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流式細胞術的血液學應用

北京協(xié)和醫(yī)院血液科汪玄

流式細胞術講義

流式細胞術的概念

流式細胞術(Flowcytometry;FCM)是集計算機技術、激光技術、電子技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學等多門高新技術與方法為一體的現(xiàn)代細胞分析技術，它以流式細胞儀(Flowcytometer)為工具，在單細胞水平上對大量細胞進行高速(每秒計數(shù)可達1000~10000個細胞)、準確、多參數(shù)的定量分析或分選(純度可達99%以上),已成為現(xiàn)代骨髓血細胞學討論中最先進的分析技術。

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流式細胞術與PNH的診斷

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原理

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種獲得性基因突變所致的克隆性疾病，其異樣的血細胞膜糖化肌醇磷脂-錨(GPI-anchor)連接蛋白如CD59,CD55等表達明顯減低或缺乏，導致對補體的敏感性加強而產(chǎn)生溶血性貧血。

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樣本要求：EDTA抗凝血或骨髓3ml每天上午送檢

收費：CD55/CD59

CD59

280元140元

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臨床診斷值CD59陽性的紅細胞大于等于95%CD59陽性的中性粒細胞大于90%

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流式細胞術與白血病免疫分型

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免疫分型原理

流式細胞術(FCM)白血病免疫分型是利用熒光染料標記的單克隆抗體(McAb)檢測相應抗原，經(jīng)過多參數(shù)分析，測定白血病細胞的細胞膜、細胞漿和細胞核的免疫表型，由此了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型時測量細胞數(shù)量一般是在10000~50000個細胞之間，而且快速、特異、精確、重復性好，能區(qū)分細胞的系列，劃分其分化、發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預后判斷、發(fā)病機制討論等有重要價值。

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樣本要求：肝素抗凝骨髓3ml(或外周血)每天上午送檢收費：

70元/每個單抗(臨床常規(guī)檢測12個單抗)

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干/祖細胞標識：

CD34、CA133髓系標識：

CD33、CD13、CD11b、CD15、MPOB細胞相關標識：

CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、CyIg、SmIgT細胞相關標識：

CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8

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常用白血病免疫分型熒光素標記單克隆抗體組合及其意義管號1234567891011

三色標記McAbMouseIgG1/MouseIgG1/CD45PerCPCD5FITC/CD7PE/CD45PerCPCD10FITC/CD19PE/CD45PerCPAnti-HLA-DAFITC/CD13PE/CD45PerCPCD34FITC/CD38PE/CD45PerCPCD14FITC/CD33PE/CD45PerCPCD20FITC/CD22PE/CD45PerCPCD8FITC/CD4PE/CD45PerCPCD3FITC/CD16+56PE/CD45PerCPCD36FITC/GP-APE/CD45PerCPCD61FITC/CD41PE/CD45PerCP

染色細胞及目的陰性對比及設門T淋巴系細胞、部分早期髓系細胞B淋巴系細胞髓系細胞、B淋巴系細胞、部分T淋巴系細胞反映細胞分化程度髓系細胞和單核細胞B淋巴系細胞及其分化程度T淋巴系細胞及其分化程度T

淋巴系細胞、NK細胞幼紅細胞巨核細胞

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B-ALLCD10+

T-ALL-

AML-

CD19CD22c/mCD3c/mCD5CD7

++---

--+++

-----

CD13CD33

--

--

++

MPO

-

-

+

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AML免疫分型FAB/CD34CD33HLA-CD13DRCD14CD15CD11b其它

M1M2M3M4M5M6M7

+---

++++++

++-+++

+++-

---++--

++

-----CD71GP-ACD41CD61CD38CD9

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T-ALL免疫分型CD2CD3CD5早期T-ALL前T-ALL++

CD7+

CD4-

CD8-

TdT+

+

+

+

+

+

+

+

T-ALL

+

+

+

+

+

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B-ALL免疫分型HLADR

CD19CD10CD20

CD22

cIgM

mIgM

TdT

早B前體ALL一般型前B-ALLB-ALL

+++

+++

-+

--+

---

--+

---

++-

+

+

-

+

+

+

-

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FCM-IM診斷混合型白血病

流式細胞術測定發(fā)覺的雙系列或多系列表達的結(jié)果較多，但雙表型白血病不肯定就是混合型，理由如下：混合型白血病診斷：應依據(jù)形態(tài)、免疫、遺傳、分子生物學等綜合判斷，屬雙系列(雙克隆)?雙表型(單克隆)?系列轉(zhuǎn)換型？需考慮到抗原/單抗的多向性：CD4、CD7、CD10、CD38、CD56正常血細胞隨分化成熟，各系列血細胞的免疫標識特性逐步規(guī)律化：白血病細胞的分化發(fā)育卻丟失嚴格的規(guī)律性(lineageinfidelity)與免疫表型的階段性(differentiationasynchrony),因而涌現(xiàn)異樣抗原表達，或過高或過低或不表達或交叉系列表達。

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設門方案

采納CD45/SSC設門法(優(yōu)于FSC/SSC設門法)CD45其表達程度在不同細胞各異。淋巴細胞單核細胞成熟粒細胞原/幼細胞，而紅細胞不表達。SSC在成熟粒細胞單核細胞原/幼細胞淋巴細胞紅細胞。

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臨床原/幼細胞群定量根據(jù)新的WHO分型標準，對初發(fā)病者，

原/幼細胞占總細胞數(shù)20%以上即可判為白血病。對于臨床原/幼細胞群定量應以原/幼細胞群的細胞數(shù)為分母。對于臨床原/幼細胞群定性比定量更重要。

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白血病免疫分型病例分析病例1梁麗琴女性24歲異樣表型中:

CD10+.CD34+.CD22+.CD38+.CD19+.HLA-DR+

結(jié)論：表型符合Pre-B-ALL

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白血病免疫分型病例分析病例2王丙午男性68歲異樣表型中:

CD33+.CD13+.CD15+.CD11b+.HLA-DR+.CD34+.CD19+

結(jié)論：