酶聯(lián)免疫吸附分析第七章酶聯(lián)免疫吸附分析

第2頁,共37頁，2024年2月25日，星期天抗原：抗原是指進入人或動物機體后，可刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，從而引起動物產生抗體或形成致敏淋巴細胞，并能和抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應的物質?？贵w：是由抗原刺激動物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)產生分泌的能和相應抗原發(fā)生特異性結合的免疫球蛋白?？乖贵w的基本特性：a、反應的特異性；b、反應的等比例性第3頁,共37頁，2024年2月25日，星期天抗原-抗體識別反應示意圖第4頁,共37頁，2024年2月25日，星期天它采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）一、ELISA原理第5頁,共37頁，2024年2月25日，星期天測量時，抗原（抗體）先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應結合后，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。ELISA原理第6頁,共37頁，2024年2月25日，星期天YY其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。

這種有色產物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。

方法簡單，方便迅速，特異性強。ELISA原理第7頁,共37頁，2024年2月25日，星期天酶及其底物酶結合物（過碘酸鹽氧化法、戊二醛交聯(lián)法）是酶與抗體或抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結的產物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應。ELISA原理第8頁,共37頁，2024年2月25日，星期天酶底物顯色反應

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

第9頁,共37頁，2024年2月25日，星期天ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素的ELISA

第10頁,共37頁，2024年2月25日，星期天（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原第11頁,共37頁，2024年2月25日，星期天獲得待分析物的未標定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結合的抗體及雜質加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結合位點洗滌并除去未結合的封閉蛋白加受檢標本（抗原）形成固相抗體－抗原復合物洗滌除去其他未結合的物質加酶標抗體生成抗體—待測抗原—酶標記抗體的復合物徹底洗滌未結合的酶標抗體加底物進行酶催化反應根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定第12頁,共37頁，2024年2月25日，星期天

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法第13頁,共37頁，2024年2月25日，星期天包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標本:使相應抗體與固相抗原結合洗滌，除去無關的物質加酶標抗抗體:與固相載體上抗原抗體復合物結合；洗滌，除去未結合的酶標抗抗體加底物顯色根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定第14頁,共37頁，2024年2月25日，星期天ELISA法間接法測定抗體1.原理第15頁,共37頁，2024年2月25日，星期天（三）競爭法

對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結合的結果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結合，使固相上結合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應較弱。第16頁,共37頁，2024年2月25日，星期天用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結合對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結合分別洗滌除去未結合的成分加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計算標本中待測抗原含量第17頁,共37頁，2024年2月25日，星期天ELISA特點一：靈敏性該測定法的靈敏度來自作為報告基團的酶。酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應，產生可供觀察的顯色反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。例如，在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為5-10μg/ml。

第18頁,共37頁，2024年2月25日，星期天特點二：特異性其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗原抗體的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。

第19頁,共37頁，2024年2月25日，星期天ELISA要有三個必要的試劑，即免疫吸附劑、結合物和酶的底物。完整的ELISA試劑盒應包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）；

（2）酶標記的抗原或抗體（酶標記物）；

（3）酶的底物；

（4）系列參考標準品（定量測定）；

（5）酶標記物及樣本的稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）反應終止液。二、ELISA試劑第20頁,共37頁，2024年2月25日，星期天ELISA試劑盒第21頁,共37頁，2024年2月25日，星期天ELISA試劑的作用2.1免疫吸附劑：已包被抗原或抗體的固相載體，是ELISA方法中的核心試劑。固相載體：

固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。專用于EILSA的產品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。

良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。第22頁,共37頁，2024年2月25日，星期天包被將抗原或抗體固定化的過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。抗體或蛋白質等抗原是通過物理吸附與聚苯乙烯等固相載體結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的相互作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。第23頁,共37頁，2024年2月25日，星期天封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被固相載體表面剩余吸附位點的過程。蛋白質抗原或抗體包被時所用的一般濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的吸附位點，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些吸附位點，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附，增加ELISA反應得專一性和靈敏度。封閉的程序與包被過程相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。研究表明，脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。第24頁,共37頁，2024年2月25日，星期天2.2酶標記物即酶標記的抗原或抗體，是ELISA中最關鍵的試劑。良好的酶標記物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。酶標記物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當?shù)姆肿颖壤诿笜擞浳镏袘M量不含有或少含有游離的（未結合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外酶標記物還要有良好的穩(wěn)定性。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。第25頁,共37頁，2024年2月25日，星期天2.3酶的底物2.3.1、HRP的底物

HRP催化過氧化物的氧化反應，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：

DH2+H2O2D+H2O

上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)

第26頁,共37頁，2024年2月25日，星期天2.3.1HRP的底物OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。TMB經HRP作用后產物顯藍色，酶反應用HCl或H2SO4終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。。第27頁,共37頁，2024年2月25日，星期天

2.4.2AP的底物

AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。

第28頁,共37頁，2024年2月25日，星期天2.5洗滌液

滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。第29頁,共37頁，2024年2月25日，星期天2.6對照品陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質，其中加入一定量的待檢物質，此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。2.7標準品定量測定的ELISA試劑盒應含有制作標準曲線用的標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。第30頁,共37頁，2024年2月25日，星期天1、樣品的采集與保存2、試劑的準備3、包被4、加樣

在ELISA實驗中一般有5次加樣步聚，即加標準品、加樣本、加酶標記物、加底物、加反應終止液。三、ELISA實驗過程第31頁,共37頁，2024年2月25日，星期天4、保溫

在ELISA中一般加標本和加酶標記物后會有一次抗原抗體反應?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。

第32頁,共37頁，2024年2月25日，星期天5、洗滌

目的：分離游離的酶標記物。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。洗滌的方式：自動洗滌儀與手工操作。a.吸干或甩干孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍;c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內液體;e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。

第33頁,共37頁，2024年2月25日，星期天6、顯色和比色顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將達到顯色的頂峰，再延長反應時間，可使本底值增高。底物液受光照會自行變色