論明串珠菌及其他細(xì)菌的抑制效果

摘要在從壓榨間直到蔗汁澄清的蔗糖生產(chǎn)過程中，蔗汁中微生物活動是破壞蔗糖品質(zhì)的一個重要因素。蔗糖損失和葡聚糖的形成通常與蔗汁中微生物引起的變質(zhì)有關(guān)。多年來，這一直成為糖廠試圖改善蔗糖品質(zhì)時所面臨的問題。本文以直接影響得糖量的微生物減少和相對純度為指標(biāo)，研究了不同殺菌方法在蔗汁中的效果。

濃度為0.007的S抑制劑顯示了對某糖廠初壓汁和混合汁中的微生物菌群的抗菌效應(yīng)。在對照組中，12h后觀察到4.8單位的純度降低。加入S抑制劑后，只降低2個單位。且蔗汁的穩(wěn)定性在3個樣品中幾乎完全一致。以S抑制劑處理的蔗汁保持深褐色和清新的氣味，且pH與初始相比無顯著變化，而未處理的蔗汁變淺褐色，產(chǎn)生很強(qiáng)的酒味，pH和純度顯著降低。這種穩(wěn)定效應(yīng)尚未被其他常用的糖用殺菌劑所報導(dǎo)。同樣，本文證明了有可能通過使用S抑制劑來穩(wěn)定混合汁。經(jīng)S抑制劑處理后，游離的還原物質(zhì)和多聚糖比不經(jīng)處理的樣品低6倍。這些結(jié)果表明，形成的葡聚糖以及隨之形成的游離果糖減少。引言蔗糖損失和葡聚糖的形成通常與蔗汁變質(zhì)相聯(lián)系。用變質(zhì)蔗汁生產(chǎn)的蔗糖具有高含量的葡聚糖，從而并不符合某些以蔗糖為原料精制為商品的接受標(biāo)準(zhǔn)。多年來，這已成為糖廠試圖改善蔗糖品質(zhì)所面臨的問題。腸膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）合成葡聚糖蔗糖酶（蔗糖-6-葡糖基轉(zhuǎn)移酶），該酶聚合蔗糖為葡聚糖。已證明該微生物可從縫隙侵入收獲前用于儲備蔗汁的組織（Demole等，1962）。蔗汁的物化特性使其成為微生物生長的優(yōu)良環(huán)境。微生物的代謝特性使其可降解蔗汁中的蔗糖并形成代謝物如乳酸，乙酸，乙醇，甘露醇等，以及多聚糖如葡聚糖和果聚糖（Michelena等，1992）。這一現(xiàn)象的影響范圍在壓榨區(qū)變得顯著。因高發(fā)生率細(xì)菌性降解的影響，從初壓汁到混合汁過程中，純度降低了兩個單位。先以熱水、蒸汽完全清洗榨汁區(qū)并隨后用殺菌劑處理是防止甘蔗和蔗汁降解的常用措施。目前，多種化學(xué)物質(zhì)被用于殺菌劑并被考慮作為糖廠的清潔劑，如鹵素，有機(jī)硫化物，四銨化物均被采用（Cerutti等，2002），然而，幾乎沒有源于生物的（biologicalorigin）殺菌劑在糖業(yè)中進(jìn)行試驗(yàn)。本研究目的是以直接影響得糖率的微生物減少和相對純度為指標(biāo)，確定蔗汁中不同殺菌方法的效果。材料與方法a）實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下不同方法抑制腸膜明串珠菌的效果菌株用于本研究的凍干菌株腸膜明串珠菌亞種明串珠菌3A，1K，2L，TB來源于阿根廷EEAOC標(biāo)本收藏所；B/110-1-1，B/110-1-2和B/110-1-3來源于古巴ICIDCA標(biāo)本收藏所。這些微生物曾在甘蔗收獲季節(jié)（阿根廷為5～10月，古巴為1～5月）從甘蔗和蔗汁中分離鑒定?？煽汕蚨呔˙otryodiplodiatheobromae）715和假單胞菌PSS被用于產(chǎn)生具有抗菌特性的代謝物。被命名為S的抑制劑由茉莉酸（jasmonicacid，JA）的銅鹽與其他防腐劑結(jié)合而構(gòu)成?？股x物的制備茉莉酸（JA）從以蔗糖為碳源，KNO3為氮源的Miersch培養(yǎng)基（5）上的可可球二胞菌培養(yǎng)物中獲得。接種10個8mm的菌絲體片斷后（菌絲體從培替氏培養(yǎng)皿中接種到含有1000mlMiersh培養(yǎng)基的5000ml的錐形搖瓶中培養(yǎng)而得），在30℃下培養(yǎng)15天。用WhatmanN04濾紙過濾分離發(fā)酵培養(yǎng)液與菌絲體。用4M的Hcl將5ml培養(yǎng)液pH調(diào)至3.0，隨后用乙酸乙酯（1:1）萃取茉莉酸。含有茉莉酸的抽提物用無水硫酸鈉脫水，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（rotoevaporation）干燥。用氣相色譜確定茉莉酸及相關(guān)化合物。（3）假單胞菌PSS于含有谷氨酸和鹽的培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)。生物量經(jīng)離心分離，通風(fēng)干燥。固體培養(yǎng)基的方法為確定代謝物的抗菌效果，采用了一種瓊脂擴(kuò)散方法（agardiffusiontechnique）（4）?？咕钚缘奶綔y由細(xì)菌營養(yǎng)瓊脂的瓊脂擴(kuò)散方法所確定。方法：用22μmMillipore?微孔濾膜將茉莉酸過濾除菌。氣相色譜分析確定茉莉酸濃度為246mg/L。在確定抗菌能力的培養(yǎng)方法規(guī)定的20ml生物肉湯培養(yǎng)物中分別加入2，10，15，30，60，100和200ppm的茉莉酸。抑菌的定性分析采用含200ppm茉莉酸的樣品。培養(yǎng)物（對照和加入茉莉酸）加入5.5×1.5cm皮氏培養(yǎng)皿并做3份平行。液體培養(yǎng)基的方法含有20g/L蔗糖，6g/L酵母膏，5g/LNa2HPO4以及鹽類的生長培養(yǎng)基被用于研究對明串珠菌生長和產(chǎn)生葡聚糖的抑制效果。生長情況通過540nm的光吸收測定。糖耗通過HPLC測定，葡聚糖濃度通過苯酚-硫酸法測定（5）。S抑制劑對糖廠蔗汁的抑菌效果在本實(shí)驗(yàn)中，10升的茉莉酸銅鹽，以1:1與水稀釋并應(yīng)用于第一座和第六座榨機(jī)，30分鐘后重復(fù)處理一次。榨汁間[NextPage]處理量為260T/h，因此允許S抑制劑的加入劑量約為0.007。分別在加入之前，加入時和加入5min后，第二次加入5min后，第二次加入30min后收集樣品。進(jìn)行微生物計數(shù)（酵母，細(xì)菌和明串珠菌）。測定pH，轉(zhuǎn)光度和純度以確定蔗汁的穩(wěn)定性（Panreac，1992）。接觸時間定義為混合汁能保持到澄清工序的熱處理之前。這一指標(biāo)根據(jù)每

個糖廠的工況而有所不同。在本研究中，研究了1，5和30分鐘的接觸時間?；罴?xì)胞數(shù)量（CFU/ml），通過用選擇性培養(yǎng)基確定，以確定在研究全部微生物（營養(yǎng)瓊脂），多聚糖產(chǎn)生細(xì)菌（酵母膏-葡萄糖瓊脂）和真菌（麥芽瓊脂）時每種產(chǎn)品的抗菌效果。樣品于37℃時接種并于30℃培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)做3份平行（抑制的百分比定義為抑制=（初始CFU/ml–最終CFU/ml）/初始CFU/ml×100）。結(jié)果與討論a）腸膜明串珠菌在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的抑制效果含有不同濃度茉莉酸的可可球二孢菌715上清液產(chǎn)生的對腸膜明串珠菌抑制效果的研究研究表明含有高達(dá)600mg/L的球胞二菌715上清液在24至72小時后抑制腸膜明串珠菌L1101-1,1-2和1-3，48h后出現(xiàn)最大的抑制區(qū)（13mm）。圖1顯示了3種濃度的茉莉酸對3株腸膜明串珠菌的抑制效果。盡管最大的抑制區(qū)出現(xiàn)在使用400mg/L茉莉酸處理之后，此濃度的抑制效果與使用100ml/L茉莉酸處理的效果并無顯著差異。圖1.含有茉莉酸的可可球二胞菌715肉湯對腸膜明串珠菌1101-1，1-2以及1-3（在該序列中）的抑制效果實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下對其他產(chǎn)物的抑制效果圖2顯示了中試規(guī)模的30℃下Glutid（一種從銅綠假單胞菌代謝物中分離而得的殺真菌劑——譯者注），臭氧和S抑制劑對明串珠菌的作用。固體形式的Gluitid在兩種不同濃度下相對于對照樣更有利于微生物生長。這可歸結(jié)于硫酸銨維持Gluticid代謝，有報導(dǎo)該效應(yīng)有利于明串珠菌的代謝。另一方面，臭氧和S抑制劑通過使明串珠菌降低了超過兩個對數(shù)的計數(shù)單位而顯示了顯著的殺菌特性，在0.2濃度的S抑制劑觀察到最大抑制效果。同樣地，蔗汁中真菌細(xì)胞（酵母）3個對數(shù)的降低表明了殺真菌（fungcidal）特性。在本實(shí)驗(yàn)條件下，在30℃時（古巴甘蔗收獲季節(jié)的常溫）0.2濃度的S抑制劑具有顯著的抗菌效果。圖2.Gluticid(g)臭氧和S抑制劑（SP）對腸膜明串珠菌1101-1液體培養(yǎng)物的抑制效果在壓榨間加入S抑制劑的效果根據(jù)中試結(jié)果，我們期望在榨汁中應(yīng)用該產(chǎn)品進(jìn)行研究，以確定該產(chǎn)品作為較易用于降低對初始工藝和最終產(chǎn)品有害的微生物的數(shù)量的壓榨殺菌劑的有效性?？紤]到0.2濃度的S抑制劑不切實(shí)際，不太可能應(yīng)用于壓榨間，即殺菌劑費(fèi)用不應(yīng)高于因微生物降解而損失的蔗糖價值，故測試了0.007濃度的S抑制劑。測試了在初壓汁和混合汁中降低的濃度對微生物量，產(chǎn)多聚糖細(xì)菌（主要是明串珠菌和桿菌）以及酵母的效果。其結(jié)果參見表I。表I0.007濃度的S抑制劑對壓榨間初壓汁和混合汁的微生物群落的抗菌效果嗜溫菌（CFU/ml）多聚糖產(chǎn)生菌（CFU/ml）酵母（CFU/ml）初壓汁0min3.0×1072.0×1071.0×107第一次處理1min1.5×1062.7×1065.0×1055min8.9×1051.2×1063.9×105第二次處理5min1.0×1056.1×1052.4×10530min1.1×1052.9×1054.0×105抑制率99.698.596.0混合汁0min7.0×1061.2×1078.3×106第一次處理1min2.6×1063.8×1066.2×1055min9.3×1051.3×1061.4×106第二次處理5min7.5×1053.2×1051.0×10630min4.5×1054.9×1057.3×105抑制率93.695.994.2在本研究中，接觸時間定為不超過30min。所得的數(shù)據(jù)使我們可以推斷0.007濃度的S抑制劑和30min的接觸時間足以對所有被研究的微生物產(chǎn)生大于90的抑制：對總微生物量為99.6，對多聚糖產(chǎn)生菌大于96，對酵母大于94。結(jié)果表明甚至在接觸1min后，S抑制劑能立即發(fā)揮抗微生物效應(yīng)（通過這3種微生物的急劇下降和高度的抑制顯示出來）。添加S抑制劑對澄清汁純度的影響使用兩種濃度的S抑制劑來研究對蔗汁純度的穩(wěn)定效果。在對照樣中（表II），純度在12h后降低了4.8個單位。加入S抑制劑產(chǎn)生了較少的純度降低（2個單位）。此外，在樣品3中觀察到幾乎完全穩(wěn)定了蔗汁。經(jīng)S抑制劑處理的蔗汁保持深褐色和清新氣味，且pH相對初始時無明顯降低。另一方面，未經(jīng)處理的蔗汁變淺褐色，具有強(qiáng)烈的酒味，并且pH和純度顯著降低。這種穩(wěn)定效應(yīng)尚未在其他常用的糖用殺菌劑中報導(dǎo)（技術(shù)報告，1982）。表II添加S抑制劑對澄清汁純度的影響樣品純度pH嗜溫菌v1.對照樣81.564.531.1×106v2.0.003％84.994.83少于1.0×102v3.0.006％86.094.94少于1.0×102S抑制劑加入后對混合汁的穩(wěn)定情況表III是以0.005的S抑制劑處理混合汁的結(jié)果。表III加入0.005％的S抑制劑對混合蔗汁的穩(wěn)定效果0小時24小時對照樣處理樣對照樣處理樣錘度15.1314.8814.8315.08轉(zhuǎn)光度13.6613.4013.5813.42ARL％0.240.231.000.16多糖（ppm）24592491165192961結(jié)果顯示，經(jīng)過S抑制劑處理后，游離的還原糖和多聚糖比未經(jīng)處理的樣品低6倍。表明葡聚糖以及隨之形成的游離果糖的減少。這一結(jié)果可減少在收砍后甘蔗或加工中斷時