一、任務來源本國家標準的制定任務列入國家標準化管理委員會計劃項目，項目編號為20182192-T-424。本項目由中國標準化研究院提出并歸口，定于2019年完成。本標準起草工作由河北醫(yī)科大學等單位共同完成。二、標準制定目的及意義DNA甲基化是DNA的一種序列修飾，即胞嘧啶發(fā)生了一個甲基基團的修飾。哺乳細胞中，甲基化主要發(fā)生在CG中的胞嘧啶（C）上，而植物細胞中胞嘧啶甲基化的形式更為廣泛。多項研究表明，DNA序列雖然未發(fā)生改變，但DNA甲基化能修飾會引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而影響基因的表達；同時，DNA甲基化是個可逆的過程，通常DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，而去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。焦磷酸測序可具體分析DNA甲基化程度，可對每個CpG或CpN進行甲基化定量，無需克隆就能獲得可靠、高靈敏度的結(jié)果；分析速度快，幾小時就能獲得定量結(jié)果。在醫(yī)療診斷、法醫(yī)檢測、及植物研究中均有重要應用。研究顯示，腫瘤的發(fā)生和生長與DNA甲基化的變化有關(guān)。采用焦磷酸測序定量檢測DNA甲基化水平，可以對癌癥進行早期篩查，對腫瘤進行分類，并可預測、監(jiān)控藥物治療反應。在法醫(yī)常規(guī)工作中，經(jīng)常會碰到無法和數(shù)據(jù)庫配對的犯罪嫌疑人或受害者檢身份信息的情況，而焦磷酸測序通過甲基化位點檢測，能為犯罪嫌疑人或受害者的年齡鑒定提供更準確的判定標準。測序準確率高，可以大大地縮小篩選的范圍，提供一個更加客觀的年齡判定標準。在植物科學研究中，常需要鑒別純合子、雜合子和多倍體不同雜合狀態(tài)，焦磷酸測序技術(shù)可以靈敏地對甲基化頻率進行快速定量，且焦磷酸測序不僅可以檢測CpG甲基化位點，還可以檢測非CpG甲基化位點，適用于植物研究。三、標準制定原則和依據(jù)嚴格按照GB1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》的要求，制定該項國家標準。四、主要工作過程主要起草單位河北醫(yī)科大學開展的主要工作過程如下：1、2017年1月，組成標準起草工作組，安排了工作進度。2、2017年1月~2017年3月，起草工作組查閱了國內(nèi)外有關(guān)標準中關(guān)于此方法的規(guī)定，調(diào)研了國內(nèi)外有關(guān)DNA甲基化檢測方法的情況，起草了標準討論稿。3、2017年4月，標準起草工作小組對標準討論稿進行了討論，形成第二輪標準討論稿。4、2017年5月，征求專家意見，形成第三輪標準討論稿。5、2017年3月~2017年11月，對目前多種DNA甲基化檢測方法進行驗證。6、2017年12月，召開標準研制推進會，對標準研制過程中的問題進行討論，商討解決方案。7、2018年1月，標準起草工作組邀請專家對標準討論稿提出意見。8、2018年2月~2018年5月，進一步對標準討論稿進行修訂，形成標準草案。9、2018年10月，本標準經(jīng)國家標準化管理委員會批準，獲得立項。10、2018年10月，完成標準征求意見稿和編制說明的初稿。11、2018年11月，完成第三方論證，召開專家征求意見會，進行充分討論，進一步根據(jù)專家意見修改和完善征求意見稿。13、2018年12月~2019年2月，向全社會征求意見，并向中國科學院、中國農(nóng)科院、清華大學、北京大學、中國醫(yī)科大學、首都醫(yī)科大學、河北省食品監(jiān)督檢驗研究院、河北師范大學、河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院、河北省人民醫(yī)院、凱杰生物技術(shù)（中國）有限公司等高校、科研院所、企業(yè)、政府單位發(fā)函征求意見。截至到2019年3月1日，共收到7封意見書。編寫組對意見進行認真研究，采納40條，未采納3條，并對文中相應部分進行了修改與完善，形成了標準送審稿。14、2019年5月，中國標準化研究院組織專家進行審查。五、主要技術(shù)內(nèi)容在本標準制定過程中，隨著研究的深入，先后完成標準討論稿、草案和標準征求意見稿，標準內(nèi)容不斷完善，并趨于科學合理。根據(jù)需要，本標準的主要技術(shù)內(nèi)容確定為：（一）前言部分。給出了標準的起草原則、歸口單位、起草單位及主要起草人。（二）范圍。給出了本標準的適用范圍。（三）縮略語。給出了本標準中用到的縮略語。（四）術(shù)語和定義。給出了本標準中用到的相關(guān)術(shù)語及其定義。（五）試劑和材料。給出了本標準中用到的化學試劑、緩沖液、試劑盒等。（六）儀器設(shè)備。給出了本標準所需的儀器和設(shè)備。（七）主要技術(shù)內(nèi)容的說明1、樣品的選擇陽性樣品：完全甲基化的樣本陰性樣品：無甲基化的樣本測試標本——前列腺組織、精液、前列腺癌組織、乳腺組織、膠質(zhì)母細胞瘤、食管上皮細胞、煙草BY-2懸浮細胞、白細胞、血液、唾液等2、PCR升降溫溫度優(yōu)化PCR擴增是焦磷酸測序的重要步驟，其中模板DNA的添加量、PCR程序設(shè)置等，均會影響焦磷酸測序的成功與否。在法醫(yī)檢測領(lǐng)域，由于案件檢測的模板核酸含量很少且珍貴，因此很難對模板添加量進行優(yōu)化，這就尤其需要對PCR擴增的程序進行選擇，以達到最佳的擴增效果。我們針對PCR的變溫速度設(shè)計梯度實驗，分別設(shè)計1℃/s、2℃/s和3℃/s。實驗模板采用精液樣本，檢測精液的標記基因ZC3H12D。使用EZ1DNAInvestigator?Kit核酸提取試劑盒提取DNA，并用AppliedBiosystems?Quantifiler?TrioKi進行核酸定量。亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化采用EpiTect?FastDNABisulfiteKit試劑盒，程序見表1：表1.EpiTect?FastDNABisulfiteKit亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化程序轉(zhuǎn)化后的核酸利用QIAcube儀器進行純化，獲得高質(zhì)量的核酸，以進行后續(xù)PCR擴增。使用一對擴增引物（其中一條有生物素標記）進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物。擴增程序見表2：表2.PyroMarkQ48采用的PCR擴增程序?qū)U增產(chǎn)物和所需試劑加入焦磷酸測序儀中，儀器自動進行測序引物的分配，并實時監(jiān)測測序過程，焦磷酸測序結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，核酸通過低變溫速度PCR擴增，其標記基因ZC3H12D甲基化頻率可以被焦磷酸測序儀更穩(wěn)定的檢測，獲得更優(yōu)的結(jié)果。而使用高變溫速度進行PCR擴增，會影響焦磷酸測序?qū)Φ皖l甲基化的檢測，對于標記基因ZC3H12D的5個甲基化位點的判斷定量結(jié)果穩(wěn)定性變差。因此，對于受核酸含量限制的檢材檢測而言，在檢測低頻甲基化時，推薦使用低變溫速度PCR進行擴增。圖1.采用不同PCR變溫速度所得的焦磷酸測序峰圖。較高的變溫速度（3℃/s）對ZC3H12DJIA的5個甲基化位點的定量偏高或偏低，而較低的變溫速度（1℃/s）可獲得更穩(wěn)定的定量結(jié)果。3、靈敏度檢測為了分析焦磷酸測序?qū)怂釞z測的靈敏度，使用從精液樣本中提取的DNA，梯度稀釋后進行焦磷酸測序。結(jié)果如圖2所示，焦磷酸測序可以檢測低至0.05ng的DNA，但是定量檢測結(jié)果與實際結(jié)果相比略有差異，可能是由于極微量的核酸導致焦磷酸測序的特異性和準確性有所降低。而使用0.1ng的DNA上樣，可以獲得準確的甲基化頻率檢測。此外，使用更低的DNA含量——0.01ng，則焦磷酸測序無法檢出。實驗表明，此項研究中焦磷酸測序的DNA檢測靈敏度一般可達0.05ng~0.1ng。圖2.添加不同DNA量得到的焦磷酸測序結(jié)果。A.0.1ngDNA添加量；B.0.05ngDNA添加量；C.0.01ngDNA添加量4、方法的重復性驗證在前列腺癌biomarker研究中，選擇無甲基化的前列腺組織樣本，利用QIAGENQIAampDNAMinikit進行核酸提取，隨后進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化及PCR，設(shè)置三個重復，分別的檢測結(jié)果如圖3所示。由圖可見，三個重復孔的對待檢位點的判讀均為2%，說明方法的重復性良好。圖3.焦磷酸測序?qū)o甲基化樣本的定量重復性的驗證此外，我們以O(shè)ligo（寡核苷酸）標準品為實驗材料，進一步對焦磷酸測序的重復性進行了驗證。具體過程和結(jié)果如下：（1）性能指標：對0.5pmol和2pmol的兩組Oligo（寡核苷酸）樣本分別進行檢測，每組Oligo包括%C含量不同的3份樣本（A(5%)、B(95%)、C(50%)），每份樣本分別重復測定10次，計算每份樣本測定結(jié)果的標準差(SD)，SD≤3%。注：%C指寡核苷酸某一堿基位點上胞嘧啶的含量。（2）檢測方法：使用QIAGENGmbH生產(chǎn)的Oligo驗證試劑盒，根據(jù)試劑盒操作程序?qū)Ω鞣N濃度樣本（A、B、C）進行檢測，每一濃度重復檢測10孔(各濃度滴入孔中的排序應嚴格按照說明書中的表格操作)，計算其在0.5pmol和2pmolOligo濃度下的測得值標準差SD，結(jié)果應符合2.2的要求。（3）檢測結(jié)果：A.0.5pmolOligo檢測結(jié)果：C%A0.025B0.025C0.025A0.025B0.025C0.025bias&repeatibility7.7890.8351.68.9592.1155.989.8292.8453.28.069351.278.8492.5951.279.0192.3452.629.5192.8552.277.6692.153.1510.2792.7752.548.792.3555.03mean8.8692.3852.89重復性STDEV0.860.631.56passedpassedpassedB.2pmolOligo檢測結(jié)果：C%A0.1B0.1C0.1A0.1B0.1C0.1bias&repeatibility6.0794.1253.475.2894.9653.646.1394.452.525.2694.8351.625.8694.3253.265.8895.1652.055.5694.8851.677.495.1851.82695.5952.75.8294.852.28mean5.9394.8252.50重復性STDEV0.600.440.75passedpassedpassed進一步的研究結(jié)果表明，焦磷酸測序可以對不同甲基化頻率準確定量。實驗分別使用無甲基化的DNA和完全甲基化的DNA（EpiTectControlDNAs）進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，并針對p16基因進行PCR擴增，然后按照不同比例混合兩種PCR產(chǎn)物，得到不同甲基化含量（0%~100%）的樣本，隨后使用焦磷酸測序儀定量檢測甲基化，結(jié)果如圖4所示。其中，淺藍色正方形圖示為真實甲基化頻率，深藍色三角形圖示為焦磷酸測序定量結(jié)果，分析表明，焦磷酸測序的定量結(jié)果與真實甲基化頻率之間存在非常好的線性關(guān)系，相關(guān)指數(shù)R2=0.9962。焦磷酸測序焦磷酸測序甲基化定量結(jié)果（%）混合物中甲基化DNA的真實比例（%）圖4.焦磷酸測序的定量結(jié)果與真實甲基化頻率之間有很好的線性關(guān)系5、方法的適用性焦磷酸測序可用于多個應用領(lǐng)域。在表觀遺傳學領(lǐng)域，DNA甲基化與腫瘤癌癥、胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)，焦磷酸測序也被應用于相關(guān)樣本的甲基化檢測，如檢測乳腺組織中ALKBH3基因甲基化，用于乳腺癌相關(guān)研究；檢測FFPE樣本中MGMT啟動子甲基化，用于膠質(zhì)母細胞瘤患者生存率研究；檢測食管上皮細胞中EPB41L3基因甲基化，用于食管鱗癌潛在治療靶點研究。此外，焦磷酸測序也用于檢測Val158Met(rs4680)甲基化水平變化與精神分裂癥患者的暴力行為的關(guān)聯(lián)；研究MMP-9CpG島甲基化水平與慢性牙周炎的嚴重程度的關(guān)聯(lián)；研究白細胞中ACSL4（CG1553655）基因甲基化與非酒精性脂肪肝的關(guān)聯(lián)等。在法醫(yī)研究領(lǐng)域，焦磷酸測序檢測從血液、唾液、精液及上皮組織中提取基因組DNA，用于年齡預測模型的構(gòu)建，以及物證組織源性分析。在植物研究領(lǐng)域，焦磷酸測序檢測煙草BY-2懸浮細胞中DNA甲基化，用于植物次級代謝產(chǎn)物與細胞毒性的機制研究等。下圖列舉了焦磷酸測序?qū)Σ糠謽颖绢愋偷臋z測結(jié)果。圖5.焦磷酸測序檢測血液中DNA甲基化圖6.焦磷酸測序檢測血斑中DNA甲基化圖7.焦磷酸測序檢測動物組織中DNA甲基化總之，焦磷酸測序作為甲基化定量檢測的技術(shù)手段，應用范圍廣，其特異性強、靈敏度高、重復性好，可分析連續(xù)多個甲基化位點，對于低頻甲基化位點也能有效檢測。而焦磷酸測序的成功實施，會受到很多因素的影響，如PCR引物和測序引物設(shè)計、模板DNA的添加量、PCR程序的設(shè)置等，在遵循引物設(shè)計原則下，對特定項目進行優(yōu)化和實驗，可獲得最佳的甲基化定量結(jié)果。六、驗證情況及結(jié)果分析為了進一步完善和確定檢驗方法，標準起草工作組分別委托中國科學院、中國農(nóng)科院、河北師范大學、河北省人民醫(yī)院和河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院五家單位對標準進行驗證，驗證結(jié)果表明該方法可靠、重復性好、可操作性強，詳細驗證報告見附件。七、與有