蛋白質(zhì)的定性定量分析課件

蛋白質(zhì)定性分析

(qualitativeanalysis)

確定樣品中是否有蛋白質(zhì)存在，以及存在的是何種蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)定量分析

(quantitativeanalysis)

確定樣品中總蛋白含量，或者某種單一蛋白成分的含量第2頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)含量的測定方法（重點掌握）

蛋白質(zhì)相對分子量測定(SDS)

等電聚焦電泳(IEF)（一般了解）

蛋白質(zhì)的免疫印跡分析

(westernblotting)第3頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第一章蛋白質(zhì)的含量測定蛋白質(zhì)的含量測定基于蛋白質(zhì)的元素組成特點基于蛋白質(zhì)的化學(xué)顯色反應(yīng)基于蛋白質(zhì)的光吸收特性第4頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)元素組成的特點各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16%第5頁,共35頁，2024年2月25日，星期天一、紫外光譜(A280)吸收法

這一方法可用來快速檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)成分。通常用于柱層析過程中檢測蛋白質(zhì)的洗脫峰第6頁,共35頁，2024年2月25日，星期天原理

色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近

大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收第7頁,共35頁，2024年2月25日，星期天所需時間幾分鐘優(yōu)點快速缺點核酸可引起強干擾作用靈敏度

0.2mg/ml～2mg/ml對蛋白質(zhì)無破壞性不是嚴格的定量，適用于測定蛋白質(zhì)粗提液第8頁,共35頁，2024年2月25日，星期天計算方法標準曲線法蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事項石英比色杯調(diào)零所用溶液配制標準蛋白所用溶液光密度范圍第9頁,共35頁，2024年2月25日，星期天二、Bradford檢測法

這是一種迅速、可靠的通過染色法測定溶液中蛋白質(zhì)含量的方法第10頁,共35頁，2024年2月25日，星期天原理

該法是基于考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)。藍色復(fù)合物在595mn波長處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測595mn的光吸收值大小計算蛋白的含量第11頁,共35頁，2024年2月25日，星期天所需時間

10min優(yōu)點快速（反應(yīng)時間僅需2min）敏感，幾乎沒有蛋白質(zhì)損失缺點用這種測定方法對蛋白質(zhì)引起不可逆的變性靈敏度

25ug/ml～200ug/ml對各種純化蛋白質(zhì)反應(yīng)不同第12頁,共35頁，2024年2月25日，星期天計算方法標準曲線法注意事項標準曲線在2.5ug～15ugBSA濃度范圍內(nèi)保持線性關(guān)系反應(yīng)10～15min后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質(zhì)溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀若選用目的蛋白來做標準曲線或用另一種方法來校正，所測蛋白濃度較準確第13頁,共35頁，2024年2月25日，星期天三、Lowry檢測法

這一標準、快速的蛋白質(zhì)定量檢測方法已得到廣泛應(yīng)用，在檢測之前可通過蛋白質(zhì)沉淀將干擾物質(zhì)去除第14頁,共35頁，2024年2月25日，星期天原理

首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產(chǎn)生鉬藍和鎢藍復(fù)合物的深藍色，這種深藍色的復(fù)合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計算蛋白質(zhì)的含量第15頁,共35頁，2024年2月25日，星期天所需時間

40min優(yōu)點一種可靠的蛋白質(zhì)定量方法不同蛋白質(zhì)之間差別很小缺點某些試劑不穩(wěn)定靈敏度

5ug/ml～100ug/ml干擾物質(zhì)多反應(yīng)速度慢使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性第16頁,共35頁，2024年2月25日，星期天計算方法標準曲線法注意事項在加入試劑30min后呈色達到飽和，時間延長顏色信號減弱許多干擾物質(zhì)降低顏色反應(yīng)高鹽濃度可引起沉淀第17頁,共35頁，2024年2月25日，星期天四、BCA(二喹啉甲酸)檢測法

這是近年來新研制的一種改進的Lowry測定法，反應(yīng)簡單而且?guī)缀鯖]有干擾物質(zhì)的影響第18頁,共35頁，2024年2月25日，星期天原理

在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡(luò)合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計算蛋白質(zhì)的含量第19頁,共35頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點與Lowry法相比幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響缺點蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變性靈敏度標準檢測：10～1200ug/ml單一試劑終產(chǎn)物穩(wěn)定反應(yīng)時間長微量檢測：0.5～10ug/ml第20頁,共35頁，2024年2月25日，星期天計算方法標準曲線法注意事項與Lowry相比，采用BCA法時，如果樣品中含有脂類物質(zhì)將明顯提高光吸收值為促進BCA法的反應(yīng)進程，可將樣品適當加熱第21頁,共35頁，2024年2月25日，星期天小結(jié)（Summary）掌握常用的測定方法不同方法的操作步驟操作過程的注意事項第22頁,共35頁，2024年2月25日，星期天其它蛋白質(zhì)的定性定量方法1.蛋白質(zhì)的染色定量2.ELISA測定3.放射免疫測定第23頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)蛋白質(zhì)相對分子量測定分子量測定(molecularweight,MW)排阻層析沉降平衡超速離心動態(tài)彈性光散射孔徑梯度電泳質(zhì)譜(ESI-MS)第24頁,共35頁，2024年2月25日，星期天一、SDS測定蛋白質(zhì)的相對分子量1.不連續(xù)系統(tǒng)原理2.SDS凝膠的制備制備分離膠制備濃縮膠加樣裝板電泳卸板并進行凝膠染色SDS第25頁,共35頁，2024年2月25日，星期天3.SDS基本原理

SDS

影響遷移率的因素

十二烷基硫酸鈉

(sodiumdodecylsulfate)

十二烷基磺酸鈉

(sodiumdodecylsulfate)

第26頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

SDS作用：與蛋白牢固結(jié)合，當其濃度大于1mmol/L時，SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合比例為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)，由于十二烷基硫酸根帶負電荷，使得樣品中各種蛋白質(zhì)與SDS形成的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)分子間天然的電荷差異第27頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物分子構(gòu)型也幾乎相同(雪茄煙形的長橢圓棒狀的復(fù)合物)，而且具有相同的荷質(zhì)比，因此在SDS中，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳遷移率只與其分子量有關(guān)，而不再受所帶電荷及分子形狀的影響，且在一定條件下，遷移率與分子量呈對數(shù)線性關(guān)系WatchSDS原理第28頁,共35頁，2024年2月25日，星期天4.SDS測定分子量的操作標準品的選擇及處理待測樣品的制備電泳分離及染色相對遷移率的計算WatchSDS操作第29頁,共35頁，2024年2月25日，星期天AnalysisforSDSelectrophoresis第30頁,共35頁，2024年2月25日，星期天5.注意事項選擇合適的膠濃度樣品中高濃度的陽離子可能會導(dǎo)致SDS的沉淀，應(yīng)在加入樣品緩沖液之前將其除去

SDS與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合程度蛋白質(zhì)的分子量范圍15～200KD之間二硫鍵是否完全被還原溶液中SDS的濃度溶液的離子強度第31頁,共35頁，2024年2月25日，星期天多亞基蛋白質(zhì)分子量檢測用其它方法測定分子量進行參照

SDS和巰基乙醇

SDS測定的準確性電荷異常或構(gòu)象異常帶有較大輔基的蛋白質(zhì)某些結(jié)構(gòu)蛋白第32頁,共35頁，2024年2月25日，星期天二、凝膠過濾層析測定蛋白質(zhì)的相對分子量1.基本原理2.凝膠過濾測定分子量的操