第2章細(xì)胞工程首個(gè)體細(xì)胞克隆動(dòng)物克隆動(dòng)物多莉羊體細(xì)胞克隆猴“中中”和“華華”如何能讓名貴的蘭花大量、快速地繁殖？【重溫】植物體細(xì)胞雜交的過(guò)程A細(xì)胞B細(xì)胞纖維素酶果膠酶①去壁：酶解法正在融合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁②誘融物理法化學(xué)法電融合法、離心法聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+

—高pH融合法等脫分化再分化移栽植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)雜種植株愈傷組織A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體移栽后的植株雜種細(xì)胞那么，有沒(méi)有技術(shù)能讓不同種動(dòng)物的體細(xì)胞進(jìn)行雜交，培育出集不同細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)于一身的動(dòng)物細(xì)胞呢？物體細(xì)胞雜交技術(shù)的優(yōu)勢(shì)：打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育了植物新品種。第2節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程01動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)目錄/CONTENTS二、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體01動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)1.概念：2.誘導(dǎo)原理和結(jié)果：原理？結(jié)果？使兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性融合形成雜交細(xì)胞具有原來(lái)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的遺傳信息。3.誘導(dǎo)融合的常用方法：與植物原生質(zhì)體融合的方法相同物理方法：電融合法、離心法化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）融合法生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法動(dòng)物細(xì)胞融合特有【問(wèn)題探究1】滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理（1）滅活？（2）滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理是什么？病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。失去感染性保留抗原性動(dòng)物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志？細(xì)胞核的融合【問(wèn)題探究2】19世紀(jì)30年代，科學(xué)家曾在患肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中，觀察到多核細(xì)胞。如何解釋這一現(xiàn)象？肺結(jié)核病人病理切片病人體內(nèi)的病毒等誘導(dǎo)多個(gè)體細(xì)胞融合形成了多核細(xì)胞。4.意義：突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。5.應(yīng)用：（1）細(xì)胞融合技術(shù)已經(jīng)成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。（2）利用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來(lái)的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。至今，種間、屬間、科間，甚至動(dòng)植物之間融合都已獲得了成功。生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代酵母菌—雞原生質(zhì)體—血紅細(xì)胞1975年人—胡蘿卜腹水癌細(xì)胞—原生質(zhì)體1976年人—小鼠纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞1978年6.動(dòng)物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交的比較比較植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理

步驟酶解法去掉

后，誘導(dǎo)

融合，形成

，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)形成

。

分散成

后誘導(dǎo)細(xì)胞融合，形成

。

方法聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2＋—高pH融合法、電融合法、離心法PEG融合法、電融合法、

誘導(dǎo)法結(jié)果形成？

形成

，以生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)品意義打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種突破有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞壁原生質(zhì)體雜種細(xì)胞雜種植株單個(gè)細(xì)胞雜交細(xì)胞滅活病毒雜種植株雜交細(xì)胞（1）與植物原生質(zhì)體融合相比，動(dòng)物細(xì)胞融合特有的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇（PEG）、滅活的病毒

（

）

（2）滅活的含義是用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)

（

）

（3）二倍體動(dòng)物細(xì)胞融合后的雜交細(xì)胞仍然是二倍體細(xì)胞

（

）判斷?？颊Z(yǔ)句，澄清易混易錯(cuò)01動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)目錄/CONTENTS二、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體1.傳統(tǒng)抗體的獲得方法（1）分泌細(xì)胞

化學(xué)本質(zhì)分布？漿細(xì)胞蛋白質(zhì)主要分布在血清中，少量分布于組織液和外分泌液中（2）獲取方法：向動(dòng)物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動(dòng)物產(chǎn)生抗體，然后從動(dòng)物血清中分離所需抗體。（3）缺點(diǎn)：產(chǎn)量低、純度低、特異性差。血清抗體如何解決？2．單克隆抗體的制備思路（1）B淋巴細(xì)胞特點(diǎn)：①哺乳動(dòng)物感染病原體后，體內(nèi)會(huì)形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞能分泌抗體，抗體識(shí)別并特異性結(jié)合病原體，從而抑制病原體的增殖等。實(shí)質(zhì)是漿細(xì)胞②動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類超過(guò)百萬(wàn)種，但每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。③要想獲得大量單一抗體，必須克隆（大量增殖）單一的B淋巴細(xì)胞，形成細(xì)胞群。④面臨困難：在體外培養(yǎng)條件下，一個(gè)B淋巴細(xì)胞是不可能無(wú)限增殖的。如何解決這一難題？（2）骨髓瘤細(xì)胞特點(diǎn)：在體外培養(yǎng)條件下，能大量增殖。英國(guó)：米爾斯坦德國(guó)：科勒由于發(fā)明了單克隆抗體的制備技術(shù)，于1984年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。大膽設(shè)想一種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（能產(chǎn)生抗體）（能大量增殖）融合細(xì)胞（既能產(chǎn)生抗體，又能大量增殖）（3）雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)：B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合得到的雜交瘤細(xì)胞，既能大量增殖，又能產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體。單克隆抗體：由單個(gè)B淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)克?。o(wú)限增殖），形成基因型相同的細(xì)胞群，由這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體。3．單克隆抗體的制備過(guò)程注射特定的抗原進(jìn)行免疫培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞從脾中提取多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合能產(chǎn)生抗體，但不能大量增殖不能產(chǎn)生抗體，但能大量增殖PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法【問(wèn)題探究3】過(guò)程分析①不注射抗原，直接提取B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，能得到單克隆抗體嗎？給小鼠注射特定抗原的目的是什么？②誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有？能從該小鼠的脾中得到可以產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞。不能實(shí)質(zhì)是漿細(xì)胞物理方法：電融合法化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）融合法特有生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合多種雜交細(xì)胞③若只考慮細(xì)胞的兩兩融合，融合形成的細(xì)胞有幾種？需要的是？B-B細(xì)胞B-瘤細(xì)胞瘤-瘤細(xì)胞3種雜交瘤細(xì)胞【延伸】若只考慮細(xì)胞的兩兩融合，培養(yǎng)液中共會(huì)出現(xiàn)幾種細(xì)胞？5種融合的細(xì)胞3種未融合的細(xì)胞2種誘導(dǎo)融合多種雜交細(xì)胞第一次篩選用特定的選擇培養(yǎng)基在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）⑤資料分析：a.細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基蝶呤阻斷。b.免疫的B淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但它不能分裂增殖，其本身

也不能在體外長(zhǎng)期存活。c.鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒(méi)有S途徑，但它能不

斷分裂增殖。如果它的D途徑被阻斷的話，它會(huì)因不能合成DNA而死。請(qǐng)根據(jù)上述資料提出篩選出雜交瘤細(xì)胞的方法？培養(yǎng)基中加入氨基蝶呤。雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量增殖又能產(chǎn)生抗體第二次篩選克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞（分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合）能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)多次篩選克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(cè)？多孔細(xì)胞培養(yǎng)板96孔板每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞①將雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過(guò)一個(gè)，通過(guò)培養(yǎng)讓其增殖。②然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。③陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來(lái)自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。檢測(cè)原理？抗原—抗體雜交技術(shù)多孔細(xì)胞培養(yǎng)板陽(yáng)性克隆的篩選和克隆化培養(yǎng)用培養(yǎng)液有限稀釋克隆化培養(yǎng)抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi)體外培養(yǎng)單克隆抗體從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取從小鼠腹水中提取體內(nèi)培養(yǎng)⑧★雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn)？既能無(wú)限增殖，又能分泌特異性抗體具備兩種細(xì)胞的遺傳物質(zhì)特異性強(qiáng)，靈敏度高，可大量制備4.單克隆抗體制備過(guò)程中兩次篩選的比較項(xiàng)目第一次篩選第二次篩選篩選原因誘導(dǎo)融合后得到多種融合細(xì)胞，還有未融合的細(xì)胞等由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞篩選目的篩選出？

篩選出

的雜交瘤細(xì)胞篩選方法用特定的選擇培養(yǎng)基篩選：未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)

，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能

。

用96孔板培養(yǎng)，在每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和

，經(jīng)多次篩選得到足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞能分泌所需抗體死亡抗體檢測(cè)生長(zhǎng)應(yīng)用到的技術(shù)？原理？細(xì)胞膜的流動(dòng)性多種雜交細(xì)胞及未融合的細(xì)胞誘導(dǎo)

融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞給小鼠注射特定抗原提取雜交瘤細(xì)胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選足夠數(shù)量的能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔大量單克隆抗體克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(cè)（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）（能產(chǎn)生抗體）（能無(wú)限增殖）從腹腔液中提取從培養(yǎng)液中提?。ㄟM(jìn)行多次）動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞增殖單克隆抗體制備過(guò)程單克隆抗體制備過(guò)程【思考?討論】單克隆抗體的應(yīng)用【資料1】用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來(lái)的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對(duì)胎兒造成不利影響。該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確率在90%以上?？谷私q毛膜促性腺激素單克隆抗體單克隆抗體被廣泛用作診斷試劑抗體藥物接頭ADC被細(xì)胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細(xì)胞凋亡【資料2】使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。但細(xì)胞毒素沒(méi)有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會(huì)對(duì)健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用?？贵w-藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugates,ADC）通過(guò)將細(xì)胞毒素與能特異性識(shí)別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細(xì)胞毒素)三部分組成，它的作用機(jī)制如下圖所示。抗體藥物接頭ADC被細(xì)胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細(xì)胞凋亡討論1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過(guò)特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞；藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細(xì)胞。“生物導(dǎo)彈”討論2.除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？討論3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢(shì)？①可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療；①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測(cè)的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒；②ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識(shí)別的靶向作用和細(xì)胞毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。②一些作用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路來(lái)抑制其生長(zhǎng)，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療。5．★單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)（1）能準(zhǔn)確地識(shí)別抗原的細(xì)微差異；（2）與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合；（3）可以大量制備。6．單克隆抗體的應(yīng)用（1）廣泛用作診斷試劑利用同位素或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。乙肝測(cè)定試劑艾滋病檢測(cè)試劑（2）運(yùn)載藥物：如抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）。生物導(dǎo)彈=單克隆抗體+藥物，治療腫瘤(單抗導(dǎo)向，藥物為彈頭)優(yōu)點(diǎn)：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用?。?）直接用于治療疾病。實(shí)例：利妥昔單抗(美羅華)是一種針對(duì)CD20抗原的人鼠嵌合型單克隆抗體，是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)用于臨床治療的單抗。進(jìn)入人體后能通過(guò)介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性作用、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用和抗體與CD20分子結(jié)合引起的直接效應(yīng)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，改變細(xì)胞周期以及凋亡等方式殺死淋巴瘤細(xì)胞。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，單克隆抗體藥物占有非常重要的地位。（1）B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后，得到的都是雜交瘤細(xì)胞（

）（2）單克隆抗體制備過(guò)程中兩次篩選的目的相同（

）（3）ADC的抗體具靶向運(yùn)輸作用、藥物具有治療作用（

）判斷常考語(yǔ)句，澄清易混易錯(cuò)【網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建】練習(xí)與應(yīng)用一、概念檢測(cè)1.下列有關(guān)動(dòng)物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交比較的敘述，錯(cuò)誤的是（）A.它們的原理都涉及細(xì)胞膜的流動(dòng)性B.都可以用電融合法或PEG融合法誘導(dǎo)融合C.融合前都需用纖維素酶或果膠酶處理細(xì)胞D.前者主要是為了獲得細(xì)胞產(chǎn)品，后者主