色譜分析法概論17.1.1.色譜法的起源和發(fā)展混合物最有效的分離、分析方法。俄國植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。色譜法是一種分離技術(shù)色譜法（層析法）不僅用于有色物質(zhì)分離，且大量用于無色物質(zhì)分離。管內(nèi)填充物，稱為固定相。另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。17.1概述第2頁,共48頁，2024年2月25日，星期天30年代出現(xiàn)薄層色譜法40年代紙色譜法(塔板理論)50年代氣相色譜法興起，奠定了現(xiàn)代色譜法的基礎(chǔ)，可“在線”分析。（速率理論）60年代氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)70年代高效液相色譜法(HPLC)的崛起,把色譜法又推進(jìn)到一個新里程碑。80年代液相色譜聯(lián)用技術(shù)、超臨界流體色譜90年代毛細(xì)管電泳法發(fā)展歷程第3頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(1)．按兩相分子的聚集狀態(tài)分：流動相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜17.1.2.色譜法的分類第4頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(2)．按操作形式分類：3．按分離機(jī)制分：平板色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜毛細(xì)管柱色譜

分配色譜：利用分配系數(shù)的不同

吸附色譜：利用物理吸附性能的差異

離子交換色譜：利用離子交換原理

空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同第5頁,共48頁，2024年2月25日，星期天色譜法氣相色譜法(GC)GasChromatography液相色譜法(LC)LiquidChromatography超臨界流體色譜法（SFC）柱色譜法氣固色譜氣液色譜平板色譜法柱色譜法毛細(xì)管電泳法紙色譜法薄層色譜離子交換液固液液空間排阻第6頁,共48頁，2024年2月25日，星期天17.2色譜過程與術(shù)語

當(dāng)流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。（動畫）兩相及兩相的相對運(yùn)動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)17.2.1色譜過程第7頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

經(jīng)色譜柱分離后的樣品組份通過檢測器時，所產(chǎn)生的電信號強(qiáng)度對時間作圖，所繪得曲線稱為色譜圖或流出曲線17.2.2基本術(shù)語(P436)1.色譜第8頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(1)

基線基線是在操作條件下，沒有組份流出時的流出曲線基線反映儀器的噪音隨時間的變化穩(wěn)定的理想基線應(yīng)該是一條水平直線．基線漂移:基線在一段時間內(nèi)朝某一個方向變化.第9頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(2)峰高或峰面積

色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以h表示，第10頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

用來衡量色譜峰寬度的重要參數(shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)差(

)：正態(tài)分布曲線上兩拐點(diǎn)間距離的一半。反映組分分散程度。（2）峰底寬

(W)：W=4

（3）半峰寬

(W1/2)：色譜峰高一半處的寬度W1/2=2.355

或W=1.699W1/2(3)峰寬第11頁,共48頁，2024年2月25日，星期天保留時間和調(diào)整保留時間是色譜法的基本定性參數(shù)(1)保留時間（tR）：試樣從進(jìn)樣開始到某個組份色譜峰頂點(diǎn)的時間間隔，稱為保留時間；(3)調(diào)整保留時間（tR

＇）：tR＇=tR－t0

(2)死時間（t0）：不與固定相作用的物質(zhì)（如空氣）的保留時間；2.保留值第12頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

(4)保留體積（VR）：

VR=tR×FcFc為流動相流速，單位：mL/min。

(5)死體積（V0）：

V0=t0×Fc

(6)調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR

－V0

VR’

也是常用的色譜定性參數(shù)之一第13頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

又稱Kovats指數(shù)，是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測定方法：將正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。其它物質(zhì)的保留指數(shù)（IX）是通過選定兩個相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有Z和Z＋1個碳原子。被測物質(zhì)X的調(diào)整保留時間應(yīng)在相鄰兩個正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值之間如圖所示：(7)保留指數(shù)(I)第14頁,共48頁，2024年2月25日，星期天保留指數(shù)計算方法第15頁,共48頁，2024年2月25日，星期天例在ApiezolL柱上，柱溫100℃，用正庚烷及正辛烷為參考物質(zhì)對，測得t0=30.0s，正庚烷的tR=204.0s，乙酸正丁酯的tR=340.0s及正辛烷的tR=403.4s。說明乙酸正丁酯在ApiezolL柱上的保留行為相當(dāng)于7.756個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留行為。Ix=100（）=775.6第16頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3.分配系數(shù)與容量因子(P439)(1)分配系數(shù)

組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。第17頁,共48頁，2024年2月25日，星期天分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)（或稱交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)第18頁,共48頁，2024年2月25日，星期天容量因子是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時的質(zhì)量比：分配系數(shù)與容量因子都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。分配系數(shù)與容量因子都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。容量因子可以由實驗測得。容量因子也稱：分配比；質(zhì)量分配系數(shù)；(2)容量因子第19頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(3)分配系數(shù)和容量因子的關(guān)系第20頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(4)分配系數(shù)和容量因子與保留時間關(guān)系k值相當(dāng)于組分被固定相滯留的時間和流動相通過系統(tǒng)所需時間的比值第21頁,共48頁，2024年2月25日，星期天tR與K的關(guān)系：第22頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

結(jié)論：色譜分離前提→各組分分配系數(shù)不等

注：應(yīng)選擇合適分離條件使得難分離的組分K不等第23頁,共48頁，2024年2月25日，星期天4.分離參數(shù)(1)分離因子(α)兩種物質(zhì)調(diào)整保留值之比，又稱為分配系數(shù)比或選擇性系數(shù)第24頁,共48頁，2024年2月25日，星期天色譜分離中的幾種情況如圖所示：分離度（Rs

），又稱分辨率：反映組分在色譜柱分離情況。(2)分離度(Rs)第25頁,共48頁，2024年2月25日，星期天分離度的表達(dá)式：R=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%；R=1：分離程度95.4%；（4σ）R=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。第26頁,共48頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少個數(shù)．根據(jù)色譜峰的保留值(或位置），可以進(jìn)行定性分析．根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析．色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評價色譜柱分離效能的依據(jù)．色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(和流動相)選擇是否合適的依據(jù)．小結(jié)：色譜流出曲線的物理意義第27頁,共48頁，2024年2月25日，星期天組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過程的動力學(xué)因素控制；（兩相中的運(yùn)動阻力，擴(kuò)散）17.3色譜分離的基本理論塔板理論速率理論

色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標(biāo)及其關(guān)系。第28頁,共48頁，2024年2月25日，星期天1.塔板理論最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引人理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)第29頁,共48頁，2024年2月25日，星期天塔板理論的四個基本假設(shè)（i）色譜柱是由一系列連續(xù)、等距的水平塔板組成。在柱內(nèi)每層塔板內(nèi)部，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。（ii）流動相進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是間歇式前進(jìn)，每次前進(jìn)為一個塔板體積。（iii）所有組分開始時存在于第1號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。（iv）分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)。第30頁,共48頁，2024年2月25日，星期天分配色譜過程模型的舉例根據(jù)上述假定，在色譜分離過程中，該組分分布可計算如下：開始時，若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1μg）的該組分加到第1號塔板上。由于kA=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。KB=0。（動畫）第31頁,共48頁，2024年2月25日，星期天理論塔板高度和理論塔板數(shù)H=σ2/Ln=L/Hn=16(tR/W)2n=(tR/σ)2n=5.54(tR/W1/2)2理論塔板高度(H)和理論塔板數(shù)(n)都是柱效指標(biāo)。σ或W1/2↓，H↓，柱效↑用t’R代替tR計算塔板數(shù)，稱為有效理論塔板數(shù)(nef)；求得的塔板高度為有效理論塔板高度（Hef）第32頁,共48頁，2024年2月25日，星期天從上兩式可以看出：1：色譜峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標(biāo)。2：在同一色譜柱上，不同組分得到不同的理論塔板數(shù)，同一組分在不同色譜條件下理論塔板數(shù)也不相等。n=16(tR/w)2n=L/H第33頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2.速率理論1956年荷蘭學(xué)者范第姆特（VanDeemter）等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學(xué)理論——速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程，從而在動力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用。范第姆特（VanDeemter）方程的數(shù)學(xué)簡化式為式中u為流動相的線速度；A，B，C為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散項系數(shù)、縱向擴(kuò)散項系數(shù)、傳質(zhì)阻抗項系數(shù)?，F(xiàn)分別敘述各項系數(shù)的物理意義。第34頁,共48頁，2024年2月25日，星期天（1）渦流擴(kuò)散項的概念

在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類似“渦流”的流動，故稱渦流擴(kuò)散。（動畫）第35頁,共48頁，2024年2月25日，星期天渦流擴(kuò)散項的影響因素1:渦流擴(kuò)散項與填充物的平均直徑的大小和填充不規(guī)則因子有關(guān)，與流動相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關(guān)。2:為了減少渦流擴(kuò)散，提高柱效，使用細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對于空心毛細(xì)管，不存在渦流擴(kuò)散。因此A＝0。

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子第36頁,共48頁，2024年2月25日，星期天（2）縱向擴(kuò)散項的概念

縱向擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。如右圖所示。它隨著流動相向前推進(jìn)，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)地向前和向后擴(kuò)散，造成譜帶展寬。（動畫）第37頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

B=2γ

Dg

γ

：擴(kuò)散阻礙因子。填充柱色譜，γ

<1。

Dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）

(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;(2)擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;(3)分子擴(kuò)散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴(kuò)散↑;(4)擴(kuò)散系數(shù)：Dg

∝(M載氣)-1/2；M載氣↑，B值↓。縱向擴(kuò)散項的影響因素第38頁,共48頁，2024年2月25日，星期天傳質(zhì)過程的概念在氣—液填充柱中，將高沸點(diǎn)液體(固定液)涂在多孔性載體上構(gòu)成固定相。樣品混合物被載氣帶入色譜柱后，組分在氣—液界面進(jìn)入固定液，并擴(kuò)散至固定液深部，進(jìn)而達(dá)到動態(tài)分配“平衡”。當(dāng)純凈載氣或含有低于“平衡”濃度的載氣到來時，固定液中該組分的分子將逐次回到氣—液界面，逸出，而被載氣帶走(轉(zhuǎn)移)。這種溶解、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移的過程稱為傳質(zhì)過程。影響此過程進(jìn)行的阻力稱為傳質(zhì)阻抗，用傳質(zhì)阻抗系數(shù)描述。（3）傳質(zhì)阻抗項（動畫）第39頁,共48頁，2024年2月25日，星期天傳質(zhì)阻抗對峰寬的影響由于液相傳質(zhì)阻抗的存在，增加了組分在固定液中停留的時間，而晚回到載氣中去。因此這些組分的分子落后于在兩相界面迅速平衡并隨同載氣流動的分子，使峰展寬，如圖所示。第40頁,共48頁，2024年2月25日，星期天減少傳質(zhì)阻抗的辦法降低固定液液膜厚度(df)是減小傳質(zhì)阻抗系數(shù)的主要方法。在能完全覆蓋載體表面的前提下，適當(dāng)減少固定液的用量。但固定液也不能太少，否則柱壽命短。且df還影響k值，df小，k小。第41頁,共48頁，2024年2月25日，星期天載氣流速與柱效——最佳流速載氣流速高時：

傳質(zhì)阻抗項是影響柱效的主要因素，流速

，柱效

。載氣流速低時：

縱向擴(kuò)散項成為影響柱效的主要因素，流速

,柱效

。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。第42頁,共48頁，2024年2月25日，星期天速率理論的要點(diǎn)(1)組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與