蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第1頁

已知某蛋白分子量約為17kDa，等電點3.9~4.1，它能耐一定高溫，在90C加熱3~4min后依然能夠保持80%活性。該蛋白含有較多疏水性殘基，與Ca2+結(jié)合后能夠暴露它疏水基團。該蛋白作用是作為生物體內(nèi)酶激活劑。請設(shè)計一個從腦組織中提取和分離純化該蛋白試驗方案，要求寫出詳細步驟和理由，以及檢測方法。蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第2頁文件查得：鈣調(diào)蛋白（CaM）是由148個氨基酸組成單鏈分子,其pI值在3.9-4.1之間,分子量約為17KDa.該蛋白能夠耐一定高溫，在90oC加熱3-4min后依然能夠保持80%活性。該蛋白分子中含有較多疏水性殘基，與Ca2+結(jié)合后能夠暴露出它疏水基團。蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第3頁整個試驗過程普通可分為5個階段：

①材料選擇和預(yù)處理②細胞破碎（有時需進行細胞器分離）③提?、芗兓ò入婞c沉降法，鹽析，有機溶劑沉淀，吸附、層析、等）⑤分析判定。蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第4頁一、材料選定：大鼠腦組織預(yù)處理：將切取組織用4℃預(yù)冷0.01mol/lPBS漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留PBS（磷酸鹽緩沖液

）。試驗步驟：蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第5頁二、a細胞破碎⑴機械方法主要經(jīng)過機械切力作用使組織細胞破壞。常見器械有：①玻璃勻漿器（用兩個磨砂面相互摩擦，將細胞磨碎）②高速組織搗碎機（轉(zhuǎn)速可達10000rpm，具高速轉(zhuǎn)動尖銳刀片），宜用于動物內(nèi)臟組織破碎⑵物理方法主要經(jīng)過各種物理原因作用，使組織細胞破碎方法。Ⅰ重復(fù)凍融法Ⅱ冷熱變替法Ⅲ超聲波法⑶化學(xué)及生物化學(xué)方法蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第6頁玻璃勻漿機蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第7頁b、細胞器分離

細胞器分離普通采取差速離心法。細胞經(jīng)過破碎后，在適當(dāng)介質(zhì)中進行差速離心。蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第8頁

從破碎材料或細胞器提出蛋白質(zhì)是不純，需深入純化。純化包含將蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)分開，將各種不一樣蛋白質(zhì)分開。選擇提取條件時，就要考慮盡可能除去非蛋白質(zhì)。普通總是有其它物質(zhì)伴隨混入提取液中。但有些雜質(zhì)（如脂肪）以事先除去為宜。先除去便于以后操作。常見有機溶劑提取除去。

三、蛋白質(zhì)粗提取蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第9頁三、蛋白質(zhì)粗提取原理：利用蛋白質(zhì)在PH等電點時溶解度最小，因而會以沉淀方式析出。試劑：檸檬酸、磷酸氫二鈉步驟：1．向試管中加入磷酸氫二鈉和檸檬酸，使其PH=4。2．將提取溶液加入到第1步驟所配緩沖液中。3．靜置一段時間，待沉淀完全。4．過濾或離心出粗產(chǎn)品。注意事項：預(yù)防局部過酸或過堿造成蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第10頁金屬螯合親和層析

固定化金屬螯合親和層析是建立在蛋白質(zhì)表面氨基酸與固定化金屬離子親和力不一樣來進行蛋白質(zhì)分離一項技術(shù)。過渡態(tài)金屬離子能夠與電子供體，如氮、硫、氧等原子以配位鍵結(jié)合，金屬離子上剩下空軌道是電子供體配位點，當(dāng)它在溶液中會被水分子或陰離子占據(jù)。鈣調(diào)蛋白外形似啞鈴,有兩個球形末端,中間被一個長而富有彈性螺旋結(jié)構(gòu)相連,每個末端有兩個Ca2+

結(jié)構(gòu)域,每個結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合一個Ca2+,這么,一個鈣調(diào)蛋白能夠結(jié)合4個Ca2+,鈣調(diào)蛋白與Ca2+

結(jié)合后構(gòu)型相當(dāng)穩(wěn)定。四、精細純化蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第11頁值得注意是，在洗脫時，會有少許配基與蛋白質(zhì)一同被洗脫下來，所以常在其后加一凝膠層析以除去小分子配基。

凝膠層析法屬最常見蛋白質(zhì)分離方法。系混合物隨流動相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相層析柱時，混合物中各物質(zhì)因分子大小不一樣而被分離技術(shù)。在洗柱過程中，分子量最大物質(zhì)不能進入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間空隙最先流出柱外。分子量最小物質(zhì)因能進入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速遲緩，致使最終流出柱外。

蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第12頁五、分析判定A、定性分析SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）測定蛋白質(zhì)分子量：是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基磺酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度含有強還原劑SDS溶液中，與SDS分子按百分比結(jié)合，形成帶負電荷SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物因為結(jié)合大量SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然電荷差異，因為SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合是按重量成百分比，所以在進行電泳·時，蛋白質(zhì)分子遷移速度取決于分子大小。蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第13頁當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)遷移率和分子量對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，

式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)若將已知分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)遷移率對分子量對數(shù)作圖，可取得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，依據(jù)它電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。蛋白質(zhì)的提取與分離純化生化實驗設(shè)計講解第14頁B、定量分析紫外檢測法、考馬斯亮藍法、Folin-酚試劑法（最常見方法）Folin-酚試劑法包含兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin試劑）還原，產(chǎn)生深藍色（磷鉬藍和磷鎢藍混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5～100μg蛋白質(zhì)。Folin試劑