第四章基因工程第一節(jié)基因工程賦予生物新的遺傳特性第二課時基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性早期治療糖尿病的胰島素是從?；蜇i的胰臟中提取的，由于其個別的氨基酸序列和人胰島素不一樣，使用后會引發(fā)人體內(nèi)的免疫反應(yīng)。1982年2月5日，著名學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》發(fā)表了科學(xué)家運(yùn)用基因工程技術(shù)使大腸桿菌合成人胰島素的研究成果。此項基因工程技術(shù)經(jīng)過完善，最終實現(xiàn)了大腸桿菌能夠在裝有培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中大量生產(chǎn)人胰島素，再經(jīng)加工制成藥品。通過基因工程獲得的人胰島素不僅價格低廉，而且療效好，拯救了大批糖尿病患者。資料一：運(yùn)用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素思考1：什么是基因工程?

培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素一般需要哪些步驟？2.基因工程的基本操作步驟獲取目的基因構(gòu)建重組DNA分子將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞檢測目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物思考1：什么是基因工程?培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素一般需要哪些步驟？1.基因工程的概念：

指有意識地把一個人們所需的基因轉(zhuǎn)入另一個生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)所需要產(chǎn)物的技術(shù)。基因工程的一系列操作可使生物獲得新的遺傳特性一、獲取目的基因如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。人們感興趣、想研究的基因，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因

目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因、人干擾素基因等。1、目的基因：一、獲取目的基因——化學(xué)合成法2.獲取目的基因的方法（1）化學(xué)合成法

蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學(xué)合成基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因（不需要模板）②過程①前提：③方法：2.獲取目的基因的方法（1）化學(xué)合成法基因組文庫部分基因文庫（2）從基因文庫中獲取需已知目的基因全部序列

把某種生物的基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆，基因組中所有DNA序列克隆的總匯稱為基因文庫。含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫。基因文庫通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因（不需要模板）一、獲取目的基因——從基因文庫中獲取一、獲取目的基因——從基因文庫中獲?、倩蚪M文庫：含有一種生物的全部基因。提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段

將DNA片段與載體連接基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA反（逆）轉(zhuǎn)錄酶單鏈互補(bǔ)DNADNA聚合酶雙鏈DNA片段與載體連接基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌中儲存cDNA文庫②cDNA文庫：只包含了一種生物的部分基因。cDNA：雙鏈DNA分子原核生物基因真核生物基因非編碼區(qū)位置作用主要結(jié)構(gòu)編碼區(qū)位于基因的兩端對基因的表達(dá)起調(diào)控作用啟動子終止子與RNA聚合酶結(jié)合，控制轉(zhuǎn)錄的開始當(dāng)RNA聚合酶到達(dá)時，釋放出RNA產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄結(jié)束核苷酸序列是連續(xù)的，轉(zhuǎn)錄出的mRNA可直接作為翻譯的模板核苷酸序列是不連續(xù)的，分為外顯子和內(nèi)含子，兩者均會被轉(zhuǎn)錄成mRNA前體，再在核內(nèi)切去內(nèi)含子對應(yīng)部分，加工成為成熟的mRNA?；蚪Y(jié)構(gòu)思考3：真核基因的外顯子和內(nèi)含子均會被轉(zhuǎn)錄嗎？思考2：據(jù)圖分析，真核細(xì)胞與原核細(xì)胞中基因表達(dá)特點一樣嗎？分別是什么？真核基因的外顯子和內(nèi)含子都屬于編碼區(qū)，均會被轉(zhuǎn)錄真核細(xì)胞是先轉(zhuǎn)錄后翻譯轉(zhuǎn)錄形成的RNA需要經(jīng)過加工，才可用于翻譯原核細(xì)胞是邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯轉(zhuǎn)錄形成的RNA，不需要加工，可直接用于翻譯基因表達(dá)特點啟動子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區(qū)別

啟動子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分位置作用DNA片段mRNA上三個相鄰堿基DNA片段mRNA上三個相鄰堿基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結(jié)合的部分，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號決定翻譯過程的結(jié)束一、獲取目的基因思考4：cDNA文庫中是否含有啟動子，終止子，內(nèi)含子？為什么？思考5：為什么cDNA文庫中只含有部分基因？

不同組織細(xì)胞或同一組織不同發(fā)育階段cDNA文庫相同嗎？不含。因為cDNA是由成熟mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的不相同，例如胰島素基因的cDNA只能在胰島β細(xì)胞建立的cDNA文庫中找到基因的選擇性表達(dá)一、獲取目的基因2.獲取目的基因的方法（1）化學(xué)合成法基因組文庫cDNA文庫（2）從基因文庫中獲取需已知目的基因全部序列（3）利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因（不需要模板）一、獲取目的基因——利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。思考6：結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過程，思考PCR的進(jìn)行需要哪些條件？（1）原理：（2）條件：模板：原料：酶：引物：待擴(kuò)增的DNA分子4種脫氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、CDNA聚合酶短的D單鏈DNA（1）DNA復(fù)制時，脫氧核苷酸鏈的延伸使用的原料只能是dNTP。（2）DNA的合成需要能量，dNTP能提供足夠的能量思考7：dNTP作為原料的原因是？模仿體內(nèi)DNA復(fù)制過程（

DNA的半保留復(fù)制）一、獲取目的基因——利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因視頻一、獲取目的基因——利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因——PCR的引物引物其實就是引子，是一小段單鏈DNA（體內(nèi)DNA復(fù)制所用的引物是RNA），是作為DNA復(fù)制的起始點，決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長度。1.概念2.引物的長度其長度常用的是15～30個脫氧核苷酸因為過短則特異性低。過長的引物會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。3.引物的種類PCR擴(kuò)增時應(yīng)有兩種引物，即分別能與兩條模板鏈配對的兩種單鏈DNA。4.結(jié)合位點由于DNA復(fù)制只能是5'→3'進(jìn)行，而DNA的兩條單鏈又是反向平行的。5.設(shè)計引物的要求引物是復(fù)制時所要合成的新鏈中的一段，在整個PCR周期都一直存在（體內(nèi)DNA復(fù)制因用的引物是RNA，最后是被DNA聚合酶I切除的）。要考慮長度、G/C堿基對的數(shù)目外，還要避免兩個引物（特別是3’端）間發(fā)生互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)等。6.引物數(shù)量要求模板鏈的3’端（2011·江蘇）設(shè)計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）都不合理（圖1），請分別說明理由。①第1組：

；②第2組：

。引物I和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對而失效引物I’自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對而失效(2016·天津）采用PCR技術(shù)擴(kuò)增HSA基因。圖3中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴(kuò)增方向，請用箭頭在方框內(nèi)標(biāo)出另一條引物的位置及擴(kuò)增方向。（3）過程：（包括多次循環(huán)）反應(yīng)過程：模板DNA雙鏈在高溫下（90~95℃）氫鍵斷裂，解旋成2條DNA單鏈溫度降低（50~60℃）后，2個引物分別與各自互補(bǔ)的DNA單鏈結(jié)合分別以兩條DNA單鏈為模板，4種脫氧核苷三磷酸為原料，耐高溫的TagDNA聚合酶在適宜的溫度（約72℃）下，以引物與模板形成的小段DNA雙鏈區(qū)為起點，催化合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。①變性②退火③延伸一、獲取目的基因——利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因——過程思考8：預(yù)變性的目的是什么？預(yù)變性使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。思考11：PCR擴(kuò)增的DNA片段大小主要由什么決定？思考:10：PCR技術(shù)中DNA雙鏈解旋的原理

與體內(nèi)DNA復(fù)制相同嗎？為什么？思考9：為什么PCR酶必需耐受高溫在高溫(80-90C)下使DNA解鏈，然后降低溫度使引物與變性DNA復(fù)性不相同

PCR技術(shù)中DNA雙鏈在高溫(80-90C)下解旋，體內(nèi)DNA復(fù)制時依靠解旋酶引物（引物的堿基序列特異性）PCR原理視頻一、獲取目的基因——利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因——過程1.目的基因雙鏈DNA片段在第

次循環(huán)后出現(xiàn)。2.第n次循環(huán)后共有

個分子。這些分子可以分為3種類型：目的基因雙鏈DNA片段為

個，雙鏈中有1條鏈長于目的基因的DNA片段為

個，雙鏈均長于目的基因的DNA片段有

個。3.共進(jìn)行n輪循環(huán)，總共消耗引物A的數(shù)量

個。第n輪循環(huán)后，含有引物A的DNA數(shù)量

個。三（2n-2n）2（n-1）22n2n-12n-1目的基因：兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段，均為短鏈，平末端小組討論常用方法：瓊脂糖凝膠電泳原理：核酸是帶有負(fù)電荷的生物大分子，在電場作用下，向正極移動，核酸分子越大，向正極遷移速率越慢。結(jié)果：a.每個條帶包含的DNA片段長度是相同的。b.DNA可用熒光或放射性染料對DNA進(jìn)行標(biāo)記或用亞甲基藍(lán)將DNA染成藍(lán)色。c.DNAMarker是一組已知長度和含量的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段混合物。一、獲取目的基因——利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因——PCR產(chǎn)物鑒定利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似，如圖所示。圖中引物為單鏈DNA片段,它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。①從理論上推測,第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為

。②在第

輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。15/16三PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式場所酶引物溫度結(jié)果聯(lián)系解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋主要在細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞外解旋酶、DNA聚合酶熱穩(wěn)定TaqDNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)溫和條件3個溫度，需在不同溫度下進(jìn)行合成整個DNA分子擴(kuò)增特定的DNA片段或基因(1)模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板(2)原料：均為四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成RNA、最后切除單鏈DNA、始終存在思考12：用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。1.逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理①PCR利用了DNA的______原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠_____________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷___次循環(huán)；熱變性調(diào)節(jié)溫度自動調(diào)控溫度30②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了______________的原理；DNA半保留復(fù)制活動：PCR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定——實驗原理①DNA分子具有_____________，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些________會向________________的電極移動，這個過程就是電泳。可解離的基團(tuán)帶電粒子與其所攜帶電荷相反②PCR的產(chǎn)物一般通過_______________來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、______________和_____等有關(guān)④凝膠中的DNA分子使用

進(jìn)行染色，再用

以及蒸餾水

，觀察并分析瓊脂糖凝膠中DNA條帶。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度亞甲基藍(lán)溶液75%酒精脫色DNA分子的大小構(gòu)象活動：PCR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定——DNA片段電泳鑒定的原理材料用具①PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）活動：PCR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定——材料用具10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）2μL20μmol/L的引物A4μL20μmol/L的引物B4μL無菌H2O32μLTaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1μL酵母細(xì)胞菌液2μL總體積50μL⑧PCR反應(yīng)體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等活動：PCR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定——材料用具（1）移液：用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分（2）離心：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）（3）反應(yīng)：參照右圖的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)?；顒樱篜CR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定——方法步驟——1、PCR擴(kuò)增（1）配制瓊脂糖溶液

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。（2）制備凝膠①將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽z盒，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜②待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)?；顒樱篜CR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定——方法步驟——2、瓊脂糖凝膠電泳（3）加樣將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（4）電泳蓋上電泳槽蓋，連接好電極插頭后再接通電源。將直流電泳儀設(shè)置成80V，開始電泳。25min后關(guān)閉電源，停止電泳。注意觀察溴酚藍(lán)不要遷移出凝膠?；顒樱篜CR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定——方法步驟——2、瓊脂糖凝膠電泳染色方案1：（1）將凝膠放入培養(yǎng)皿，倒入0.1%亞甲基藍(lán)溶液，沒過凝膠5mm，染色8min。輕輕晃動培養(yǎng)皿，讓染液進(jìn)入凝膠下表面與培養(yǎng)皿之間，不要留有氣泡。染液使用后可回收利用。（2）倒入75%酒精沒過凝膠5min，不斷晃動培養(yǎng)皿1～1.5min。再倒去酒精。（3）加入冷的蒸餾水進(jìn)行脫色。當(dāng)出現(xiàn)清晰的藍(lán)色區(qū)帶時，倒去蒸餾水終止脫色。此過程中可更換染藍(lán)的蒸餾水。如果凝膠在蒸餾水中浸泡過久，條帶顏色會變淡直至無色。染色方案2：

向盛有凝膠的培養(yǎng)皿倒入0.002%亞甲基藍(lán)溶液，沒過凝膠5mm。輕輕晃動培養(yǎng)皿，讓染液進(jìn)入凝膠下表面與培養(yǎng)皿之間。蓋上培養(yǎng)皿蓋，4℃冷藏過夜。第二天觀察到清晰的藍(lán)色區(qū)帶時，倒去染液，終止染色。染液可回收利用?；顒樱篜CR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定——方法步驟——3.染色活動：PCR擴(kuò)增DNA片段及凝膠電泳鑒定——方法步驟——4.觀察用直尺緊貼凝膠表面測量DNA條帶遷移距離，即每個DNA條帶中央到加樣孔的距離（圖4-22)根據(jù)已知Marker每個條帶的位置和相應(yīng)DNA片段長度，推測PCR產(chǎn)物長度。在桌上鋪一張白紙，在光下手持盛有凝膠的培養(yǎng)皿距白紙5cm以上，找到較為清晰的條帶。藍(lán)色條帶即為DNA所在位置(（圖4-21)，