微生物學(xué)教案2003-2004學(xué)年第二學(xué)期生物工程專業(yè)1、2、3、4班用計劃學(xué)時：46學(xué)時(理論28實驗18)教材：微生物學(xué)（沈萍主編）參考書：微生物學(xué)（第二版）（武漢大學(xué)等主編）微生物學(xué)教程（第二版）周德慶主編微生物世界授課方式：多媒體課件（該教案與多媒體課件配套使用）任課教師：衛(wèi)軍2004.2第一章緒論計劃學(xué)時：2重點：微生物和人類的關(guān)系，微生物的特點，微生物類群及微生物學(xué)的奠基人及其對微生物學(xué)的貢獻(xiàn)。一、微生物和你微生物與人類關(guān)系的重要性，你怎么強(qiáng)調(diào)都不過分，微生物是一把十分鋒利的雙刃劍，它們在給人類帶來巨大利益的同時也帶來"殘忍"的破壞。它給人類帶來的利益不僅是享受，而且實際上涉及到人類的生存。在這本書中你們將讀到微生物在許多重要產(chǎn)品中所起的不可替代的作用，例如：面包、奶酪、啤酒、抗生素、疫苗、維生素、酶等重要產(chǎn)品的生產(chǎn)(見第十五章)，同時也是人類生存環(huán)境中必不可少的成員，有了它們才使得地球上的物質(zhì)進(jìn)行循環(huán)(見第十一章)，否則地球上的所有生命將無法繁衍下去。此外，你在第十章還將會看到以基因工程為代表的現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展及其美妙的前景也是微生物對人類作出的又一重大貢獻(xiàn)。然而，這把雙刃劍的另一面--微生物的"殘忍"性給人類帶來的災(zāi)難有時甚至是毀滅性的。1347年的一場由鼠疫桿菌(Yersiniapestis)引起的瘟疫幾乎摧毀了整個歐洲，有1/3的人(約2500萬人)死于這場災(zāi)難，在此后的80年間，這種疾病一再肆虐，實際上消滅了大約75%的歐洲人口，一些歷史學(xué)家認(rèn)為這場災(zāi)難甚至改變了歐洲文化。我國在解放前也曾多次流行鼠疫，死亡率極高。今天，一種新的瘟疫--艾滋病(AIDS)也正在全球蔓延；癌癥也正威脅著著人類的健康和生命；許多已被征服的傳染病(如肺結(jié)核、虐疾、霍亂等)也有"卷土重來"之勢。據(jù)1999年8月世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，目前全世界有18.6億人(相當(dāng)于全球人口的32%)患結(jié)核病。隨著環(huán)境的污染日趨嚴(yán)重，一些以前從未見過的新的疾病(如軍團(tuán)病、埃博拉病毒病、霍亂0139新菌型、0157以及瘋牛病等)又給人類帶來了新的威脅。因此，你--未來的微生物學(xué)家或其他科學(xué)家任重道遠(yuǎn)。正確地使用微生物這把雙刃劍，造福于人類是我們學(xué)習(xí)和應(yīng)用微生物學(xué)的目的，也是每一個微生物學(xué)工作者義不容辭的責(zé)任。二、微生物科學(xué)

1.研究對象及分類地位微生物研究作為一門科學(xué)--微生物學(xué)，比動物學(xué)、植物學(xué)要晚得多，至今不過100多年的歷史。因為微生物太小，需借助顯微鏡才能看清他們，因此微生物學(xué)(Microbiology)一般定義為研究肉眼難以看清的稱之為微生物的生命活動的科學(xué)。這些微小生物包括：無細(xì)胞結(jié)構(gòu)不能獨立生活的病毒、亞病毒(類病毒、擬病毒、骯病毒)；具原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真細(xì)菌、古生菌以及具真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真菌(酵母、霉菌、蕈菌等)、單細(xì)胞藻類、原生動物等。但其中也有少數(shù)成員是肉眼可見的，例如近年來發(fā)現(xiàn)有的細(xì)菌是肉眼可見的：1993年正式確定為細(xì)菌的Epulopisciumfishelsoni以及1998年報道的Thiomargaritanamibiensis(見第二章)，均為肉眼可見的細(xì)菌。所以上述微生物學(xué)的定義是指一般的概念，是歷史的沿革，也仍為今天所適用。由于微生物的極其多樣性以及獨特的生物學(xué)特性(個體小、繁殖快、分布廣等)使其在整個生命科學(xué)中占據(jù)著舉足輕重的地位。無論是1969年Whittaker提出的五界系統(tǒng)，還是1977年Woese提出的三域(domain)系統(tǒng)(見第12章)，微生物都占據(jù)了絕大多數(shù)的"席位"，分別為3/5和2/3強(qiáng)。這是微生物在整個生物界的分類地位。在本章的后部分我們還將討論微生物及微生物學(xué)對整個生命科學(xué)作出的巨大貢獻(xiàn)及其生物學(xué)地位。

2.研究內(nèi)容及分科那么微生物學(xué)具體的研究內(nèi)容是什么呢?總的來說，微生物學(xué)是研究微生物在一定條件下的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、遺傳變異以及微生物的進(jìn)化、分類、生態(tài)等生命活動規(guī)律及其應(yīng)用的一門學(xué)科。隨著微生物學(xué)的不斷發(fā)展，已形成了基礎(chǔ)微生物學(xué)和應(yīng)用微生物學(xué)，又可分為許多不同的分支學(xué)科，并還在不斷地形成新的學(xué)科和研究領(lǐng)域。其主要的分科見圖1-1。三、微生物的發(fā)現(xiàn)和微生物學(xué)的發(fā)展

1.微生物的發(fā)現(xiàn)在人們真正看到微生物之前，實際上已經(jīng)猜想或感覺到它們的存在，甚至人們已經(jīng)在不知不覺中應(yīng)用它們。我國勞動人民已很早就認(rèn)識到微生物的存在和作用，也是最早應(yīng)用微生物的少數(shù)國家之一。據(jù)考古學(xué)推測，我國在8000年以前已經(jīng)出現(xiàn)了曲蘗釀酒了，4000多年前我國釀酒已十分普遍，而且當(dāng)時的埃及人也已學(xué)會烘制面包和釀制果酒，2500年前我國人民已發(fā)明釀醬、醋，知道用曲治消化道疾病。公元六世紀(jì)(北魏時期)，我國賈思勰的巨著"齊民要術(shù)"詳細(xì)地記載了制曲、釀酒、制醬和釀醋等工藝。公元九世紀(jì)到十世紀(jì)我國已發(fā)明用鼻苗法種痘，用細(xì)菌浸出法開采銅。到了16世紀(jì)，古羅巴醫(yī)生G.Fracastoro才明確提出疾病是由肉眼看不見的生物(livingcreatures)引起的。我國明末(1641年)醫(yī)生吳又可也提出"戾氣"學(xué)說，認(rèn)為傳染病的病因是一種看不見的"戾氣"，其傳播途徑以口、鼻為主。但是真正看見并描述微生物的第一個人是荷蘭商人安東·列文虎克(AntonyVanLeeuwenhoek,1632～1723)(圖1-2)，但他的最大貢獻(xiàn)不是在商界而是他利用自制的顯微鏡發(fā)現(xiàn)了微生物世界(當(dāng)時被稱之為微小動物)，他的顯微鏡放大倍數(shù)為50～300倍，構(gòu)造很簡單，僅有一個透鏡安裝在兩片金屬薄片的中間，在透鏡前面有一根金屬短棒，在棒的尖端擱上需要觀察的樣品，通過調(diào)焦螺旋調(diào)節(jié)焦距。利用這種顯微鏡，列文虎克清楚地看見了細(xì)菌和原生動物。首次揭示了一個嶄新的生物世界--微生物界。由于他的劃時代貢獻(xiàn)，1680年被選為英國皇家學(xué)會會員。

2.微生物學(xué)發(fā)展過程中的重大事件由列文虎克揭示的多姿多彩的微生物世界吸引著各國學(xué)者去研究、探索，推動著微生物學(xué)的建立和發(fā)展，表1-1列出了發(fā)展過程中的重大事件。

從表1-1列出的重大事件中，其發(fā)現(xiàn)或發(fā)明人就有30位獲得諾貝爾獎，據(jù)有關(guān)統(tǒng)計表明，20世紀(jì)諾貝爾獎(生理和醫(yī)學(xué))獲得者中，從事微生物問題研究的就占了1/3，這從另一個側(cè)面看到了微生物學(xué)舉足輕重的地位。也可見微生物學(xué)的發(fā)展對整個科學(xué)技術(shù)和社會經(jīng)濟(jì)的重大作用和貢獻(xiàn)。

3.微生物學(xué)發(fā)展的奠基者繼列文虎克發(fā)現(xiàn)微生物世界以后的200年間，微生物學(xué)的研究基本上停留在形態(tài)描述和分門別類的階段。直到19世紀(jì)中期，以法國的巴斯德(LouisPasteur,1822～1895)和德國的柯赫(RobertKoch,1843～1910)為代表的科學(xué)家才將微生物的研究從形態(tài)描述推進(jìn)到生理學(xué)研究階段，揭露了微生物是造成腐敗發(fā)酵和人畜疾病的原因，并建立了分離、培養(yǎng)、接種和滅菌等一系列獨特的微生物技術(shù)，從而奠定了微生物學(xué)的基礎(chǔ)，同時開辟了醫(yī)學(xué)和工業(yè)微生物等分支學(xué)科。巴期德和柯赫是微生物學(xué)的奠基人。1)巴斯德巴斯德(圖1-3)原是化學(xué)家，曾在化學(xué)上作出過重要的貢獻(xiàn)，后來轉(zhuǎn)向微生物學(xué)研究領(lǐng)域，為微生物學(xué)的建立和發(fā)展作出了卓越的貢獻(xiàn)。主要集中在下列三方面。

(1)徹底否定了"自然發(fā)生"學(xué)說"自生說"是一個古老的學(xué)說，認(rèn)為一切生物是自然發(fā)生的。到了17世紀(jì)，雖然由于研究植物和動物的生長發(fā)育和生活循環(huán)，使"自生說"逐漸軟弱，但是由于技術(shù)問題，如何證實微生物不是自然發(fā)生的仍然是一個難題，這不僅是"自生說"的一個頑固陣地，同時也是人們正確認(rèn)識微生物生命活動的一大屏障。巴斯德在前人工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了許多試驗，其中著名的曲頸瓶試驗無可辯駁地證實，空氣內(nèi)確實含有微生物，它們引起有機(jī)質(zhì)的腐敗。巴斯德自制了一個具有細(xì)長而彎曲的頸的玻瓶，其中盛有有機(jī)物水浸液(圖1-4)，經(jīng)加熱滅菌后，瓶內(nèi)可一直保持無菌狀態(tài)，有機(jī)物不發(fā)生腐敗，因為彎曲的瓶頸阻擋了外面空氣中微生物直達(dá)有機(jī)物浸液內(nèi)，一旦將瓶頸打斷，瓶內(nèi)浸液中才有了微生物，有機(jī)質(zhì)發(fā)生腐敗。巴斯德的實驗徹底否定了"自生說"，并從此建立了病原學(xué)說，推動了微生物學(xué)的發(fā)展。(2)免疫學(xué)--預(yù)防接種Jenner雖然早在1798年發(fā)明了種痘法可預(yù)防天花，但卻不了解這個免疫過程的基本機(jī)制，因此，這個發(fā)現(xiàn)沒能獲得繼續(xù)發(fā)展。1877年，巴斯德研究了雞霍亂，發(fā)現(xiàn)將病原菌減毒可誘發(fā)免疫性，以預(yù)防雞霍亂病。其后他又研究了牛、羊炭疽病和狂犬病，并首次制成狂犬疫苗，證實其免疫學(xué)說，為人類防病、治病作出了重大貢獻(xiàn)。(3)證實發(fā)酵是由微生物引起的酒精發(fā)酵是一個由微生物引起的生物過程還是一個純粹的化學(xué)反應(yīng)過程，曾是化學(xué)家和微生物學(xué)家激烈爭論的問題。巴斯德在否定"自生說"的基礎(chǔ)上，認(rèn)為一切發(fā)酵作用都可能和微生物的生長繁殖有關(guān)。經(jīng)不斷地努力，巴斯德終于分離到了許多引起發(fā)酵的微生物，并證實酒精發(fā)酵是由酵母菌引起的。此外，巴斯德還發(fā)現(xiàn)乳酸發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和丁酸發(fā)酵都是不同細(xì)菌所引起的。為進(jìn)一步研究微生物的生理生化奠定了基礎(chǔ)。(4)其他貢獻(xiàn)一直沿用至今天的巴斯德消毒法(60～65℃）作短時間加熱處理，殺死有害微生物的一種消毒法)和家蠶軟化病問題的解決也是巴斯德的重要貢獻(xiàn)，他不僅在實踐上解決了當(dāng)時法國酒變質(zhì)和家蠶軟化病的實際問題，而且也推動了微生物病原學(xué)說發(fā)展，并深刻影響醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

2).柯赫柯赫(圖1-5)是著名的細(xì)菌學(xué)家，由于他曾經(jīng)是一名醫(yī)生，因此對病原細(xì)菌的研究作出了突出的貢(1)具體證實了炭疽病菌是炭疽病的病原菌。(2)發(fā)現(xiàn)了肺結(jié)核病的病原菌，這是當(dāng)時死亡率極高的傳染性疾病，因此柯赫獲得了諾貝爾獎。(3)提出了證明某種微生物是否為某種疾病病原體的基本原則--柯赫原則。由于柯赫在病原菌研究方面的開創(chuàng)性工作，自19世紀(jì)70年代至20世紀(jì)20年代成了發(fā)現(xiàn)病原菌的黃金時代，所發(fā)現(xiàn)的各種病原微生物不下百余種，其中還包括植物病原細(xì)菌?？潞粘嗽诓≡芯糠矫娴膫ゴ蟪删屯?，在微生物基本操作技術(shù)方面的貢獻(xiàn)更是為微生物學(xué)的發(fā)展奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，這些技術(shù)包括：(1)用固體培養(yǎng)基分離純化微生物的技術(shù)，這是進(jìn)行微生物學(xué)研究的基本前體，這項技術(shù)一直沿用至今。(2)配制培養(yǎng)基(見第四章)。也是當(dāng)今微生物學(xué)研究的基本技術(shù)之一。這二項技術(shù)不僅是具有微生物學(xué)研究特色的重要技術(shù)，而且也為當(dāng)今動植物細(xì)胞的培養(yǎng)作出了十分重要的貢獻(xiàn)。巴斯德和柯赫的杰出工作，使微生物學(xué)作為一門獨立的學(xué)科開始形成，并出現(xiàn)以他們?yōu)榇矶⒌母鞣种W(xué)科，例如細(xì)菌學(xué)(巴斯德、柯赫等)、消毒外科技術(shù)(J.Lister)，免疫學(xué)(巴斯德、Metchnikoff,Behring,Ehrlich等)、土壤微生物學(xué)(BeijernckWinogradsky等)、病毒學(xué)(IVanowsky、Beijerinck等)、植物病理學(xué)和真菌學(xué)(Bary,Berkeley等)、釀造學(xué)(Hensen,Jorgensen等)以及化學(xué)治療法(Ehrlish等)等。微生物學(xué)的研究內(nèi)容日趨豐富，使微生物學(xué)發(fā)展更加迅速。四、20世紀(jì)的微生物學(xué)19世紀(jì)中期到20世紀(jì)初，微生物研究作為一門獨立的學(xué)科已經(jīng)形成，并進(jìn)行著自身的發(fā)展。但在20世紀(jì)早期還未與生物學(xué)的主流相匯合。當(dāng)時大多數(shù)生物學(xué)家的研究興趣是有關(guān)高等動植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能、生態(tài)學(xué)、繁殖和發(fā)育、遺傳以及進(jìn)化等；而微生物學(xué)家更關(guān)心的是感染疾病的因子、免疫、尋找新的化學(xué)治療藥物以及微生物代謝等。到了20世紀(jì)40年代，隨著生物學(xué)的發(fā)展，許多生物學(xué)難以解決的理論和技術(shù)問題十分突出，特別是遺傳學(xué)上的爭論問題，使得微生物這樣一種簡單而又具完整生命活動的小生物成了生物學(xué)研究的"明星"，微生物學(xué)很快與生物學(xué)主流匯合，并被推到了整個生命科學(xué)發(fā)展的前沿，獲得了迅速的發(fā)展，在生命科學(xué)的發(fā)展中作出了巨大的貢獻(xiàn)。1.多學(xué)科交叉促進(jìn)微生物學(xué)全面發(fā)展微生物學(xué)走出了獨自發(fā)展，以應(yīng)用為主的狹窄研究范圍，與生物學(xué)發(fā)展的主流匯合、交叉，獲得全面、深入的發(fā)展。而首先與之匯合的是遺傳學(xué)、生物化學(xué)。1941年Beadle和Tatum用粗糙脈胞菌(Neurosporacrasa)分離出一系列生化突變株，將遺傳學(xué)和生物化學(xué)緊密結(jié)合起來，不僅促進(jìn)微生物學(xué)本身向縱深發(fā)展，形成了新的基礎(chǔ)研究學(xué)科--微生物遺傳學(xué)和微生物生理學(xué)，而且也推動了分子遺傳學(xué)的形成。與此同時，微生物的其他分支學(xué)科也得到迅速發(fā)展，如細(xì)菌學(xué)、真菌學(xué)、病毒學(xué)、微生物分類學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、土壤微生物學(xué)、植物病理學(xué)、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及免疫學(xué)等。還有60年代發(fā)展起來的微生物生態(tài)學(xué)、環(huán)境微生物學(xué)等。這些都是原來獨立的學(xué)科相互交叉、滲透而形成的。微生物的一系列生命活動規(guī)律，包括遺傳變異、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，微生物的酶及生理生化等的研究逐漸發(fā)展起來，到了20世紀(jì)50年代微生物學(xué)全面進(jìn)入分子研究水平，并進(jìn)一步與迅速發(fā)展起來的分子生物學(xué)理論和技術(shù)以及其他學(xué)科匯合，使微生物學(xué)發(fā)展成為生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一門發(fā)展最快，影響最大、體現(xiàn)生命科學(xué)發(fā)展主流的前沿科學(xué)。微生物學(xué)應(yīng)用性廣泛，進(jìn)入20世紀(jì)，特別是40年代后，微生物的應(yīng)用也獲得重大進(jìn)展。抗生素的生產(chǎn)已成為現(xiàn)代化的大企業(yè)；微生物酶制劑已廣泛用于農(nóng)、工、醫(yī)各方面；微生物的其它產(chǎn)物，如有機(jī)酸、氨基酸、維生素、核苷酸等，都利用微生物進(jìn)行大量生產(chǎn)。微生物的利用已組成一項新興的發(fā)酵工業(yè)，并逐步朝著人為有效控制的方面發(fā)展。80年代初，在基因工程的帶動下，傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵工業(yè)已從多方面發(fā)生了質(zhì)的變化，成為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分。2.微生物學(xué)推動生命科學(xué)的發(fā)展(1)促進(jìn)許多重大理論問題的突破生命科學(xué)由整體或細(xì)胞研究水平進(jìn)入分子水平，取決于許多重大理論問題的突破，其中微生物學(xué)起了重要甚至關(guān)鍵的作用，特別是對分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的影響最大。我們知道"突變"是遺傳學(xué)研究的重要手段，但是只有在1941年Beadle和Tatum用粗糙脈胞霉進(jìn)行的突變實驗，才使基因和酶的關(guān)系得以闡明，提出了"一個基因一個酶"的假說。有關(guān)突變的性質(zhì)和來源(自發(fā)突變)也是由于S.Luria和M.Delbruck(1943)利用細(xì)菌進(jìn)行的突變所證實。長期爭論而不能得到解決的"遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)是什么?"的重大理論問題，只有在以微生物為材料進(jìn)行研究所獲得的結(jié)果才無可辯駁地證實：核酸是遺傳信息的攜帶者，是遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)(見第八章)。這一重大突破也為1953年WotsonCrickDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出起了戰(zhàn)略性的決定作用，從而奠定了分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)。此外，基因的概念--遺傳學(xué)發(fā)展的核心，也與微生物學(xué)的研究息息相關(guān)，例如，著名的"斷裂基因"的發(fā)現(xiàn)來源于對病毒的研究(第七章)；所謂"跳躍基因"(可轉(zhuǎn)座因子)的發(fā)現(xiàn)雖然首先來源于McClintock對玉米的研究，但最終得到證實和公認(rèn)是由于對大腸桿菌的研究?；蚪Y(jié)構(gòu)的精細(xì)分析、重疊基因的發(fā)現(xiàn)，最先完成的基因組測序等都與微生物學(xué)發(fā)展密不可分。以研究生命物質(zhì)的物理、化學(xué)結(jié)構(gòu)及其功能為己任的分子生物學(xué)，如果沒有遺傳密碼的闡明，不知道基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，那將是"無源之水，無本之本"。正是微生物學(xué)的研究和發(fā)展為之奠定了基礎(chǔ)。60年代Nirenberg等人通過研究大腸桿菌無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系及多聚尿苷酶，發(fā)現(xiàn)了苯丙氨酸的遺傳密碼，繼而完成了全部密碼的破譯，為人類從分子水平上研究生命現(xiàn)象開辟了新的途徑。Jacob等人通過研究大腸桿菌誘導(dǎo)酶的形成機(jī)制而提出的操縱子學(xué)說，闡明了基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，為分子生物學(xué)的形成奠定了基礎(chǔ)。此外，DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成機(jī)制以及遺傳信息傳遞的"中心法則"的提出等都涉及到微生物學(xué)家所作出的卓越貢獻(xiàn)。(2)對生命科學(xué)研究技術(shù)的貢獻(xiàn)微生物學(xué)的建立雖然比高等動、植物學(xué)晚，但發(fā)展卻十分迅速。動、植物由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及技術(shù)方法的限制而相對發(fā)展緩慢，特別是人類遺傳學(xué)的限制更大。20世紀(jì)中后期由于微生物學(xué)的消毒滅菌，分離培養(yǎng)等技術(shù)的滲透和應(yīng)用的拓寬及發(fā)展，動、植物細(xì)胞也可以像微生物一樣在平板或三角瓶中培養(yǎng)，可以在顯微鏡下進(jìn)行分離，甚至可以像微生物的工業(yè)發(fā)酵一樣，在發(fā)酵罐中進(jìn)行生產(chǎn)。今天的轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基團(tuán)植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)也源于微生物轉(zhuǎn)化的理論和技術(shù)。70年代，由于微生物學(xué)的許多重大發(fā)現(xiàn)，包括質(zhì)粒載體，限制性內(nèi)切酶，連接酶，反轉(zhuǎn)錄酶等，才導(dǎo)致了DNA重組技術(shù)和遺傳工程的出現(xiàn)(見第十章)，使整個生命科學(xué)翻開了新的一頁，使人類定向改變生物、根治疾病、美化環(huán)境的的夢想將成為現(xiàn)實。(3)微生物與"人類基因組計劃""人類基因組計劃"的全稱為"人類基因組作圖和測序計劃"。這是一項當(dāng)今世界耗資巨大(30億美元)，其深遠(yuǎn)意義堪與阿波羅登月計劃媲美的最大的科學(xué)工程。要完成如此浩大的工程，除了需要多學(xué)科(數(shù)、理、化、信息、計算機(jī)等)的交叉外，模式生物的先行至關(guān)重要，因為模式生物一般背景清楚，基因組小，便于測定和分析，可從中獲取經(jīng)驗改進(jìn)技術(shù)方法。而這些模式生物除極少數(shù)(例如果蠅、線蟲、擬南芥等)為非微生物外，絕大部分為細(xì)菌和酵母，目前已完成了近20多種獨立生活的微生物基因組的序列測定，在此過程中由于基因組作圖和測序方法的不斷改進(jìn)，大大加快了基因組計劃進(jìn)展，預(yù)計"人類基因組計劃"有可能提前2-3年完成(左右)。測序工作只是"計劃"的一部分，緊接著是更巨大的工程--后基因組研究，其主要任務(wù)是認(rèn)識基因與基因組的功能。目前微生物基因組序列分析表明，在某些微生物中存在一些與人類某些遺傳疾病相類似的基因，因此可以利用這些細(xì)菌的模型來研究這些基因的功能，為認(rèn)識龐大的人類基因組及其功能提供簡便的模式?？傊?，20世紀(jì)的微生物學(xué)一方面在與其它學(xué)科的交叉和相互促進(jìn)中，獲得令人矚目的發(fā)展。另一方面也為整個生命科學(xué)的發(fā)展作出了巨大的貢獻(xiàn)，并在生命科學(xué)的發(fā)展中占有重要的地位。(4)我國微生物學(xué)的發(fā)展我國是具有五千年文明史的古國，我國勞動人民對微生物的認(rèn)識和利用是最早的幾個國家之一。特別是在制酒、醬油、醋等微生物產(chǎn)品以及用種痘、麥曲等進(jìn)行防病治療等方面具有卓越的貢獻(xiàn)。但微生物作為一門科學(xué)進(jìn)行研究，我國起步較晚。中國學(xué)者開始從事微生物學(xué)研究在20世紀(jì)之初，那時一批到西方留學(xué)的中國科學(xué)家開始較系統(tǒng)地介紹微生物學(xué)知識，從事微生物學(xué)研究。1910～1921年間伍連德用近代微生物學(xué)知識對鼠疫和霍亂病原的探索和防治，在中國最早建立起衛(wèi)生防疫機(jī)構(gòu)，培養(yǎng)了第一支預(yù)防鼠疫的專業(yè)隊伍，在當(dāng)時這項工作居于國際先進(jìn)地位。20～30年代，我國學(xué)者開始對醫(yī)學(xué)微生物學(xué)有了較多的實驗研究，其中湯飛凡等在醫(yī)學(xué)細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)等方面的某些領(lǐng)域做出過較高水平的成績，例如沙眼病原體的分離和確證是具有國際領(lǐng)先水平的開創(chuàng)性工作。30年代開始在高等學(xué)校設(shè)立釀造科目和農(nóng)產(chǎn)制造系，以釀造為主要課程，創(chuàng)建了一批與應(yīng)用微生物學(xué)有關(guān)的研究機(jī)構(gòu)，魏巖壽等在工業(yè)微生物方面做出了開拓性工作，戴芳瀾和俞大紱等是我國真菌學(xué)和植物病理學(xué)的奠基人；張憲武和陳華癸等對根瘤菌固氮作用的研究開創(chuàng)了我國農(nóng)業(yè)微生物學(xué)；高尚蔭創(chuàng)建了我國病毒學(xué)的基礎(chǔ)理論研究和第一個微生物學(xué)專業(yè)。但總的說來，在新中國成立之前，我國微生物學(xué)的力量較弱且分散，未形成我國自己的隊伍和研究體系，也沒有我國自己的現(xiàn)代微生物工業(yè)。新中國成立以后，微生物學(xué)在我國有了劃時代的發(fā)展，一批主要進(jìn)行微生物學(xué)研究的單位建立起來了，一些重點大學(xué)創(chuàng)設(shè)了微生物學(xué)專業(yè)?，F(xiàn)代化的發(fā)酵工業(yè)、抗生素工業(yè)、生物農(nóng)藥和菌肥工作已經(jīng)形成一定規(guī)模，特別是改革開放以來，我國微生物學(xué)無論在應(yīng)用和基礎(chǔ)理論研究方面都取得了重要的成果，例如我國抗生素的總產(chǎn)量已耀居世界首位，我國的兩步法生產(chǎn)維生素C的技術(shù)居世界先進(jìn)水平。培養(yǎng)了一大批微生物學(xué)人才。近年來，我國學(xué)者瞄準(zhǔn)世界微生物學(xué)科發(fā)展前沿，進(jìn)行微生物基因組學(xué)的研究，現(xiàn)已完成痘苗病毒天壇株的全基因組測序，最近又對我國的辛德畢斯毒株(變異株)進(jìn)行了全基因組測序。1999年又啟動了從我國云南省騰沖地區(qū)熱海沸泉中分離得到的泉生熱袍菌全基因組測序，目前取得可喜進(jìn)展。我國微生物進(jìn)入了一個全面發(fā)展的新時期。但從總體來說，我國的微生物學(xué)發(fā)展水平除個別領(lǐng)域或研究課題達(dá)到國際先進(jìn)水平，為國外同行承認(rèn)外，絕大多數(shù)領(lǐng)域與國外先進(jìn)水平相比，尚有相當(dāng)大的差距。因此如何發(fā)揮我國傳統(tǒng)應(yīng)用微生物技術(shù)的優(yōu)勢，緊跟國際發(fā)展前沿，趕超世界先進(jìn)水平，還需作出艱苦的努力。五、21世紀(jì)微生物學(xué)展望1.微生物基因組學(xué)研究將全面展開所謂"基因組學(xué)"是1986年由ThomasRoderick首創(chuàng)，至今已發(fā)展為一專門的學(xué)科領(lǐng)域，包括全基因組的序列分析、功能分析和比較分析，是結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化基因組學(xué)交織的學(xué)科。如果說20世紀(jì)剛剛興起的微生物基因組研究是給"長跑"中的"人類基因組計劃"助一臂之力的話，那么21世紀(jì)微生物基因組學(xué)將在繼續(xù)作為人類基因組計劃"的主要模式生物，在后基因組研究(認(rèn)識基因與基因組功能)中發(fā)揮不可取代的作用外，會進(jìn)一步擴(kuò)大到其他微生物，特別是與工農(nóng)業(yè)及與環(huán)境、資源有關(guān)的重要微生物。目前已經(jīng)完成基因組測序的微生物主要是模式微生物、特殊微生物及醫(yī)用微生物。而隨著基因組作圖測序方法的不斷進(jìn)步與完善，基因組研究將成為一種常規(guī)的研究方法，為從本質(zhì)上認(rèn)識微生物自身以及利用和改造微生物將產(chǎn)生質(zhì)的飛躍。并將帶動分子微生物學(xué)等基礎(chǔ)研究學(xué)科的發(fā)展。2.以了解微生物之間、微生物與其他生物、微生物與環(huán)境的相互作用為研究內(nèi)容的微生物生態(tài)學(xué)、環(huán)境微生物、細(xì)胞微生物學(xué)等，將在基因組信息的基礎(chǔ)上獲得長足發(fā)展，為人類的生存和健康發(fā)揮積極的作用。3.微生物生命現(xiàn)象的特性和共性將更加受到重視。微生物生命現(xiàn)象的特性和共性可概括為：(1)微生物具有其它生物不具備的生物學(xué)特性，例如可在其他生物無法生存的極端環(huán)境下生存和繁殖，具有其他生物不具備的代謝途徑和功能，如化能營養(yǎng)、厭氧生活、生物固氮和不釋放氧的光合作用等，反映了微生物極其豐富的多樣性。(2)微生物具有其他生物共有的基本生物學(xué)特性：生長、繁殖、代謝、共用一套遺傳密碼等，甚至其基因組上含有與高等生物同源的基因，充分反映了生物高度的統(tǒng)一性。(3)易操作性：微生物個體小、結(jié)構(gòu)簡單、生長周期短，易大量培養(yǎng)，易變異，重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢，十分易于操作。微生物具備生命現(xiàn)象的特性和共性，將是21世紀(jì)進(jìn)一步解決生物學(xué)重大理論問題，如生命起源與進(jìn)化，物質(zhì)運動的基本規(guī)律等，和實際應(yīng)用問題，如新的微生物資源的開發(fā)利用，能源、糧食等的最理想的材料。4.與其他學(xué)科實現(xiàn)更廣泛的交叉，獲得新的發(fā)展。5.微生物產(chǎn)業(yè)將呈現(xiàn)全新的局面小結(jié)1.微生物是由荷蘭商人列文虎克首先發(fā)現(xiàn)的，至今有300多年的歷史。微生物的主要特征是：個體小、結(jié)構(gòu)簡單、繁殖快、易培養(yǎng)、易變異、分布廣。它一方面具有其它生物不具備的生物學(xué)特性，另一方面它也具有其它生物共有的基本生命特征。2.微生物學(xué)是研究微生物在一定條件下的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、遺傳變異以及微生物的進(jìn)化、分類、生態(tài)等生命活動規(guī)律及其應(yīng)用的一門學(xué)科。誕生于19世紀(jì)中期，其奠基人是法國的巴斯德和德國的柯赫。20世紀(jì)獲得全面發(fā)展，形成了許多分支學(xué)科。特別是40年代以后微生物學(xué)促進(jìn)了整個生命科學(xué)的發(fā)展，躍居中心地位。3.我國是最早知道利用微生物的少數(shù)國家之一。但作為一門學(xué)科發(fā)展起始于20世紀(jì)初，曾在某些病原菌的研究和防治以及微生物在工、農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用和研究等方面，作出具國際先進(jìn)水平的工作。近年來，在微生物基因組的研究工作方面與國際發(fā)展前沿接軌，在微生物應(yīng)用方面已取得可喜成績。4.21世紀(jì)的微生物學(xué)將更加絢麗多彩。多學(xué)科的交叉、基因組研究的深入和擴(kuò)展將使微生物學(xué)的基礎(chǔ)研究及其應(yīng)用出現(xiàn)前所未有的局面。思考題1.用具體事例說明人類與微生物的關(guān)系。2.簡述微生物學(xué)在生命科學(xué)發(fā)展中的地位，并描繪其前景。4.為什么說巴斯德和柯赫是微生物學(xué)的奠基人?第二章微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)計劃學(xué)時：2重點：微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)，常用的菌種保藏方法。細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母菌等的形態(tài)特征。大多數(shù)動物植物的研究、利用都能以個體為單位進(jìn)行，而微生物由于個體微小，在絕大多數(shù)情況下都是利用群體來研究其屬性，微生物的物種（菌株）一般也是以群體的形式進(jìn)行繁衍、保存。在微生物學(xué)中，在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體稱為培養(yǎng)物（culture），而只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物（pureculture）。由于在通常情況下純培養(yǎng)物能較好地被研究、利用和重復(fù)結(jié)果，因此把特定的微生物從自然界混雜存在的狀態(tài)中分離、純化出來的純培養(yǎng)技術(shù)是進(jìn)行微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。相應(yīng)的，微生物個體微小的特點也決定了顯微技術(shù)是進(jìn)行微生物研究的另一項重要技術(shù)，因為絕大多數(shù)微生物的個體形態(tài)及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)只能通過顯微鏡才能進(jìn)行觀察和研究。顯微技術(shù)包括顯微標(biāo)本的制作、觀察、測定、分析及記錄等方面的內(nèi)容。實際上，正是由于顯微技術(shù)及微生物純培養(yǎng)技術(shù)的建立才使我們得以認(rèn)識豐富多彩的微生物世界，并真正使對微生物的研究發(fā)展成為一門科學(xué)。第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)一、無菌技術(shù)微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且無處不在。因此，在微生物的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止其被其他微生物污染的技術(shù)被稱為無菌技術(shù)（aseptictechnique），它是保證微生物學(xué)研究正常進(jìn)行的關(guān)鍵。1.微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌試管、玻璃燒瓶、平皿（culturedish，Petridish）等是最為常用的培養(yǎng)微生物的器具，在使用前必須先行滅菌，使容器中不含任何生物。培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)（稱為培養(yǎng)基（culturemedium））可以加到器皿中后一起滅菌，也可在單獨滅菌后加到無菌的器具中。最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計的。2.接種操作用接種環(huán)或接種針分離微生物，或在無菌條件下把微生物由一個培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)接到另一個培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)，是微生物學(xué)研究中最常用的基本操作。由于打開器皿就可能引起器皿內(nèi)部被環(huán)境中的其他微生物污染，因此微生物實驗的所有操作均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，其要點是在火焰附近進(jìn)行熟練的無菌操作（圖2-1），或在無菌箱或操作室內(nèi)無菌的環(huán)境下進(jìn)行操作（圖2-2）。操作箱或操作室內(nèi)的空氣可在使用前一段時間內(nèi)用紫外燈或化學(xué)藥劑滅菌。有的無菌室通無菌空氣維持無菌狀態(tài)。用以挑取和轉(zhuǎn)接微生物材料的接種環(huán)及接種針，一般采用易于迅速加熱和冷卻的鎳鉻合金等金屬制備，使用時用火焰灼燒滅菌。而移植液體培養(yǎng)物可采用無菌吸管或移液槍。二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體，稱為菌落（colony）。當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時，便成為菌苔（lawn）。不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對該微生物進(jìn)行分類、鑒定的重要依據(jù)（圖2-3）。大多數(shù)細(xì)菌、酵母菌、以及許多真菌和單細(xì)胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。所謂平板，即培養(yǎng)平板（cultureplate）的簡稱，它是指固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養(yǎng)基的平皿。這方法包括將單個微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。固體培養(yǎng)基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基，每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的最常用手段。1.稀釋倒平板法（pourplatemethod）先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。2.涂布平板法（spreadplatemethod）由于將含菌材料先加到還較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，而且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學(xué)研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落（圖2-4）。3.平板劃線法（streakplatemethod）用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線（圖2-5），微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。4.稀釋搖管法（dilutionshakeculturemethod）用固體培養(yǎng)基分離嚴(yán)格厭氧菌有它特殊的地方。如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養(yǎng)，容器中的氧氣可采用化學(xué)、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用稀釋搖管培養(yǎng)法進(jìn)行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式*。先將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間（圖2-6）。進(jìn)行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細(xì)管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養(yǎng)皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進(jìn)行觀察和菌落的移植。三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)對于大多數(shù)細(xì)菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數(shù)種類在固體培養(yǎng)基上長得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長，例如一些細(xì)胞大的細(xì)菌、許多原生動物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。通常采用的液體培養(yǎng)基分離純化法是稀釋法。接種物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的機(jī)率就會急劇下降。因此，采用稀釋法進(jìn)行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過95%）表現(xiàn)為不生長。四、單細(xì)胞（孢子）分離稀釋法有一個重要缺點，它只能分離出混雜微生物群體中占數(shù)量優(yōu)勢的種類，而在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數(shù)。這時，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細(xì)胞或單個個體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細(xì)胞（或單孢子）分離法。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細(xì)菌則較難。對于較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個個體，并在大量的滅菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進(jìn)行。對于個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下進(jìn)行。目前，市場上有售的顯微操作儀種類很多，一般是通過機(jī)械、空氣或油壓傳動裝置來減小手的動作幅度，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。在沒有顯微操作儀時，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞分離，例如將經(jīng)適當(dāng)稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個細(xì)胞的液體來進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。單細(xì)胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。五、選擇培養(yǎng)分離沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足自然界中一切生物生長的要求，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇性的。在一種培養(yǎng)基上接種多種微生物，只有能生長的才生長，其它被抑制。如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設(shè)計一套特定環(huán)境使之特別適合這種微生物的生長，因而能夠從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數(shù)。這種通過選擇培養(yǎng)進(jìn)行微生物純培養(yǎng)分離的技術(shù)稱為選擇培養(yǎng)分離，是十分重要的，特別對于從自然界中分離、尋找有用的微生物。在自然界中，除了極特殊的情況外，在大多數(shù)場合下微生物群落是由多種微生物組成的，因此，要從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當(dāng)某一種微生物所存在的數(shù)量與其它微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的。例如，若某處的土壤中的微生物數(shù)量在108時，必須稀釋到10-6才有可能在平板上分離到單菌落，而如果所需的微生物的數(shù)量僅為102~3，顯然不可能在一般通用的平板上得到該微生物的單菌落。要分離這種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法?；蛞种剖勾蠖鄶?shù)微生物不能生長，或造成有利于該菌生長的環(huán)境，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進(jìn)行純培養(yǎng)分離。1.利用選擇平板進(jìn)行直接分離主要根據(jù)待分離微生物的特點選擇不同的培養(yǎng)條件，有多種方法可以采用。例如在從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時，可以在培養(yǎng)基中添加牛奶或酪素制備培養(yǎng)基平板，微生物生長時若產(chǎn)生蛋白酶則會水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質(zhì)水解圈。通過菌株培養(yǎng)時產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水解圈對產(chǎn)酶菌株進(jìn)行篩選，可以減少工作量，將那些大量的非產(chǎn)蛋白酶菌株淘汰；再如，要分離高溫菌，可在高溫條件進(jìn)行培養(yǎng)；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進(jìn)行分離；有些微生物如螺旋體、粘細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動特點進(jìn)行分離純化，因為滑行能使它們自己和其它不能移動的微生物分開?？蓪⑽⑸锶郝潼c種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復(fù)進(jìn)行，得到純培養(yǎng)物。2.富集培養(yǎng)主要是指利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需分離的微生物的特點從物理、化學(xué)、生物、及綜合多個方面進(jìn)行選擇，如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養(yǎng)等等許多方面。圖2-7描述了采用富集方法從土壤中分離能降解酚類化合物對羥基苯甲酸（-hydroxybenzylacid）的微生物的實驗過程。首先配制以對羥基苯甲酸為唯一碳源的液體培養(yǎng)基并分裝于燒瓶中，滅菌后將少量的土壤樣品接種于該液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間，原來透明的培養(yǎng)液會變得渾濁，說明已有大量微生物生長。取少量上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)液中重新培養(yǎng)，該過程經(jīng)數(shù)次重復(fù)后能利用對羥基苯甲酸的微生物的比例在培養(yǎng)物中將大大提高，將培養(yǎng)液涂布于以對羥基苯甲酸為唯一碳源的瓊脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解對羥基苯甲酸的微生物。挑取一部分單菌落分別接種到含有及缺乏對羥基苯甲酸的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中大部分在含有對羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中生長，而在沒有對羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中表現(xiàn)為沒有生長，說明通過該富集程序的確得到了欲分離的目標(biāo)微生物。通過富集培養(yǎng)使原本在自然環(huán)境中占少數(shù)的微生物的數(shù)量大大提高后，可以再通過稀釋倒平板或平板劃線等操作得到純培養(yǎng)物。富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家最強(qiáng)有力的技術(shù)手段之一。營養(yǎng)和生理條件的幾乎無窮盡的組合形式可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要。富集培養(yǎng)方法提供了按照意愿從自然界分離出特定已知微生物種類的有力手段，只要掌握這種微生物的特殊要求就行。富集培養(yǎng)法也可用來分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)計的特定環(huán)境中能生長的微生物，盡管我們并不知道什么微生物能在這種特定的環(huán)境中生長。六、二元培養(yǎng)物分離的目的通常是要得到純培養(yǎng)。然而，在有些情況下這是做不到的或是很難作到的。但可用二元培養(yǎng)物作為純化培養(yǎng)的替代物。只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物，含有二種以上微生物的培養(yǎng)物稱為混合培養(yǎng)物，而如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。例如二元培養(yǎng)物是保存病毒的最有效途徑，因為病毒是細(xì)胞生物的嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物。有一些具有細(xì)胞的微生物也是嚴(yán)格的其它生物的細(xì)胞內(nèi)寄生物，或特殊的共生關(guān)系。對于這些生物，二元培養(yǎng)物是在實驗室控制條件下可能達(dá)到的最接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。在自然環(huán)境中，獵食細(xì)小微生物的原生動物也很容易用二元培養(yǎng)法在實驗室培養(yǎng)，培養(yǎng)物由原生動物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲、變形蟲和粘菌。對這些生物，二者的關(guān)系可能并不是嚴(yán)格的。這些生物中有些能夠純培養(yǎng)，但是其營養(yǎng)要求往往極端復(fù)雜，制備純培養(yǎng)的培養(yǎng)基很困難、很費事。七、微生物的保藏技術(shù)通過分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物，還必須通過各種保藏技術(shù)使其在一定時間內(nèi)不死亡，不會被其它微生物污染，不會因發(fā)生變異而丟失重要的生物學(xué)性狀，否則就無法真正保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進(jìn)行。菌種或培養(yǎng)物保藏是一項最重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)工作，微生物菌種是珍貴的自然資源，具有重要意義，許多國家都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機(jī)構(gòu)，例如，中國微生物菌種保藏委員會（CCCCM），中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），美國典型菌種保藏中心（ATCC），美國的“北部地區(qū)研究實驗室”（NRRL），荷蘭的霉菌中心保藏所（CBS），英國的國家典型菌種保藏中心（NCTC）以及日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO）等。國際微生物學(xué)聯(lián)合會（IAMS）還專門設(shè)立了世界菌種保藏聯(lián)合會（WFGC），用計算機(jī)儲存世界上各保藏機(jī)構(gòu)提供的菌種數(shù)據(jù)資料，可以通過國際互聯(lián)網(wǎng)查詢和索取，進(jìn)行微生物菌種的交流、研究和使用。生物的生長一般都需要一定的水分，適宜的溫度和合適的營養(yǎng)，微生物也不例外。菌種保藏就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。例如利用培養(yǎng)基或宿主對微生物菌株進(jìn)行連續(xù)移種，或改變其所處的環(huán)境條件，例如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)等，令菌株的代謝水平降低，乃至完全停止，達(dá)到半休眠或完全休眠的狀態(tài)，而在一定時間內(nèi)得到保存，有的可保藏幾十年或更長時間。在需要時再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復(fù)活力。1.傳代培養(yǎng)保藏傳代培養(yǎng)與培養(yǎng)物的直接使用密切相關(guān)，是進(jìn)行微生物保藏的基本方法。常用的有瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)等。采用傳代法保藏微生物應(yīng)注意針對不同的菌種而選擇使用適宜的培養(yǎng)基，并在規(guī)定的時間內(nèi)進(jìn)行移種，以免由于菌株接種后不生長或超過時間不能接活，喪失微生物菌種。在瓊脂斜面上保藏微生物的時間因菌種的不同而有較大差異，有些可保存數(shù)年，而有些僅數(shù)周。一般來說，通過降低培養(yǎng)物的代謝或防止培養(yǎng)基干燥，可延長傳代保藏的保存時間。例如在菌株生長良好后，改用橡皮塞封口或在培養(yǎng)基表面覆蓋液體石蠟，并放置低溫保存；將一些菌的菌苔直接刮入蒸餾水或其它緩沖液后，密封置4℃保存，也可以大大提高某些菌的保藏時間及保藏效果，這種方法有時也被稱為懸液保藏法。由于菌種進(jìn)行長期傳代十分繁瑣，容易污染，特別是會由于菌株的自發(fā)突變而導(dǎo)致菌種衰退，使菌株的形態(tài)、生理特性、代謝物的產(chǎn)量等發(fā)生變化，因此在一般情況下，在實驗室里除了采用傳代法對常用的菌種進(jìn)行保存外，還必須根據(jù)條件采用其它方法，特別是對那些需要長期保存的菌種更是如此。2.冷凍保藏將微生物處于冷凍狀態(tài)，使其代謝作用停止以達(dá)到保藏的目的。大多數(shù)微生物都能通過冷凍進(jìn)行保存，細(xì)胞體積大者要比小者對低溫更敏感，而無細(xì)胞壁者則比有細(xì)胞壁者敏感。其原因與低溫會使細(xì)胞內(nèi)的水分形成冰晶，從而引起細(xì)胞，尤其是細(xì)胞膜的損傷。進(jìn)行冷凍時，適當(dāng)采取速凍的方法，可因產(chǎn)生的冰晶小而減少對細(xì)胞的損傷。當(dāng)從低溫下移出并開始升溫時，冰晶又會長大，故快速升溫也可減少對細(xì)胞的損傷。冷凍時的介質(zhì)對細(xì)胞的損傷也有顯著的影響。例如，0.5mol/L左右的甘油或二甲亞楓可透入細(xì)胞，并通過降低強(qiáng)烈的脫水作用而保護(hù)細(xì)胞；大分子物質(zhì)如糊精、血清蛋白、脫脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）雖不能透入細(xì)胞，但可通過與細(xì)胞表面結(jié)合的方式而防止細(xì)胞膜受凍傷。因此，在采用冷凍法保藏菌種時，一般應(yīng)加入各種保護(hù)劑以提高培養(yǎng)物的存活率。一般來說，保藏溫度越低，保藏效果越好。在常用的冷凍保藏方法中，液氮保藏可達(dá)到—196℃。因此，從適用的微生物范圍、存活期限、性狀的穩(wěn)定性等方面來看，該方法在迄今使用的各種微生物保藏方法中是較理想的一種。但液氮保藏需使用專用器具，一般僅適合一些專業(yè)保藏機(jī)構(gòu)采用。與此相應(yīng)，冰箱保藏使用更為普遍。例如在各種基因工程手冊中，一般都推薦在—70℃低溫冰箱中保存菌株或細(xì)胞的某些特殊生理狀態(tài)（添加甘油做保護(hù)劑），例如經(jīng)誘導(dǎo)建立了感受態(tài)的細(xì)胞。在沒有低溫冰箱的條件下，也可利用—20~30℃的普通冰箱保存菌種。但應(yīng)注意加有保護(hù)劑的細(xì)胞混合物的共融點處在這個溫度范圍內(nèi)，常會由于冰箱可能產(chǎn)生的微小溫度變化引起培養(yǎng)物的反復(fù)融化和再結(jié)晶，而對菌體形成強(qiáng)烈的損傷。因此采用普通冰箱冷凍保存菌種的效果往往遠(yuǎn)低于低溫冰箱，應(yīng)注意經(jīng)常檢查保藏物的存活情況，隨時轉(zhuǎn)種。3.干燥保藏法水份對各種生化反應(yīng)和一切生命活動至關(guān)重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技術(shù)中另一項經(jīng)常采用的手段。沙土管保存和冷凍真空保藏是最常用的二項微生物干燥保藏技術(shù)。前者主要適用于產(chǎn)孢子的微生物，如芽孢桿菌、放線菌等。一般將菌種接種斜面，培養(yǎng)至長出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸液，加入無菌的沙土試管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置冰箱保存。此法簡便易行，并可以將微生物保藏較長時間，適合一般實驗室及以放線菌等為菌種的發(fā)酵工廠采用。冷凍真空保藏是將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍結(jié)，然后在真空下通過冰的升華作用除去水分。達(dá)到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動處于休眠，可以達(dá)到長期保藏的目的。用冰升華的方式除去水分，手段比較溫和，細(xì)胞受損傷的程度相對較小，存活率及保藏效果均不錯，而且經(jīng)抽真空封閉的菌種安瓿管的保存、郵寄、使用均很方便。因此冷凍真空干燥保藏是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，大多數(shù)專業(yè)的菌種保藏機(jī)構(gòu)均采用此法作為主要的微生物保存手段。除上述方法外，各種微生物菌種保藏的方法還有很多，如紙片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物均適宜。因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進(jìn)行綜合考慮。對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)絕大多數(shù)微生物的大小都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肉眼的觀察極限，因此，一般必須借助顯微鏡放大系統(tǒng)的作用才能看到到它們的個體形態(tài)和內(nèi)部構(gòu)造。除了放大外，決定顯微觀察效果的還有二個重要的因素，即分辨率和反差。分辨率是指能辨別兩點之間最小距離的能力，而反差是指樣品區(qū)別于背景的程度，它們與顯微鏡的自身特點有關(guān)，但也取決于進(jìn)行顯微觀察時對顯微鏡的正確使用及良好的標(biāo)本制作和觀察技術(shù)，這就是顯微技術(shù)。而現(xiàn)代的顯微技術(shù)，不僅僅是觀察物體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，而且發(fā)展到對物體的組成成分定性和定量，特別是與計算科學(xué)技術(shù)的結(jié)合出現(xiàn)的圖象分析、模擬仿真等技術(shù)，為探索微生物的奧秘增添了強(qiáng)大武器。一、顯微鏡的種類及原理1.普通光學(xué)顯微鏡現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常被稱為復(fù)式顯微鏡。它們由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。機(jī)械裝置包括鏡座、支架、載物臺、調(diào)焦螺旋等部件，是顯微鏡的基本組成單位，主要是保證光學(xué)系統(tǒng)的準(zhǔn)確配制和靈活調(diào)控，在一般情況下是固定不變的。而光學(xué)系統(tǒng)由物鏡、目鏡、聚光器等組成，直接影響著顯微鏡的性能，是顯微鏡的核心。一般的顯微鏡都可配置多種可互換的光學(xué)組件，通過這些組件的變換可改變顯微鏡的功能，如明視野、暗視野、相差等。對任何顯微鏡來說，分辨率是決定其觀察效果的最重要指標(biāo)。從物理學(xué)角度看，光學(xué)顯微鏡的分辨率受光的干涉現(xiàn)象及所用物鏡性能的限制，可表示為：式中為所用光源波長；為物鏡鏡口角的半數(shù)，它取決于物鏡的直徑和工作距離（圖2-8）；n為玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率，顯微觀察時可根據(jù)物鏡的特性而選用不同的介質(zhì)，例如空氣（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）等。nsin也被表示為數(shù)值孔徑值（NumericalAperture，NA），它是決定物鏡性能的最重要指標(biāo)。光學(xué)顯微鏡在使用最短波長的可見光（=450nm）作為光源時在油鏡下可以達(dá)到其最大分辨率，0.18m（表2-1）。由于肉眼的正常分辨能力一般為0.25mm左右，因此光學(xué)顯微鏡有效的最高總放大倍數(shù)只能達(dá)到1,000~1,500倍，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高顯微鏡的放大能力對觀察效果的改善并無幫助。2.暗視野顯微鏡明視野顯微鏡的的照明光線直接進(jìn)入視野，屬透射照明。生活的細(xì)菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的，不易看清。而暗視野顯微鏡則利用特殊的聚光器實現(xiàn)斜射照明，給樣品照明的光不直接穿過物鏡，而是由樣品反射或折射后再進(jìn)入物鏡（圖2-9），因此，整個視野是暗的，而樣品是明亮的。正如我們在白天看不到的星辰卻可在黑暗的夜空中清楚地顯現(xiàn)一樣，在暗視野顯微鏡中由于樣品與背景之間的反差增大，可以清晰地觀察到在明視野顯微鏡中不易看清的活菌體等透明的微小顆粒。而且，即使所觀察微粒的尺寸小于顯微鏡的分辨率，依然可以通過它們散射的光而發(fā)現(xiàn)其存在。因此，暗視野法主要用于觀察生活細(xì)菌的運動性。3.相差顯微鏡光線通過比較透明的標(biāo)本時，光的波長（顏色）和振幅（亮度）都沒有明顯的變化，因此，用普通光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本（如活的細(xì)胞）時，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)往往難以分辨。然而，由于細(xì)胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過這種標(biāo)本時，直射光和衍射光的光程就會有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會發(fā)生改變（產(chǎn)生相位差）。光的相位差人肉眼感覺不到，但相差顯微鏡配備有特殊的光學(xué)裝置——環(huán)狀光闌和相差板，利用光的干涉現(xiàn)象，能將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢圆煊X的振幅差（明暗差），從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對比度增強(qiáng)。正由于樣品的這種反差是以不同部位的密度差別為基礎(chǔ)形成的，因此，相差顯微鏡使人們能在不染色的情況下比較清楚地觀察到在普通光學(xué)顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)微結(jié)構(gòu)，是顯微技術(shù)的一大突破，為此，其發(fā)明人F.Zernike獲得了1953年的諾貝爾獎。4.熒光顯微鏡有些化合物（熒光素）可以吸收紫外線并轉(zhuǎn)放出一部分為光波較長的可見光，這種現(xiàn)象稱為熒光。因此，在紫外線的照射下，發(fā)熒光的物體會在黑暗的背景下表現(xiàn)為光亮的有色物體，這就是熒光顯微技術(shù)的原理。由于不同熒光素的激發(fā)波長范圍不同，因此同一樣品可以同時用二種以上的熒光素標(biāo)記，它們在熒光顯微鏡下經(jīng)過一定波長的光激發(fā)發(fā)射出不同顏色的光。熒光顯微技術(shù)在免疫學(xué)、環(huán)境微生物學(xué)、分子生物學(xué)中應(yīng)用十分普遍。5.透射電子顯微鏡由于顯微鏡的分辨率取決于所用光的波長，人們從本世紀(jì)初開始就嘗試用波長更短的電磁波取代可見光來放大成像，以制造分辨本領(lǐng)更高的顯微鏡。1933年，德國人E.Ruska制成了世界上第一臺以電子作為“光源”的顯微鏡電子顯微鏡。其理論依據(jù)是：電子束通過電磁場時會產(chǎn)生復(fù)雜的螺旋式運動，但最終的結(jié)果是正如光線通過玻璃透鏡時一樣，產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)、匯聚或發(fā)散，并同樣可以聚集成像。而一束電子具有波長很短的電磁波的性質(zhì)，其波長與運動速度成反比，速度越快，波長越短。在理論上，電子波的波長最短可達(dá)到0.005nm，所以電子顯微鏡的分辨能力要遠(yuǎn)高于光學(xué)顯微鏡（圖2-10）。幾十年來，電子顯微技術(shù)發(fā)展很快，應(yīng)用也日益廣泛，對包括微生物學(xué)在內(nèi)的許多學(xué)科的進(jìn)步都起了巨大的推動作用。6.掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡（ScanningElectronMicroscopeSEM）與光學(xué)顯微鏡和透射電鏡不同，它的工作原理類似于電視或電傳真照片。電子槍發(fā)出的電子束被磁透鏡匯聚成極細(xì)的電子“探針”，在樣品表面進(jìn)行“掃描”，電子束掃到的地方就可激發(fā)樣品表面放出二次電子（同時也有一些其它信號）。二次電子產(chǎn)生的多少與電子束入射角度有關(guān)，也即是與樣品表面的立體形貌有關(guān)。與此同時，在觀察用的熒光屏上另一個電子束也做同步的掃描。二次電子由探測器收集，并在那里被閃爍器變成光信號，再經(jīng)光電倍增管和放大器又變成電壓信號來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度。這樣，樣品上產(chǎn)生二次電子多的地方，在熒光屏上相應(yīng)的部位就越亮，我們就能得到一幅放大的樣品立體圖像。7.掃描隧道顯微鏡在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能得到不斷完善的同時，基于其它各種原理的顯微鏡也不斷問世，使人們認(rèn)識微觀世界的能力和手段得到不斷提高，其中80年代才出現(xiàn)的掃描隧道顯微鏡（ScanningTunnelingMicroscope，STM）是顯微鏡領(lǐng)域的新成員，主要原理是利用了量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。近年來,在STM的基礎(chǔ)上又發(fā)展出了另一種掃描探針式顯微鏡，原子力顯微鏡（AtomicForceMicroscope，AFM）。AFM也是利用細(xì)小的探針對樣品表面進(jìn)行恒定高度的掃描來對樣品進(jìn)行“觀察”，但它不是通過隧道電流，而是通過一個激光裝置來監(jiān)測探針隨樣品表面的升降變化來獲取樣品表面形貌的信息，因此，與STM不同，AFM可以用于對不具導(dǎo)電性，或?qū)щ娔芰^差的樣品進(jìn)行觀察。二、顯微觀察樣品的制備樣品制備是顯微技術(shù)的一個重要環(huán)節(jié)，直接影響著顯微觀察效果的好壞。一般來說，在利用顯微鏡觀察、研究生物樣品時，除要根據(jù)所用顯微鏡使用的特點采用合適的制樣方法外，還應(yīng)考慮生物樣品的特點，盡可能地使被觀察樣品的生理結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，并通過各種手段提高其反差。1.光學(xué)顯微鏡的制樣光學(xué)顯微鏡是微生物學(xué)研究的最常用工具，有活體直接觀察和染色觀察二種基本使用方法。(1)活體觀察可采用壓滴法、懸滴法及菌絲埋片法等在明視野、暗視野或相差顯微鏡下對微生物活體進(jìn)行直接觀察。其特點是可以避免一般染色制樣時的固定作用對微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，并可用于專門研究微生物的運動能力、攝食特性、及生長過程中的形態(tài)變化如細(xì)胞分裂、芽孢萌發(fā)等動態(tài)過程。①壓滴法：將菌懸液滴于載玻片上，加蓋蓋玻片后立即進(jìn)行顯微鏡觀察；②懸滴法：在蓋玻片中央加一小滴菌懸液后反轉(zhuǎn)置于特制的凹玻載片上后進(jìn)行顯微鏡觀察。為防止液滴蒸發(fā)變干，一般還應(yīng)在蓋玻片四周加封凡士林；③菌絲埋片法：將無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，經(jīng)培養(yǎng)，取下玻璃紙置于載玻片上，用顯微鏡對菌絲的形態(tài)進(jìn)行觀察。(2)染色觀察一般微生物菌體小而無色透明，在光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞體液及結(jié)構(gòu)的折光率與其背景相差很小，因此用壓滴法或懸滴法進(jìn)行觀察時，只能看到其大體形態(tài)和運動情況。若要在光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)致形態(tài)和主要結(jié)構(gòu)，一般都需要對它們進(jìn)行染色，從而借助顏色的反襯作用提高觀察樣品不同部位的反差。染色前必須先對涂在載玻片上的樣品進(jìn)行固定，其目的有二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上，二是增加其對染料的親和力。常用酒精燈火焰加熱和化學(xué)固定二種方法。固定時應(yīng)注意盡量保持細(xì)胞原有形態(tài)，防止細(xì)胞膨脹和收縮。而染色則根據(jù)方法和染料等的不同可分為很多種類，如細(xì)菌的染色，可簡單概括如下：

第三節(jié)顯微鏡下的微生物計劃學(xué)時：7學(xué)時重點：細(xì)菌、酵母菌、放線菌、霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能微生物類群龐雜，種類繁多，包括細(xì)胞型和非細(xì)胞型兩類。凡具有細(xì)胞形態(tài)的微生物稱為細(xì)胞型微生物，按系統(tǒng)發(fā)育和細(xì)胞結(jié)構(gòu)它們分屬于細(xì)菌（Bacteria）、古生菌（Archaea）和真核生物（Eukarya）。而不具細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病毒、類病毒，行寄生生活，它們的許多生活特性類同于寄主生物。本節(jié)將主要介紹在顯微鏡下細(xì)胞型微生物的一般形態(tài)和細(xì)胞大小，對豐富多彩的微生物世界有一個初步的認(rèn)識。一、細(xì)菌和古生菌雖然從系統(tǒng)發(fā)育來看，細(xì)菌和古生菌是二種完全不同的生物類群，但它們的細(xì)胞結(jié)構(gòu)卻基本一致，同屬原核生物（Prokaryote），在顯微鏡下的形態(tài)也十分類似。1.細(xì)菌的形態(tài)和排列在顯微鏡下不同細(xì)菌的形態(tài)可以說是千差萬別，豐富多采，但就單個有機(jī)體而言，其基本形態(tài)可分為球狀、桿狀與螺旋狀三種（圖2-14）。盡管是單細(xì)胞生物，許多細(xì)菌也常以成對、成鏈、成簇的形式生長，例如雙球菌（圖2-15肺炎球菌，舊稱肺炎雙球菌）、鏈球菌（圖2-16）、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌等。除了球菌、桿菌、螺旋菌三種基本形態(tài)外，還有許多具其它形態(tài)的細(xì)菌。例如柄桿菌（prosthecatebacteria）細(xì)胞上有柄（stalk）、菌絲（hyphae）、附器（appendages）等細(xì)胞質(zhì)伸出物，細(xì)胞呈桿狀或梭狀，并有特征性的細(xì)柄（圖2-17）；球衣菌（Sphaerotilus），能形成衣鞘（sheath），桿狀的細(xì)胞呈鏈狀排列在衣鞘內(nèi)而成為絲狀（圖2-18）；而支原體（Mycoplasma）由于只有細(xì)胞膜，沒有細(xì)胞壁，故細(xì)胞柔軟，形態(tài)多變，具有高度多形性。即使在同一培養(yǎng)基中，細(xì)胞也常出現(xiàn)不同大小的球狀、環(huán)狀、長短不一的絲狀、桿狀及不規(guī)則的多邊形態(tài)。（圖2-19）等。另外，人們還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞呈星形和方形的細(xì)菌（圖2-20）有些細(xì)菌具有特定的生活周期，在不同的生長階段具有不同的形態(tài)，例如放線菌、粘細(xì)菌等。放線菌是生產(chǎn)抗生素的重要微生物，大多由分枝發(fā)達(dá)的菌絲組成。而根據(jù)菌絲的形態(tài)和功能又可分為營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲三種，其中孢子絲的形態(tài)特征是放線菌的重要鑒定指標(biāo)。（圖2-21，2-22）細(xì)菌的形態(tài)明顯地受環(huán)境條件的影響，如培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的組成與濃度等發(fā)生改變，均能引起細(xì)菌形態(tài)的改變。一般處于幼齡階段和生長條件適宜時，細(xì)菌形態(tài)正常、整齊，表現(xiàn)出特定的形態(tài)。在較老的培養(yǎng)物中，或不正常的條件下，細(xì)胞常出現(xiàn)不正常形態(tài)，尤其是桿菌，有的細(xì)胞膨大，有的出現(xiàn)梨形，有的產(chǎn)生分枝，有時菌體顯著伸長以至呈絲狀等。這些不規(guī)則的形態(tài)統(tǒng)稱為異常形態(tài)，若將它們轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中或適宜的培養(yǎng)條件下又可恢復(fù)原來的形態(tài)。2.古生菌在顯微鏡下，古生菌與細(xì)菌具有類似的個體形態(tài)，但它們多生活于一些生存條件十分惡劣的極端環(huán)境中，例如高溫、高鹽、高酸等。圖2-23所列的隱蔽熱網(wǎng)菌（Pyrodictiumoccultum）是迄今所發(fā)現(xiàn)的最耐熱的生物之一，它的最適生長溫度為105℃。而熱原體（Thermoplasma）沒有細(xì)胞壁，其形態(tài)也象細(xì)菌中的支原體一樣呈多形性（圖2-24）。3.原核生物的細(xì)胞大小原核生物的細(xì)胞大小隨種類不同差別很大。有的與最大的病毒粒子大小相近，在光學(xué)顯微鏡下勉強(qiáng)可見，有的與藻類細(xì)胞差不多，幾乎肉眼就可辨認(rèn)，但多數(shù)居于二者之間。盡管細(xì)菌細(xì)胞微小，采用顯微鏡測微尺能較容易、較準(zhǔn)確地測量出它們的大小；也可通過投影法或照相制成圖片，再按放大倍數(shù)測算。球菌大小以其直徑表示，桿菌和螺旋菌以其長度和寬度表示。不過螺旋菌的長度是菌體兩端點間的距離，而不是真正的長度，它的真正長度應(yīng)按其螺旋的直徑和圈數(shù)來計算。細(xì)菌大小的比較見圖2-25。值得指出的是，在顯微鏡下觀察到的細(xì)菌的大小與所用固定染色的方法有關(guān)。經(jīng)干燥固定的菌體比活菌體的長度，一般要縮短1/3-1/4；若用襯托菌體的負(fù)染色法，其菌體往往大于普通染色法，甚至比活菌體還大，具有莢膜的細(xì)菌中最易出現(xiàn)這種現(xiàn)象。此外，影響細(xì)菌形態(tài)變化的因素同樣也影響細(xì)菌的大小。除少數(shù)例外，一般幼齡細(xì)菌比成熟的或老齡的細(xì)菌大得多。例如枯草芽孢桿菌，培養(yǎng)4小時的比培養(yǎng)24小時的細(xì)胞長5-7倍，但寬度變化不明顯。細(xì)菌大小隨菌齡而變化，這可能與代謝廢物積累有關(guān)。另外，培養(yǎng)基中滲透壓增加也會導(dǎo)致細(xì)胞變小。二、真菌霉菌、酵母菌、以及大型真菌如蘑菇等皆為真菌，均屬真核微生物。它們種類繁多，形態(tài)各異、大小懸殊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)多樣。由于霉菌和酵母菌在生物學(xué)特性、研究方法、以及它們在自然界的分布和作用，對動物、植物和人類的有益、有害效應(yīng)等方面均與細(xì)菌相似，故有關(guān)真菌方面的研究霉菌和酵母菌較為詳細(xì)。1.霉菌霉菌（mold）是一些“絲狀真菌”的統(tǒng)稱，不是分類學(xué)上的名詞。霉菌菌體均由分枝或不分枝的菌絲（hypha）構(gòu)成。許多菌絲交織在一起，稱為菌絲體（mycelium）。菌絲在光學(xué)顯微鏡下呈管狀，直徑約為2~10?m，比一般細(xì)菌和放線菌菌絲大幾到幾十倍。霉菌菌絲有兩類（圖2-26）：1）無隔膜菌絲，整個菌絲為長管狀單細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有多個核。其生長過程只表現(xiàn)為菌絲的延長和細(xì)胞核的裂殖增多以及細(xì)胞質(zhì)的增加。如根霉、毛霉、犁頭霉等。2）多數(shù)為有隔膜菌絲，菌絲由橫隔膜分隔成成串多細(xì)胞，每個細(xì)胞內(nèi)含有一個或多個細(xì)胞核。有些菌絲，從外觀看雖然像多細(xì)胞，但橫隔膜上有小孔，使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核可以自由流通，而且每個細(xì)胞的功能也都相同。如青霉菌、曲霉菌、白地霉等絕大多數(shù)霉菌菌絲均屬此類。在固體培養(yǎng)基上，部分菌絲伸入培養(yǎng)基內(nèi)吸收養(yǎng)料，稱為營養(yǎng)菌絲；另一部分則向空中生長，稱為氣生菌絲。有的氣生菌絲發(fā)育到一定階段，分化成繁殖菌絲。霉菌在自然界分布極廣，土壤、水域、空氣、動植物體內(nèi)外均有它們的蹤跡。它們同人類的生產(chǎn)、生活關(guān)系密切，是人類實踐活動中最早認(rèn)識和利用的一類微生物?，F(xiàn)在，霉菌在發(fā)酵工業(yè)上廣泛用來生產(chǎn)酒精、抗生素（青霉素、灰黃霉素）、有機(jī)酸（檸檬酸、葡萄糖酸、延胡索酸等）、酶制劑（淀粉酶、果膠酶、纖維素酶等）、維生素、甾體激素等。在農(nóng)業(yè)上用于飼料發(fā)酵、植物生長刺激素（赤霉素）、殺蟲農(nóng)藥（白僵菌劑）等。腐生型霉菌在自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)化中也有十分重要的作用。另外，霉菌也是造成許多食品霉變變質(zhì)的主要原因。例如，據(jù)統(tǒng)計全世界平均每年由于霉變而不能食（飼）用的谷物約占2%，這是一筆相當(dāng)驚人的經(jīng)濟(jì)損失。2.酵母菌酵母菌（yeast）是一群單細(xì)胞的真核微生物。這個術(shù)語也是無分類學(xué)意義的普通名稱，通常用于以芽殖或裂殖來進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真菌，以與霉菌區(qū)分開。極少數(shù)種可產(chǎn)生子囊孢子進(jìn)行有性繁殖。在光學(xué)顯微鏡下，大多數(shù)酵母菌為單細(xì)胞，一般呈卵圓形、圓形、圓柱形或檸檬形。大小約為1~5×5~30mm，最大可達(dá)100mm。各種酵母菌有其一定的大小和形態(tài)，但也隨菌齡和環(huán)境條件而異。即使在純培養(yǎng)中，各個細(xì)胞的形狀、大小亦有差別。有些酵母菌細(xì)胞與其子代細(xì)胞連在一起成為鏈狀，成為假絲酵母（圖2-27）。酵母菌與人類生活關(guān)系也十分密切，在釀造、食品、醫(yī)藥工業(yè)等方面占有重要地位。另外，酵母菌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高達(dá)細(xì)胞干重的50%以上，并含有人體必需的氨基酸，所以酵母菌可以成為食品和飼料的重要補(bǔ)充。當(dāng)然，酵母菌也常給人類帶來危害。腐生型酵母菌能使食品、紡織品和其它原料腐敗變質(zhì)，少數(shù)嗜高滲壓酵母菌如魯氏酵母（Saccharomycesrouxii）、蜂蜜酵母（Saccharomycesmellis）可使蜂蜜、果醬敗壞；有的酵母菌還可引起人和植物的病害。例如白假絲酵母（Candidaalbicans，又稱白色念珠菌）可引起皮膚、粘膜、呼吸道、消化道以及泌尿系統(tǒng)等的多種疾病。而新型隱球酵母（Cryptococcusneoformans）還能引起慢性腦膜炎、肺炎等疾病。三、藻類藻類（algae）是指除苔蘚植物和維管束植物以外，基本上有葉綠素，可進(jìn)行光合作用，并伴隨放出氧氣的一大類真核生物，它們大多屬于只有通過顯微鏡才能觀察到個體形態(tài)的微生物。但也有一些藻類個體很大，例如大的海藻可長達(dá)若干英尺。藻類的大小、形態(tài)有很大差別（圖2-28），許多是單細(xì)胞的，也有些藻類是單細(xì)胞的群體。有些群體可以是由分裂后單個的、相似的細(xì)胞互相粘連而成的簡單聚集，也可能是由具有特殊功能的，分化了的不同細(xì)胞所組成，它們變得很復(fù)雜，而且表面結(jié)構(gòu)類似于高等植物。藻類在自然界，特別是各種水體中廣泛存在，常常是影響水質(zhì)的重要原因。例如有些自來水的怪味就是在供水系統(tǒng)中生長的藻類引起的，而藻類在近海的大量繁殖，也會由于水中氧氣的大量消耗而引起魚類和其它海洋生物的窒息、死亡，形成對漁業(yè)生產(chǎn)影響極大的赤潮。四、原生動物原生動物（Prokaryote）是一類缺少真正細(xì)胞壁，細(xì)胞通常無色，具有運動能力，并進(jìn)行吞噬營養(yǎng)的單細(xì)胞真核生物。它們個體微小，大多數(shù)都需要顯微鏡才能看見。原生動物在自然界，特別是海水、淡水中大量存在，它們也與各種動植物在不同組織水平上形成共生體，有些對宿主無害，有些對宿主有利，有些對宿主有害。也有一些原生動物能引起人類疾病。小結(jié)1從混合在一起的微生物群體中得到特定的某一種微生物的純培養(yǎng)，是研究和利用微生物的最重要的環(huán)節(jié)之一。無菌操作技術(shù)是微生物學(xué)的重要技術(shù)，而且廣泛地被其它學(xué)科和生產(chǎn)實際所利用。2通過稀釋或劃線等手段，在瓊脂平板上得到微生物的單菌落是最常用的純種分離手段。3傳代培養(yǎng)、干燥保藏、冷凍保藏是通常使用的微生物菌種保藏技術(shù)。4微生物個體微小，通常必須通過顯微鏡才能觀察到其個體形態(tài)，而進(jìn)行顯微觀察時，分辨率和反差是決定顯微觀察效果的二個最重要的因素。它們與顯微鏡的特性有關(guān)，也取決于樣品的制備與觀察技術(shù)。無論是光學(xué)顯微鏡還是電子顯微鏡，其設(shè)備和技術(shù)發(fā)展迅速，應(yīng)用面越來越廣泛和深入。5在顯微鏡下微生物的大小與形態(tài)千差萬別，豐富多彩，是區(qū)分不同微生物的重要依據(jù)之一。思考題1.一般說來，嚴(yán)格的無菌操作是一切微生物工作的基本要求，但在分離與培養(yǎng)極端嗜鹽菌時常在沒有點酒精燈的普通實驗臺上傾倒培養(yǎng)平板、在日常環(huán)境中直接打開皿蓋觀察和挑取菌落，而其研究結(jié)果并沒有因此受到影響，你知道這是為什么嗎？2.如果希望從環(huán)境中分離得到厭氧固氮菌，你該如何設(shè)計實驗？3.為什么光學(xué)顯微鏡的目鏡通常都是15×？是否可以采用更大放大倍率的目鏡（如30×）來進(jìn)一步提高顯微鏡的總放大倍數(shù)？4.培養(yǎng)條件對微生物個體的大小有那些影響？你是否能很快地在顯微鏡下區(qū)分同為單細(xì)胞的細(xì)菌、酵母菌、和原生動物？第三章微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能計劃學(xué)時：5重點：原核微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，真核微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能。在有細(xì)胞構(gòu)造的微生物中，按其細(xì)胞，尤其是細(xì)胞核的構(gòu)造和進(jìn)化水平上的差別，可把它們分為原核微生物和真核微生物兩個大類。近年來正在越來越深入研究的古細(xì)菌（archaebacteria）或古生菌（archaea），盡管其在進(jìn)化譜系上與真細(xì)菌（eubacteria）和真核生物相互并列，但其在細(xì)胞構(gòu)造上卻與真細(xì)菌較為接近，同屬于原核生物。因此，有關(guān)古生菌細(xì)胞構(gòu)造和功能的內(nèi)容，擬放在原核微生物一節(jié)中加以討論。第一節(jié)原核微生物原核微生物是指一大類細(xì)胞核無核膜包裹，只有稱作核區(qū)(nuclearregion)的裸露DNA的原始單細(xì)胞生物，包括真細(xì)菌和古生菌兩大群。真細(xì)菌的細(xì)胞膜含由酯鍵連接的脂類，細(xì)胞壁中含特有的肽聚糖（無壁的枝原體除外），DNA中一般沒有內(nèi)含子（但近年來也有例外的發(fā)現(xiàn)）。細(xì)菌、放線菌、藍(lán)細(xì)菌、枝原體、立克次氏體和衣原體等都屬于真細(xì)菌。以下就以最常見的細(xì)菌作主要代表詳細(xì)闡述原核生物細(xì)胞的各部分構(gòu)造和功能。細(xì)菌細(xì)胞的模式構(gòu)造見圖3-1。其中把一般細(xì)菌都有的構(gòu)造稱一般構(gòu)造，而把部分細(xì)菌具有的或一般細(xì)菌在特殊環(huán)境下才有的構(gòu)造稱為特殊構(gòu)造。一、細(xì)胞壁細(xì)胞壁（cellwall）是位于細(xì)胞最外的一層厚實、堅韌的外被，主要由肽聚糖構(gòu)成，有固定細(xì)胞外形和保護(hù)細(xì)胞等多種生理功能。通過染色、質(zhì)壁分離（plasmolysis）或制成原生質(zhì)體后再在光學(xué)顯微鏡下觀察，可證實細(xì)胞壁的存在；用電子顯微鏡觀察細(xì)菌超薄切片等方法，更可確證細(xì)胞壁的存在。細(xì)胞壁的主要功能有：①固定細(xì)胞外形和提高機(jī)械強(qiáng)度，從而使其免受滲透壓等外力的損傷。例如，有報道說大腸桿菌（Escherichiacoli）的膨壓(turgor)可達(dá)2個大氣壓（相當(dāng)于汽車內(nèi)胎的壓力）；②為細(xì)胞的生長、分裂和鞭毛運動所必需。失去了細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，也就喪失了這些重要功能；③阻攔酶蛋白和某些抗生素等大分子物質(zhì)（分子量大于800）進(jìn)入細(xì)胞，保護(hù)細(xì)胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物質(zhì)的損傷