(jù)目的片段長度適當(dāng)調(diào)整延伸時(shí)間預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。(4)如何對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？瓊脂糖凝膠電泳P84必修二P52DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個(gè)過程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外