DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)?；蚬こ淘噭〥NA粗提取3.1.1重組DNA技術(shù)的基本工具

學(xué)習(xí)目標(biāo)1.通過(guò)課堂合作探究和模擬構(gòu)建重組DNA的過(guò)程，說(shuō)出合成新的DNA分子的基本原理，闡明重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具及其作用（科學(xué)探究、科學(xué)思維）。2.通過(guò)資料分析和思考討論認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開(kāi)理論研究和技術(shù)創(chuàng)新，關(guān)注基因工程的社會(huì)議題（生命觀念、社會(huì)責(zé)任）。3.進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定的實(shí)驗(yàn)，掌握相關(guān)的實(shí)驗(yàn)原理和技能（科學(xué)探究）。學(xué)習(xí)重難點(diǎn)教學(xué)重點(diǎn)：重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具的作用；教學(xué)難點(diǎn)：基因工程載體需要具備的條件。從社會(huì)中來(lái)番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降?？茖W(xué)家通過(guò)精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御環(huán)斑病毒。

討論：DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專(zhuān)門(mén)的“分子工具”?？茖W(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？從社會(huì)中來(lái)培育轉(zhuǎn)基因番木瓜，需要在體外對(duì)所需要的DNA分子進(jìn)行切割、改造和“拼接”，然后將重組的DNA分子導(dǎo)入番木瓜體細(xì)胞內(nèi)，使其在細(xì)胞中表達(dá)。

切割分子縫合針——DNA連接酶；分子手術(shù)刀——限制性?xún)?nèi)切核酸酶；

拼接

導(dǎo)入分子運(yùn)輸車(chē)——載體。按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品叫做基因工程，由于是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，又叫作重組DNA技術(shù)。PART01限制性?xún)?nèi)切核酸酶●限制酶作用●限制酶識(shí)別特點(diǎn)●限制酶名字由來(lái)限制性?xún)?nèi)切核酸酶限制性?xún)?nèi)切核酸酶，簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶；根據(jù)你所掌握的知識(shí)，推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的；名稱(chēng)來(lái)源作用能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中的特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。原核生物容易受到自然界外源DNA入侵，在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成了一套完善的防御體系，當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶切割外源DNA使之失效，保證自身安全。限制性?xún)?nèi)切核酸酶限制性?xún)?nèi)切核酸酶，簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶；為什么限制酶不切割自身的DNA？主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的；名稱(chēng)來(lái)源作用限制酶智能識(shí)別特定的核苷酸序列，由于原核生物DNA中沒(méi)有與限制酶相應(yīng)的識(shí)別序列，所以不會(huì)被切割。能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中的特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。限制性酶識(shí)別特點(diǎn)識(shí)別序列一般由6個(gè)核苷酸組成；有少數(shù)識(shí)別4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成；識(shí)別特點(diǎn)黏性末端和平末端；識(shí)別結(jié)果CAAAACGTTTTGAACTTGCAATTGGGCCCCCGGGGCCCCGGGGGCCGCEcoRI在G和A之間切割SmaI在G和C之間切割黏性末端平末端限制性酶識(shí)別特點(diǎn)CAAAACGTTTTGAACTTGCAATTGGGCCCCCGGGGCCCCGGGGGCCGCEcoRI在G和A之間切割SmaI在G和C之間切割黏性末端平末端黏性末端——當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開(kāi)時(shí)產(chǎn)生的。平末端——當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線處將DNA分子的兩條鏈分別切開(kāi)時(shí)產(chǎn)生的。限制酶名字的由來(lái)限制酶的命名：生物屬名的頭一個(gè)字母+種加詞的頭兩個(gè)字母資料卡表示從哪種生物中分離出來(lái)的例如：EcoRI大腸桿菌（Escherichiacoli）

屬名種名分離的第一種限制酶R型菌株P(guān)ART02DNA連接酶——“分子縫合針”●DNA連接酶●DNA連接酶&DNA聚合酶DNA連接酶DNA連接酶：能夠?qū)蓚€(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶。從大腸桿菌種分離得到的，稱(chēng)為E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶既能“縫合”黏性末端，也能“縫合”平末端，但連接平末端效率較低。從T4噬菌體中分離出來(lái)的，稱(chēng)為T(mén)4DNA連接酶

種類(lèi)E.coliDNA連接酶只能連接具有黏性末端的DNA片段；

作用恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵，將DNA雙鏈”縫合”起來(lái)。DNA連接酶&DNA聚合酶DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？不是比較項(xiàng)目DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用部位化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板接DNA鏈作用實(shí)質(zhì)作用結(jié)果用途DNA連接酶&DNA聚合酶DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？不是比較項(xiàng)目DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用部位DNA的磷酸二酯鍵化學(xué)本質(zhì)蛋白質(zhì)不同點(diǎn)模板不需要需要接DNA鏈雙鏈單鏈作用實(shí)質(zhì)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個(gè)脫氧核苷酸加到已存在的核苷酸鏈3’端，形成磷酸二酯鍵作用結(jié)果連接兩個(gè)DNA片段形成DNA子鏈用途基因工程DNA復(fù)制PART03基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體●質(zhì)粒●載體的特點(diǎn)常用載體——質(zhì)粒質(zhì)粒通常作為載體將外源基因送入細(xì)胞。一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。

概念：

特點(diǎn)：具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段插入；進(jìn)入受體細(xì)胞中可自我復(fù)制或整合到受體DNA上隨受體DNA同步復(fù)制；具有標(biāo)記基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于重組DNA分子篩選。載體的特點(diǎn)在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改造的。載體需要滿足以下特點(diǎn)：（1）有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；（2）能夠在受體細(xì)胞中自我復(fù)制或整合到受體細(xì)胞DNA上隨受體DNA同步復(fù)制；（3）帶有標(biāo)記基因（可以改造加入）；（4）對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害。除質(zhì)粒外，還有噬菌體、動(dòng)植物病毒也可以作為載體，它們被比喻為“分子運(yùn)輸車(chē)”。思考?討論：重組DNA分子請(qǐng)?jiān)趦蓮埣埳戏謩e寫(xiě)上下列兩段DNA序列：兩條片段時(shí)有EcoRI的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，用剪刀進(jìn)行切割，待切割位點(diǎn)全部切開(kāi)后，將下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那段DNA鏈的切口處，用透明膠條將切口粘連起來(lái)。5’-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3’3’-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5’5’-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3’3’-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5’思考?討論：重組DNA分子5’-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3’3’-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5’5’-ATAGCATGCTATCCATG-3’3’-TATCGTACGATAGGTACTTAA-5’5’-AATTCGGCATAC-3’3’-GCCGTATG-5’第一步：找到識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，進(jìn)行切割思考?討論：重組DNA分子5’-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3’3’-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5’5’-TCCTAG-3’3’-AGGATCTTAA-5’5’-AATTCCATAC-3’3’-GGTATG-5’5’-AATTCTCGGTATG-3’3’-GAGCCATACTTAA-5’片段1片段2片段3思考?討論：重組DNA分子5’-ATAGCATGCTATCCATG3’-TATCGTACGATAGGTACTTAAAATTCGGCATAC-3’GCCGTATG-5’AATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAA第二步：拼接AATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAA1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶，透明膠條代表DNA連接酶。思考?討論：重組DNA分子3.你插入的DNA片段能稱(chēng)得上一個(gè)基因嗎？基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段，而剪切下來(lái)的DNA片段不一定是一個(gè)完整的基因；一個(gè)基因的長(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基以上，而我們插入的DNA片段很短，也不能構(gòu)成一個(gè)基因。