第二部分

毒理學(xué)試驗方法

MethodsofToxicologicalTest

95

一、總則

GeneralPrinciples

1范圍

本規(guī)范規(guī)定了化妝品原料及其產(chǎn)品安全性評價的毒理學(xué)檢測要求。

2化妝品原料的檢測

化妝品的新原料，一般需進行下列毒理學(xué)試驗：

（1）急性經(jīng)口和急性經(jīng)皮毒性試驗；

（2）皮膚和急性眼刺激性/腐蝕性試驗；

（3）皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗；

（4）皮膚光毒性和光敏感試驗*（原料具有紫外線吸收特性需做該項試驗）；

（5）致突變試驗（至少應(yīng)包括一項基因突變試驗和一項染色體畸變試驗）；

（6）亞慢性經(jīng)口和經(jīng)皮毒性試驗；

（7）致畸試驗；

（8）慢性毒性/致癌性結(jié)合試驗；

（9）毒物代謝及動力學(xué)試驗*;

（10）根據(jù)原料的特性和用途，還可考慮其它必要的試驗。

如果該新原料與已用于化妝品的原料化學(xué)結(jié)構(gòu)及特性相似，則可考慮減少某些試驗。

*試驗方法參照GB7919-87化妝品安全性評價程序和方法；

OECD化學(xué)物質(zhì)試驗指南（OECDGuidelinesforTestingofChemicals）。

3化妝品產(chǎn)品的檢測

3.1檢測項目

在一般情況下，新開發(fā)的化妝品產(chǎn)品在投放市場前，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的用途和類別進行相應(yīng)

的試驗，以評價其安全性。

3.2檢測項目的選擇原則

3.2.1由于化妝品種類繁多，在選擇試驗項目時應(yīng)根據(jù)實際情況確定。

3.2,2每天使用的化妝品需進行多次皮膚刺激性試驗，進行多次皮膚刺激性試驗者不再進

行

急性皮膚刺激性試驗，間隔數(shù)日使用的和用后沖洗的化妝品進行急性皮膚刺激性試驗。

3.2.3與眼接觸可能性小的產(chǎn)品不需進行急性眼刺激性試驗。

96

二、急性經(jīng)口毒性試驗

AcuteOralToxicityTest

1范圍

本規(guī)范規(guī)定了動物急性經(jīng)口毒性試驗的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料安全性毒理學(xué)檢測。

2規(guī)范性引用文件

OECDGuidelinesforTestingofChemicals（No.401,Feb.1987）

USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines（Series870.1100,Aug.1998）

3試驗?zāi)康?/p>

急性經(jīng)口毒性試驗是評估化妝品原料毒性特性的第一步，通過短時間經(jīng)口染毒可提供對

健康危害的信息。試驗結(jié)果可作為化妝品原料毒性分級和標簽標識以及確定亞慢性毒性試驗

和其它毒理學(xué)試驗劑量的依據(jù)。

4定義

4.1急性經(jīng)口毒性（Acuteoraltoxicity）：一次或在24h內(nèi)多次經(jīng)口給予實驗動物受試

物后，

動物在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。

4.2經(jīng)口LD50（半數(shù)致死量，Mediumlethaldose）：經(jīng)口一次給予受試物后，引起實

驗動物

總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計學(xué)劑量。以單位體重接受受試物的重量（mg/kg或g/kg）

來表

示。

5試驗的基本原則

以管飼法經(jīng)口給予各試驗組動物不同劑量的受試物，每組用一個劑量，染毒劑量的選擇

可通過預(yù)試驗確定。染毒后觀察動物的毒性反應(yīng)和死亡情況。試驗期間死亡的動物要進行尸

檢，試驗結(jié)束時仍存活的動物要處死并進行尸檢。本方法主要適用于嚙齒類動物的研究，但

也可用于非嚙齒類動物的研究。

6試驗方法

6.1受試物

受試物應(yīng)溶解或懸浮于適宜的介質(zhì)中，建議首選水，其次是植物油（如玉米油），或考慮

使用其它介質(zhì)（如竣甲基纖維素、明膠、淀粉等）。對非水溶性介質(zhì)，應(yīng)了解其毒理特性，

否則應(yīng)在試驗前先確定其毒性。每次經(jīng)口染毒液體的最大容量取決于實驗動物的大小，對嚙

齒類動物所給液體容量一般為lmL/100g,水溶液可至2mL/100g。通過調(diào)整受試物溶液

濃度

使各劑量組經(jīng)口染毒的容量一致。

6.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

首選健康成年大鼠和小鼠，也可選用其它敏感動物。使用雌性動物應(yīng)是未孕和未曾產(chǎn)仔

的。實驗動物體重之間相差不得超過平均體重的20%。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中

至少適應(yīng)3d~5d時間。

實驗動物及實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。

97

6.3劑量水平

根據(jù)所選方法的要求，原則上應(yīng)設(shè)4~6個劑量組，每組動物一般為10只，雌雄各半。

各劑量組間距大小以兼顧產(chǎn)生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進行預(yù)

試。如果受試物毒性很低，也可采用一次限量法，即用10只動物（雌雄各半）口服

5000mg/kg

體重劑量，當未引起動物死亡，可考慮不再進行多個劑量的急性經(jīng)口毒性試驗。

6.4試驗步驟

6.4.1試驗前，實驗動物禁食過夜，不限制飲水。若采用代謝率高的其它動物，禁食時間

可

以適當縮短。

6.4.2正式試驗時，稱量動物體重，隨機分組，然后對各組動物用管飼法一次進行染毒，

若

估計受試物毒性很低，一次給予容量太大，也可在24h內(nèi)分2~3次染毒，但合并作為一

次劑

量計算。染毒后繼續(xù)禁食3h~4h。若采用分批多次染毒，根據(jù)染毒間隔長短，必要時可給

動

物一定量的食物和水。

6.4.3染毒后，對每只動物都應(yīng)有單獨全面的記錄，染毒第Id要定時觀察實驗動物的中

毒

表現(xiàn)和死亡情況，其后至少每天進行一次仔細的檢查。詳細記錄被毛和皮膚、眼睛和粘膜，

呼吸、循環(huán)、自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體活動和行為等改變。特別注意是否出現(xiàn)震顫、

抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷等癥狀。應(yīng)記錄毒作用體征出現(xiàn)和消失的時間和死亡時間。

6.4.4觀察期限一般不超過14d,但觀察時間并非一成不變，要視動物中毒反應(yīng)的嚴重程

度、

癥狀出現(xiàn)快慢和恢復(fù)期長短而定。若有死亡延遲跡象，可延長觀察時間。

觀察期內(nèi)存活動物每周稱重，觀察期結(jié)束存活動物應(yīng)稱重，處死后進行尸檢。

6.4.5對實驗動物進行大體解剖學(xué)檢查，并記錄全部大體病理改變。對死亡和存活24h和

24h以上動物并存在大體病理改變的器官應(yīng)進行病理組織學(xué)檢查。

6.4.6可采用多種方法測定LD50,建議采用霍恩氏法、上-下法、概率單位-對數(shù)圖解法和

寇氏法等。

6.5試驗結(jié)果評價

評價試驗結(jié)果時，應(yīng)將LD50與觀察到的毒性效應(yīng)和尸檢所見相結(jié)合考慮，LD50值是受

試物毒性分級和標簽標識以及判定受試物經(jīng)消化道攝入后引起動物死亡可能性大小的依據(jù)。

引用LD50值時一定要注明所用實驗動物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等。評價應(yīng)

包

括動物接觸受試物與動物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)

及其它毒性作用）的發(fā)生率和嚴重程度之間的關(guān)系。

毒性分級見表1。

7試驗報告

試驗報告應(yīng)包括如下內(nèi)容：

（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；

（2）實驗動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）；

（3）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；

（4）所用劑量和動物分組，每組所用動物性別、數(shù)量及體重范圍；

（5）染毒后動物中毒表現(xiàn)和死亡情況及出現(xiàn)時間，大體解剖及病理所見；

（6）計算LD50的方法；

（7）列表報告結(jié)果和計算的LD50及其95%可信區(qū)間（建議的表格形式見表2）；

（8）結(jié)論。

8試驗結(jié)果的解釋

通過急性經(jīng)口毒性試驗和LD50的測定可評價受試物的毒性。其結(jié)果外推到人類的有效

性很有限。

98

表1經(jīng)口毒性分級

LD50（mg/kg）毒性分級

W50高毒

>50-500中等毒

>500-5000低毒

>5000實際無毒

表2xxx對小鼠急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果

體重(x土SD)(g)動物性別劑量分組

(mg/kg)

動物數(shù)

(只)0天7天14天

死亡動物數(shù)

(只)

死亡率

(%)

LD50及95%可信區(qū)間：

雄性動物：

雌性動物：

99

三、急性經(jīng)皮毒性試驗

AcuteDermalToxicityTest

1范圍

本規(guī)范規(guī)定了動物急性皮膚毒性試驗的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料安全性毒理學(xué)檢測。

2規(guī)范性引用文件

OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.402,Feb.1987)

USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines(Series870.1200,Aug.1998)

3試驗?zāi)康?/p>

急性皮膚毒性試驗可確定受試物能否經(jīng)皮膚吸收和短期作用所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，可為化

妝品原料毒性分級和標簽標識以及確定亞慢性毒性試驗和其它毒理學(xué)試驗劑量提供依據(jù)。

4定義

4.1急性皮膚毒性(Acutedermaltoxicity)：經(jīng)皮一次涂敷受試物后，動物在短期內(nèi)出

現(xiàn)的

健康損害效應(yīng)。

4.2經(jīng)皮LD50(半數(shù)致死量，Mediumlethaldose)：經(jīng)皮一次涂敷受試物后，引起實驗

動物

總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計學(xué)劑量。以單位體重涂敷受試物的重量(mg/kg或g/kg)

來表

示。

5試驗的基本原則

受試物以不同劑量經(jīng)皮給予各組實驗動物，每組用一個劑量。染毒后觀察動物的毒性反

應(yīng)和死亡情況。試驗期間死亡的動物要進行尸檢，試驗結(jié)束時仍存活的動物要處死并進行尸

檢。若已知受試物具有腐蝕性或強刺激性可不進行急性經(jīng)皮毒性試驗。

6試驗方法

6.1受試物

液體受試物一般不需稀釋。若受試物為固體，應(yīng)研磨成細粉狀，并用適量水或無毒、無

刺激性、不影響受試物穿透皮膚、不與受試物反應(yīng)的介質(zhì)混勻，以保證受試物與皮膚有良好

的接觸。常用的介質(zhì)有橄欖油、羊毛脂、凡士林等。

6.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

可選用健康成年大鼠、家兔或豚鼠作為實驗動物，也可使用其它種屬動物進行試驗。使

用雌性動物應(yīng)是未孕和未曾產(chǎn)仔的。建議實驗動物體重范圍為：大鼠200g~300g；家兔

2kg?

3kg；豚鼠350g?450g。實驗動物皮膚應(yīng)健康無破損。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境

中至

少適應(yīng)3d?5d時間。

實驗動物及實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。

6.3劑量水平

根據(jù)所選用的方法要求，原則上應(yīng)設(shè)4~6個劑量組，每組動物一般為10只，雌雄各半。

各劑量組間距大小以兼顧產(chǎn)生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進行預(yù)

試。如果受試物毒性很低，可采用一次限量法，即用10只動物（雌雄各半）皮膚涂抹

2000mg/kg

100

體重劑量，當未引起動物死亡，可考慮不再進行多個劑量的急性經(jīng)皮毒性試驗。

6.4試驗步驟

6.4.1試驗開始前24h,剪去或剃除動物軀干背部擬染毒區(qū)域的被毛，去毛時應(yīng)非常小心,

不要損傷皮膚以免影響皮膚的通透性。涂皮面積約占動物體表面積的10%,應(yīng)根據(jù)動物體

重確定涂皮面積。體重為200g?300g的大鼠約為30cm2?40cm2,體重為2kg?3kg

的家兔

約為160cm2?210cm2,體重為350g?450g的豚鼠約為46cm2?54cm2。

6.4.2將受試物均勻涂敷于動物背部皮膚染毒區(qū)，然后用一層薄膠片覆蓋，無刺激膠布固

定，

防止動物舔食。若受試物毒性較高，可減少涂敷面積，但涂敷仍需盡可能薄而均勻。一般封

閉接觸24h。

6.4.3染毒結(jié)束后，應(yīng)使用水或其它適宜的溶液清除殘留受試物。

6.4.4觀察期限一般不超過14d,但要視動物中毒反應(yīng)的嚴重程度、癥狀出現(xiàn)快慢和恢復(fù)

期

長短而定。若有延遲死亡跡象，可考慮延長觀察時間。

6.4.5對每只動物都應(yīng)有單獨全面的記錄，染毒第Id要定時觀察實驗動物的中毒表現(xiàn)和

死

亡情況，其后至少每天進行一次仔細的檢查。包括被毛和皮膚、眼睛和粘膜以及呼吸、循環(huán)、

自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體運動和行為活動等的改變。特別注意觀察動物是否出現(xiàn)震顫、

抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡、和昏迷等癥狀。死亡時間的記錄應(yīng)盡可能準確。

觀察期內(nèi)存活動物每周稱重、觀察期結(jié)束存活動物應(yīng)稱重，處死后進行尸檢。

6.4.6對實驗動物進行大體解剖學(xué)檢查，并記錄全部大體病理改變。對死亡和存活24h和

24h以上動物并存在大體病理改變的器官應(yīng)進行病理組織學(xué)檢查。

6.4,7可采用多種方法測定LD50,建議采用霍恩氏法、上-下法、概率單位-對數(shù)圖解法和

寇氏法等。

6.5試驗結(jié)果評價

評價試驗結(jié)果時，應(yīng)將經(jīng)皮LD50與觀察到的毒性效應(yīng)和尸檢所見相結(jié)合考慮，LD50值

是受試物毒性分級和標簽標識以及判定受試物經(jīng)皮膚吸收后引起動物死亡可能性大小的依

據(jù)。引用LD50值時一定要注明所用實驗動物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等。評

價

應(yīng)包括動物接觸受試物與動物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死

效應(yīng)及其它毒性作用）的發(fā)生率和嚴重程度之間的關(guān)系。

毒性分級見表lo

表1皮膚毒性分級

LD50（mg/kg）毒性分級

<5劇毒

5-44高毒

44-350中等毒

350-2180低毒

>2180微毒

7試驗報告

試驗報告應(yīng)包括如下內(nèi)容：

（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；

（2）實驗動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）；

（3）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；

（4）所用劑量和動物分組，每組所用動物性別、數(shù)量及體重范圍；

（5）染毒后動物中毒表現(xiàn)和死亡情況及出現(xiàn)時間，大體解剖及病理所見；

（6）計算LD50的方法；

101

（7）列表報告結(jié)果和計算LD50及其95%可信區(qū)間（建議的表格形式見表2）；

（8）結(jié)論。

表2XXX對大鼠急性經(jīng)皮毒性試驗結(jié)果

體重（x士SD）（g）動物性別劑量分組

（mg/kg）

動物數(shù)

（只）0天7天14天

死亡動物數(shù)

（只）

死亡率

（%）

LD50及95%可信區(qū)間：

雄性動物：

雌性動物：

8試驗結(jié)果的解釋

急性經(jīng)皮毒性試驗研究和經(jīng)皮LD50的確定提供了受試物經(jīng)皮染毒的毒性。其結(jié)果外推

到人類的有效性很有限。急性經(jīng)皮毒性試驗的結(jié)果應(yīng)與經(jīng)其它途徑染毒的急性毒性試驗結(jié)果

相結(jié)合進行綜合評價。

102

四、皮膚刺激性/腐蝕性試驗

DermalIrritation/CorrosionTest

1范圍

本規(guī)范規(guī)定了動物皮膚刺激性或腐蝕性試驗的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學(xué)檢測。

2規(guī)范性引用文件

OECDGuidelinesforTestingofChemicals（No.404,April2002）

USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines（Series870.2500,Aug.1998）

3試驗?zāi)康?/p>

確定和評價化妝品原料及其產(chǎn)品對哺乳動物皮膚局部是否有刺激作用或腐蝕作用及其

程度。

4定義

4.1皮膚刺激性(Dermalirritation)：皮膚涂敷受試物后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。

4.2皮膚腐蝕性(Dermalcorrosion)：皮膚涂敷受試物后局部引起的不可逆性組織損傷。

5試驗的基本原則

將受試物一次(或多次)涂敷于受試動物的皮膚上，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，觀察動物皮

膚局部刺激作用的程度并進行評分。采用自身對照，以評價受試物對皮膚的刺激作用。急性

皮膚刺激性試驗觀察期限應(yīng)足以評價該作用的可逆性或不可逆性。

動物如果在試驗的任何階段出現(xiàn)嚴重抑郁、痛苦的表現(xiàn)，則應(yīng)該給予人道地處死。依據(jù)

試驗情況對受試物進行適當評價。

6試驗方法

6.1受試物

液體受試物一般不需稀釋，可直接使用原液。若受試物為固體，應(yīng)將其研磨成細粉狀，

并用水或其它無刺激性溶劑充分濕潤，以保證受試物與皮膚有良好的接觸。使用其它溶劑，

應(yīng)考慮到該溶劑對受試物皮膚刺激性的影響。需稀釋后使用的產(chǎn)品，先進行產(chǎn)品原型的皮膚

刺激性/腐蝕性試驗，如果試驗結(jié)果顯示中度以上刺激性，可按使用濃度為受試物再進行皮

膚刺激性/腐蝕性試驗。

受試物為強酸或強堿(pH值W2或211.5),可以不再進行皮膚刺激試驗。此外，若已

知受試物有很強的經(jīng)皮吸收毒性，經(jīng)皮LD50小于200mg/kg體重或在急性經(jīng)皮毒性試

驗中受

試物劑量為2000mg/kg體重仍未出現(xiàn)皮膚刺激性作用，也無需進行急性皮膚刺激性試驗。

6.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

多種哺乳動物均可被選為實驗動物，首選白色家兔。應(yīng)使用成年、健康、皮膚無損傷的

動物，雌性和雄性均可，但雌性動物應(yīng)是未孕和未曾產(chǎn)仔的。實驗動物至少要用4只，如

要

澄清某些可疑的反應(yīng)則需增加實驗動物數(shù)。實驗動物應(yīng)單籠飼養(yǎng)，試驗前動物要在實驗動物

房環(huán)境中至少適應(yīng)3d時間。

實驗動物及實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。

103

6.3急性皮膚刺激性試驗步驟

6.3.1試驗前約24h,將實驗動物背部脊柱兩側(cè)毛剪掉，不可損傷表皮，去毛范圍左、右

各

約3cmx3cm。

6.3.2取受試物約0.5mL(g)直接涂在皮膚上，然后用二層紗布(2.5cmX2.5cm)和

一層玻

璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側(cè)皮膚作為對照。采用封閉試

驗，敷用時間為4h。對化妝品產(chǎn)品而言，可根據(jù)人的實際使用和產(chǎn)品類型，延長或縮短敷

用時間。對用后沖洗的化妝品產(chǎn)品，僅采用2h敷用試驗。試驗結(jié)束后用溫水或無刺激性溶

劑清除殘留受試物。

如懷疑受試物可能引起嚴重刺激或腐蝕作用，可采取分段試驗，將三個涂布受試物的紗

布塊同時或先后敷貼在一只家兔背部脫毛區(qū)皮膚上,分別于涂敷后3min、60min和4h取

下

一塊紗布，皮膚涂敷部位在任一時間點出現(xiàn)腐蝕作用，即可停止試驗。

6.3.3于清除受試物后的1、24、48和72h觀察涂抹部位皮膚反應(yīng)，按表1進行皮膚

反應(yīng)評

分，以受試動物積分的平均值進行綜合評價，根據(jù)24、48和72h各觀察時點最高積分

均值，

按表2判定皮膚刺激強度。

6.3.4觀察時間的確定應(yīng)足以觀察到可逆或不可逆刺激作用的全過程，一般不超過14d。

6.4多次皮膚刺激性試驗步驟

6.4.1試驗前將實驗動物背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，去毛范圍各為3cmX3cm,涂抹面積

2.5cmX2.5cm。

6.4.2取受試物約0.5mL（g）涂抹在一側(cè)皮膚上，當受試物使用無刺激性溶劑配制時，

另

一側(cè)涂溶劑作為對照，每天涂抹1次，連續(xù)涂抹14do從第二天開始，每次涂抹前應(yīng)剪毛,

用水或無刺激性溶劑清除殘留受試物。一小時后觀察結(jié)果，按表1評分，對照區(qū)和試驗區(qū)

同

樣處理。

6.4.3結(jié)果評價：按下列公式計算每天每只動物平均積分，以表2判定皮膚刺激強度。

14受試動物數(shù)

紅斑和水腫積分

每天每只動物平均積分

￡

表1皮膚刺激反應(yīng)評分

皮膚反應(yīng)積分

紅斑和焦痂形成

無紅斑0

輕微紅斑（勉強可見）1

明顯紅斑2

中度~重度紅斑3

嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4

水腫形成

無水腫0

輕微水腫（勉強可見）1

輕度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）2

中度水腫（皮膚隆起約1mm）3

重度水腫（皮膚隆起超過1mm,范圍擴大）4

最高積分8

104

7試驗報告

試驗報告應(yīng)以表格形式總結(jié)，包括如下內(nèi)容：

（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量。必要時說明受試物的pH值；

（2）實驗動物的種屬、品系、性別、體重和來源（注明合格證號和動物級別）；

（3）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；

（4）每個動物在每一觀察時點的皮膚刺激反應(yīng)積分；

(5)具體描述除刺激性以外的其它毒性作用；

(6)結(jié)論。

8試驗結(jié)果的解釋

急性皮膚刺激試驗結(jié)果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數(shù)情況下對有

刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類敏感。若用其它品系動物進行試驗時也得到類似結(jié)果，則會增

加從動物外推到人的可靠性。試驗中使用封閉式接觸是一種超常的實驗室條件下的試驗，在

人類實際使用化妝品過程中很少存在這種接觸方式。

表2皮膚刺激強度分級

積分均值強度

0~<0.5無刺激性

0.5~<2.0輕刺激性

2.0~<6.0中刺激性

6.0~8.0強刺激性

表3XXX對家兔急性皮膚刺激性試驗結(jié)果

lh24h48h72h

樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照

動

物

編

號

性

別

體重

(kg)紅

斑

水

腫

總

分

紅

斑

水

腫

總

分

紅

斑

水

腫

總

分

紅

斑

水

腫

總

分

紅

斑

水

腫

總

分

紅

斑

水

腫

總

分

紅

斑

水

腫

總

分

紅

斑

水

腫

總

分

1

2

3

4

總積分均值

刺激強度分級

105

表4XXX對家兔多次皮膚刺激性試驗結(jié)果

刺激反應(yīng)積分

樣品對照

涂抹

天數(shù)

動物數(shù)（只）

紅斑水腫總分紅斑水腫總分

14

24

34

44

54

64

74

84

94

104

114

124

134

144

14天每只動物積分均值

每天每只動物積分均值

106

五、急性眼刺激性/腐蝕性試驗

AcuteEyeIrritation/CorrosionTest

1范圍

本規(guī)范規(guī)定了動物急性眼刺激性或腐蝕性試驗的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學(xué)檢測。

2規(guī)范性引用文件

OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No405,April2002)

USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines(Series870.2400,Aug.1998)

3試驗?zāi)康?/p>

確定和評價化妝品原料及其產(chǎn)品對哺乳動物的眼睛是否有刺激作用或腐蝕作用及其程

度。

4定義

4.1眼睛刺激性(Eyeirritation)：眼球表面接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性變化。

4.2眼睛腐蝕性(Eyecorrosion)：眼球表面接觸受試物后引起的不可逆性組織損傷。

5試驗的基本原則

受試物以一次劑量滴入每只實驗動物的一側(cè)眼睛結(jié)膜囊內(nèi)，以未作處理的另一側(cè)眼睛作

為自身對照。在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，觀察對動物眼睛的刺激和腐蝕作用程度并評分，以此評

價受試物對眼睛的刺激作用。觀察期限應(yīng)能足以評價刺激效應(yīng)的可逆性或不可逆性。

動物如果在試驗的任何階段出現(xiàn)嚴重抑郁、痛苦的表現(xiàn)，則應(yīng)該給予人道地處死，依據(jù)

試驗情況對受試物進行適當評價。動物如出現(xiàn)角膜穿孔、角膜潰瘍、角膜4分超過48h、

缺

乏光反射超過72h、結(jié)膜潰瘍、壞疽、腐爛等情況，通常為不可逆損傷的癥狀，也應(yīng)該給

予

人道地處死。

6試驗方法

6.1受試物

液體受試物一般不需稀釋，可直接使用原液，染毒量為0.1mL。若受試物為固體或顆粒

狀，應(yīng)將其研磨成細粉狀，染毒量應(yīng)為體積0.1mL或重量不大于100mg(染毒量應(yīng)進行

記

錄)。

受試物為強酸或強堿（pH值W2或）11.5）,或已證實對皮膚有腐蝕性或強刺激性時，

可以不再進行眼刺激性試驗。

氣溶膠產(chǎn)品需噴至容器中，收集其液體再使用。

6.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

首選健康成年白色家兔。至少使用3只家兔。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適

應(yīng)3d時間。在試驗開始前的24h內(nèi)要對試驗動物的兩只眼睛進行檢查（包括使用熒光素

鈉

檢查）。有眼睛刺激癥狀、角膜缺陷和結(jié)膜損傷的動物不能用于試驗。

實驗動物及實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。

107

6.3試驗步驟

6.3.1輕輕拉開家兔一側(cè)眼睛的下眼險，將受試物0.1mL（lOOmg）滴入（或涂入）結(jié)膜

囊

中，使上、下眼瞼被動閉合1s,以防止受試物丟失。另一側(cè)眼睛不處理作自身對照。滴入

受試物后24h內(nèi)不沖洗眼睛。若認為必要，在24h時可進行沖洗。

6.3.2若上述試驗結(jié)果顯示受試物有刺激性，需另選用3只家兔進行沖洗效果試驗，即給

家

兔眼滴入受試物后30s,用足量、流速較快但又不會引起動物眼損傷的水流沖洗至少30s。

6.3.3臨床檢查和評分：在滴入受試物后1、24、48、72h以及第4d和第7d對動物眼

睛進

行檢查。如果72h未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，即可終止試驗。如果發(fā)現(xiàn)累及角膜或有其它眼刺激作

用，

7d內(nèi)不恢復(fù)者，為確定該損害的可逆性或不可逆性需延長觀察時間，一般不超過21d,并

提

供第7d、14d、21d的觀察報告。除了對角膜、虹膜、結(jié)膜進行觀察外，其它損害效應(yīng)均

應(yīng)

當記錄并報告。在每次檢查中均應(yīng)按表1眼損害的評分標準記錄眼刺激反應(yīng)的積分。

可使用放大鏡、手持裂隙燈、生物顯微鏡或其它適用的儀器設(shè)備進行眼刺激反應(yīng)檢查。

在24h觀察和記錄結(jié)束之后，對所有動物的眼睛應(yīng)用熒光素鈉作進一步檢查。

6.3.4對用后沖洗的產(chǎn)品（如洗面奶、發(fā)用品、育發(fā)沖洗類等）只做30s沖洗試驗，即

滴入受試物后，眼閉合1s,至第30s時用足量、流速較快但又不會引起動物眼損傷的

水流沖洗30s,然后按6.3.3進行檢查和評分。

6.3.5對染發(fā)劑類產(chǎn)品，只做4s沖洗試驗，即滴入受試物后，眼閉合Is,至第4s時用

足量、流速較快但又不會引起動物眼損傷的水流沖洗30s,然后按6.3.3進行檢查和評分。

表1眼損害的評分標準

眼損害積分

角膜：混濁（以最致密部位為準）

無潰瘍形成或混濁0

散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見1

半透明區(qū)易分辨，虹膜模糊不清2

出現(xiàn)灰白色半透明區(qū)，虹膜細節(jié)不清，瞳孔大小勉強可見3

角膜混濁，虹膜無法辨認4

虹膜：正常0

皺褶明顯加深，充血、腫脹、角膜周圍有中度充血，瞳孔對

光仍有反應(yīng)

1

出血、肉眼可見破壞，對光無反應(yīng)（或出現(xiàn)其中之一反應(yīng)）2

結(jié)膜：充血（指瞼結(jié)膜、球結(jié)膜部位）

血管正常0

血管充血呈鮮紅色1

血管充血呈深紅色，血管不易分辨2

彌漫性充血呈紫紅色3

水腫

無0

輕微水腫（包括瞬膜）1

明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻2

水腫至眼瞼近半閉合3

水腫至眼瞼大半閉合4

108

7結(jié)果評價

化妝品原料——以給受試物后動物角膜、虹膜或結(jié)膜各自在24、48和72h觀察時點的

刺激反應(yīng)積分的均值和恢復(fù)時間評價，按表2眼刺激反應(yīng)分級判定受試物對眼的刺激強度。

表2眼刺激性反應(yīng)分級

2A級

（輕刺激性）

2/3動物的刺激反應(yīng)積分均值：角膜渾濁》1；虹膜21；結(jié)膜

充血》2；結(jié)膜水腫22和上述刺激反應(yīng)積分在W7天完全恢

復(fù)

可逆眼損傷

2B級

（刺激性）

2/3動物的刺激反應(yīng)積分均值：角膜渾濁21；虹膜21：結(jié)膜

充血》2；結(jié)膜水腫22和上述刺激反應(yīng)積分在＜21天完全恢

復(fù)

不可逆眼損傷

①任1只動物的角膜、虹膜和/或結(jié)膜刺激反應(yīng)積分在21天的

觀察期間沒有完全恢復(fù)；

②2/3動物的刺激反應(yīng)積分均值：角膜渾濁23和/或虹膜＞1.5

化妝品產(chǎn)品一一以給受試物后動物角膜、虹膜或結(jié)膜各自在24、48或72h觀察時點的

刺激反應(yīng)的最高積分和恢復(fù)時間評價，按表3眼刺激反應(yīng)分級判定受試物對眼的刺激強度。

表3眼刺激性反應(yīng)分級

微刺激性

動物的角膜、虹膜積分=0；結(jié)膜充血和/或結(jié)膜水腫積分W2,

且積分在＜7天內(nèi)降至0

輕刺激性動物的角膜、虹膜、結(jié)膜積分在W7天降至0

可逆眼損傷

刺激性動物的角膜、虹膜、結(jié)膜積分在8?21天內(nèi)降至0

不可逆

眼損傷

腐蝕性

①動物的角膜、虹膜和/或結(jié)膜積分在第21天時＞0；

②2/3動物的眼刺激反應(yīng)積分：角膜渾濁53和/或虹膜=2

注：當角膜、虹膜、結(jié)膜積分為0時，可判為無刺激性。

8試驗報告

試驗報告應(yīng)包括如下內(nèi)容：

（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量，必要時說明受試物的pH值；

（2）實驗動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）；

（3）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對?濕度、實驗動物房合格證號；

（4）列表顯示每只動物在每一觀察時點（如染毒1,24,48和72h）的刺激反應(yīng)（建

議的表格形式見表4）,將實驗條件不沖洗和30秒沖洗或4秒沖洗的結(jié)果分別列表；

（5）具體描述除眼部以外的其它作用；

（6）描述在各觀察時點積分時的檢查方法（如手持裂隙燈、用熒光素鈉）；

（7）結(jié)論。

9試驗結(jié)果的解釋

急性眼刺激性試驗結(jié)果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數(shù)情況下對有

刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類敏感。若用其它品系動物進行試驗時也得到類似結(jié)果，則會增

加從動物外推到人的可靠性。

109

表4XXX對家兔眼睛刺激性試驗結(jié)果

實驗條件：不沖洗

30（或4）秒沖洗

眼刺激性反應(yīng)積分

lh24h48h72h4d7d

動物編號

部位

樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照

1

結(jié)膜

虹膜

角膜

2

結(jié)膜

虹膜

角膜

3

結(jié)膜

虹膜

角膜

刺激反應(yīng)分級

110

六、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗

SkinSensitisationTest

1范圍

本規(guī)范規(guī)定了動物皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學(xué)檢測。

2規(guī)范性引用文件

OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No406,July1992)

USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines(Series870.2600,Aug.1998)

3試驗?zāi)康?/p>

確定重復(fù)接觸化妝品及其原料對哺乳動物是否可引起變態(tài)反應(yīng)及其程度。

4定義

4.1皮膚變態(tài)反應(yīng)(過敏性接觸性皮炎)(Skinsensitization,allergiccontact

dermatitis)

是皮膚對一種物質(zhì)產(chǎn)生的免疫源性皮膚反應(yīng)。在人類這種反應(yīng)可能以瘙癢、紅斑、丘疹、

水皰、融合水皰為特征。動物的反應(yīng)不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。

4.2誘導(dǎo)接觸(Inductionexposure)

指機體通過接觸受試物而誘導(dǎo)出過敏狀態(tài)的試驗性暴露。

4.3誘導(dǎo)階段(Inductionperiod)

指機體通過接觸受試物而誘導(dǎo)出過敏狀態(tài)所需的時間，一般至少一周。

4.4激發(fā)接觸(Challengeexposure)

機體接受誘導(dǎo)暴露后，再次接觸受試物的試驗性暴露，以確定皮膚是否會出現(xiàn)過敏反應(yīng)。

5試驗的基本原則

實驗動物通過多次皮膚涂抹(誘導(dǎo)接觸)或皮內(nèi)注射受試物10d~14d(誘導(dǎo)階段)后，

給予激發(fā)劑量的受試物，觀察實驗動物并與對照動物比較對激發(fā)接觸受試物的皮膚反應(yīng)強

度。

5.1實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

一般選用健康、成年雄性或雌性豚鼠，雌性動物應(yīng)選用未孕或未曾產(chǎn)仔的。

實驗動物及實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制，需注意補充

適量Vc。

5.2動物試驗前準備

試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應(yīng)3d~5d時間。將動物隨機分為受試物組和對

照組，按所選用的試驗方法，選擇適當部位給動物備皮(去毛)，避免損傷皮膚。試驗開始

和結(jié)束時應(yīng)記錄動物體重。

5.3無論在誘導(dǎo)階段或激發(fā)階段均應(yīng)對動物進行全面觀察包括全身反應(yīng)和局部反應(yīng)，并作

完整記錄。

5.4試驗方法可靠性的檢查

使用己知的能引起輕度/中度致敏的陽性物每隔半年檢查一次。局部封閉涂皮法至少有

30%動物出現(xiàn)皮膚過敏反應(yīng)：皮內(nèi)注射法至少有60%動物出現(xiàn)皮膚過敏反應(yīng)。陽性物一般

采

111

用2,4-二硝基氯代苯，肉桂醛，2-筑基苯并曝喋或?qū)Π被剿嵋阴ァ?/p>

6試驗方法

6.1局部封閉涂皮試驗(BuehlerTest,BT)

6.1.1動物數(shù)

試驗組至少20只，對照組至少10只。

6.1.2劑量水平

誘導(dǎo)接觸受試物濃度為能引起皮膚輕度刺激反應(yīng)的最高濃度，激發(fā)接觸受試物濃度為不

能引起皮膚刺激反應(yīng)的最高濃度。試驗濃度水平可以通過少量動物（2~3只）的預(yù)試驗獲

得。

水溶性受試物可用水或用無刺激性表面活性劑作為賦形劑，其它受試物可用80%乙醵

（誘導(dǎo)接觸）或丙酮（激發(fā)接觸）作賦形劑。

6.1.3試驗步驟

6.1.3.1試驗前約24h,將豚鼠背部左側(cè)去毛，去毛范圍為4cm2~6cm2。

6.1.3.2誘導(dǎo)接觸：將受試物約0.2mL（g）涂在實驗動物去毛區(qū)皮膚上，以二層紗布和

層玻璃紙覆蓋，再以無刺激膠布封閉固定6h。第7d和第14d以同樣方法重復(fù)一次。

6.1.3.3激發(fā)接觸：末次誘導(dǎo)后14d~28d,將約0.2mL的受試物涂于豚鼠背部右側(cè)2cm

X2cm

去毛區(qū)（接觸前24h脫毛），然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以無刺激膠布固定6h。

6.1.3.4激發(fā)接觸后24h和48h觀察皮膚反應(yīng)，按表1評分。

6.1.3.5試驗中需設(shè)陰性對照組，使用6.1.3.2和6.1.3.3的方法，在誘導(dǎo)接觸時僅涂以

溶劑

作為對照，在激發(fā)接觸時涂以受試物。對照組動物必須和受試物組動物為同一批。在實驗室

開展變態(tài)反應(yīng)試驗初期，或使用新的動物種屬或品系時，需同時設(shè)陽性對照組。

表1變態(tài)反應(yīng)試驗皮膚反應(yīng)評分

皮膚反應(yīng)積分

紅斑和焦痂形成

無紅斑0

輕微紅斑（勉強可見）1

明顯紅斑（散在或小塊紅斑）2

中度~重度紅斑3

嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4

水腫形成

無水腫0

輕微水腫（勉強可見）1

中度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）2

重度水腫（皮膚隆起約1mm或超過1mm）3

最高積分7

6.1.4結(jié)果評價

6.1.4.1當受試物組動物出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分22時，判為該動物出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)陽性，

按

表3判定受試物的致敏強度。

6.1.4.2如激發(fā)接觸所得結(jié)果仍不能確定，應(yīng)于第一次激發(fā)后一周，給予第二次激發(fā)，對

照

組作同步處理或按6.2的方法進行評價。

6.2豚鼠最大值試驗（GuineaPigMaximinatimTest,GPMT）

采用完全福氏佐劑（FreundCompleteAdjvant,FCA）皮內(nèi)注射方法檢測致敏的可能性。

112

6.2.1動物數(shù)

試驗組至少用10只，對照組至少5只。如果試驗結(jié)果難以確定受試物的致敏性，應(yīng)增加

動物數(shù)，試驗組20只，對照組10只。

6.2.2劑量水平

誘導(dǎo)接觸受試物濃度為能引起皮膚輕度刺激反應(yīng)的最高濃度，激發(fā)接觸受試物濃度為不

能引起皮膚刺激反應(yīng)的最高濃度。試驗濃度水平可以通過少量動物（2~3只）的預(yù)試驗獲

得。

6.2.3試驗步驟

6.2.3.1誘導(dǎo)接觸（第0d）

受試物組：將頸背部去毛區(qū)（2cmx4cm）中線兩側(cè)劃定三個對稱點，每點皮內(nèi)注射0.1mL

下述溶液。

第1點1：1（v/v）FCA/水或生理鹽水的混合物。

第2點耐受濃度的受試物。

第3點用1：1（v/v）FCA/水或生理鹽水配制的受試物，濃度與第2點相同。

對照組：注射部位同受試物組。

第1點1：1（v/v）FCA/水或生理鹽水的混合物。

第2點未稀釋的溶劑。

第3點用1：1（v/v）FCA/水或生理鹽水配制的濃度為50%（w/v）的溶劑。

6.2.3.2誘導(dǎo)接觸（第7d）：

將涂有0.5g（mL）受試物的2cmX4cm濾紙敷貼在上述再次去毛的注射部位，然后用兩

層紗布，一層玻璃紙覆蓋，無刺激膠布封閉固定48h。對無皮膚刺激作用的受試物，可加

強

致敏，于第二次誘導(dǎo)接觸前24h在注射部位涂抹10%十二烷基硫酸鈉（SLS）0.5mL。

對照組

僅用溶劑作誘導(dǎo)處理。

6.2.3.3激發(fā)接觸（第21d）

將豚鼠軀干部去毛，用涂有0.5g（mL）受試物的2cmx2cm濾紙片敷貼在去毛區(qū)，然后

再用兩層紗布，一層玻璃紙覆蓋，無刺激膠布封閉固定24h。對照組動物作同樣處理。如

激

發(fā)接觸所得結(jié)果不能確定，可在第一次激發(fā)接觸一周后進行第二次激發(fā)接觸。對照組作同步

處理。

6.2.4觀察及結(jié)果評價

激發(fā)接觸結(jié)束，除去涂有受試物的濾紙后24、48和72h,觀察皮膚反應(yīng)（如需要清除受

試殘留物可用水或選用不改變皮膚已有反應(yīng)和不損傷皮膚的溶劑），按表2評分。當受試物

組動物皮膚反應(yīng)積分時，應(yīng)判為變態(tài)反應(yīng)陽性，按表3對受試物進行致敏強度分級。

表2變態(tài)反應(yīng)試驗皮膚反應(yīng)評分

評分皮膚反應(yīng)

0未見皮膚反應(yīng)

1散在或小塊紅斑

2中度紅斑和融合紅斑

3重度紅斑和水腫

7試驗報告

報告應(yīng)包括如下內(nèi)容：

（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；

（2）實驗動物的種屬、品系、來源（注明合格證號和動物級別）、性別、數(shù)量；

（3）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；

113

（4）試驗方法；

（5）試驗開始和結(jié)束時動物體重；

（6）結(jié)果：以表格形式報告各組動物皮膚反應(yīng)情況和致敏率等（建議的表格形式見表4

和表5）；

（7）結(jié)論。

表3致敏強度

致敏率（％）致敏強度

0~8弱

9~28輕

29~64中

65~80強

81~100極強

注：當致敏率為0時，可判為未見皮膚變態(tài)反應(yīng)。

表4XXX對豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果（BT法）

皮膚反應(yīng)強度

紅斑水腫組別動物數(shù)

誘導(dǎo)

劑量

激發(fā)

劑量

觀察時間

（h）

012340123

22的動

物數(shù)（％）

陰性24

對照48

受試24

物組48

陽性24

對照48

陽性對照試驗日期：

注：在皮膚反應(yīng)強度欄中應(yīng)填寫當皮膚反應(yīng)積分為0、1、2、3…時，發(fā)生反應(yīng)的動物數(shù)占

受試動物數(shù)的比

例

表5XXX對豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果（GPMT法）

皮膚反應(yīng)強度

組別動物數(shù)

誘導(dǎo)

劑量

激發(fā)

劑量

觀察時間

(h)0123

的動物數(shù)

(%)

24

48

陰性

對照

72

24

48

受試

物組

72

24

48

陽性

對照

72

陽性對照試驗日期：

注：在皮膚反應(yīng)強度欄中應(yīng)填寫當皮膚反應(yīng)積分為0、1、2、3時，發(fā)生反應(yīng)的動物數(shù)占

受試動物數(shù)的比例

114

8試驗結(jié)果的解釋

試驗結(jié)果應(yīng)能得出受試物的致敏能力和強度。這些結(jié)果只能在很有限的范圍內(nèi)外推到人

類。引起豚鼠強烈反應(yīng)的物質(zhì)在人群中也可能引起一定程度的變態(tài)反應(yīng)，而引起豚鼠較弱反

應(yīng)的物質(zhì)在人群中也許不能引起變態(tài)反應(yīng)。

115

七、皮膚光毒性試驗

SkinPhototoxicityTest

1范圍

本規(guī)范規(guī)定了皮膚光毒性試驗的基本原則，要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學(xué)檢測。

2試驗?zāi)康?/p>

評價化妝品原料及其產(chǎn)品引起皮膚光毒性的可能性。

3定義

光毒性(Phototoxicity)：皮膚一次接觸化學(xué)物質(zhì)后，繼而暴露于紫外線照射下所引發(fā)的

一種皮膚毒性反應(yīng)，或者全身應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)后，暴露于紫外線照射下發(fā)生的類似反應(yīng)。

4試驗的基本原則

將一定量受試物涂抹在動物背部去毛的皮膚上，經(jīng)一定時間間隔后暴露于UVA光線下，

觀察受試動物皮膚反應(yīng)并確定該受試物有否光毒性。

5試驗方法

5.1受試物

液體受試物一般不用稀釋，可直接使用原液。若受試物為固體，應(yīng)將其研磨成細粉狀并

用水或其它溶劑充分濕潤，在使用溶劑時，應(yīng)考慮到溶劑對受試動物皮膚刺激性的影響。對

于化妝品產(chǎn)品而言，一般使用原霜或原液。陽性對照物選用8-甲氧基補骨脂

(8-methoxypsoralen,8-Mop)。

5.2實驗動物和飼養(yǎng)條件

使用成年白色家兔或白化豚鼠，盡可能雌雄各半。選用6只動物進行正式試驗。試驗前

動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應(yīng)3d~5d時間。

實驗動物及實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制，需注意補充

適量Vc。

5.3UV光源

5.3.1UV光源：波長為320nm~400nm的UVA,如含有UVB,其劑量不得超過

0.1J/cm2。

5.3.2強度的測定：用前需用輻射計量儀在實驗動物背部照射區(qū)設(shè)6個點測定光強度

(mW/cm2),以平均值計。

5.3.3照射時間的計算：照射劑量為10J/cm2,按下式計算照射時間。

sec)/cm/mJ(

)cm/mJ10000()sec(2

2

光強度

照射劑量

照射時間=

注：lmW/cm2=lmJ/cm2/sec

5.4試驗步驟

5.4.1進行正式光毒試驗前18h~24h,將動物脊柱兩側(cè)皮膚去毛，試驗部位皮膚需完好,

無

損傷及異常。備4塊去毛區(qū)(見圖1),每塊去毛面積約為2cmX2cm。

5.4.2將動物固定，按表1所示，在動物去毛區(qū)1和2涂敷0.2mL(g)受試物。所用

受試

116

物濃度不能引起皮膚刺激反應(yīng)(可通過預(yù)試驗確定)，30min后，左側(cè)(去毛區(qū)1和3)

用鋁

箔復(fù)蓋，膠帶固定，右側(cè)用UVA進行照射。

5.4.3結(jié)束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng)，根據(jù)表2判定每只動物皮膚反

應(yīng)評分。

5.4.4為保證試驗方法的可靠性，至少每半年用陽性對照物檢查一次。即在去毛區(qū)1和2

涂陽性對照物，方法同5.4.2。

圖1動物皮膚去毛區(qū)位置示意圖

表1動物去毛區(qū)的試驗安排

去毛區(qū)編號試驗處理

1涂受試物，不照射

2涂受試物，照射

3不涂受試物，不照射

4不涂受試物，照射

表2皮膚刺激反應(yīng)評分

皮膚反應(yīng)積分

紅斑和焦痂形成

無紅斑0

輕微紅斑（勉強可見）1

明顯紅斑2

中度~重度紅斑3

嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4

水腫形成

無水腫0

輕微水腫（勉強可見）1

輕度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）2

中度水腫（皮膚隆起約1mm）3

重度水腫（皮膚隆起超過1mm,范圍擴大）4

最高積分8

117

6結(jié)果評價

單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反

應(yīng)分值之和為2或2以上的動物數(shù)為1只或1只以上時，判為受試物具有光毒性。

7試驗報告

報告應(yīng)包括下列內(nèi)容：

（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度：

（2）動物種屬、品系、性別、體重、來源（注明合格證號和動物級別）；

（3）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；

（4）光源的生產(chǎn)廠、規(guī)格；

（5）光強度和照射時間以及試驗方法；

（6）結(jié)果：以列表方式報告動物出現(xiàn)皮膚反應(yīng)的積分（見表3和表4）；

（7）結(jié)論。

表3XXX對豚鼠皮膚光毒性試驗結(jié)果

皮膚反應(yīng)積分

lh24h48h72h動物編號性別體重（g）

1234123412341234

2

3

4

5

6

注：1,2,3,4為表1所示試驗區(qū)。

表4陽性對照物對豚鼠皮膚光毒性試驗結(jié)果

皮膚反應(yīng)積分

lh24h48h72h動物編號性別體重（g）

1234123412341234

1

2

3

4

5

6

注：1,2,3,4為表1所示試驗區(qū)。實驗日期：

118

八、鼠傷寒沙門氏菌/回復(fù)突變試驗

SalmonellaTyphimurium/ReverseMutationAssay

1范圍

本規(guī)范確定了鼠傷寒沙門氏菌/回復(fù)突變試驗的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。

2規(guī)范性引用文件

OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.471,Adopted：21,July1997)

3定義

3.1回復(fù)突變(Reversemutation)

細菌在化學(xué)致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。

3.2基因突變(Genemutation)

在化學(xué)致突變物作用下細胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。

3.3堿基置換突變(Basesubstitutionmutation)

引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。

堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。

轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個喀喔被另一口密咤所替代，或一個喋吟被另一嗯吟所代替。

顛換是DNA鏈上的一個喀咤被另一喋吟所替代，或一個喋吟被另一嗓咤所代替。

3.4移碼突變(Frameshiftmutation)

引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。

3.5鼠傷寒沙門氏菌/回復(fù)突變試驗(Salmonellatyphimurium/reversemutation

assay)

利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗菌株測定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變

的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)-原養(yǎng)型(his+)回復(fù)突變的試驗方法。

3.6S9

經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和秦黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在

9000g下離心lOmin后的肝勻漿上清液。

4原理

鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅

少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細菌回復(fù)突變成原養(yǎng)

型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。

某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備

的S9混合液。

5儀器和設(shè)備

培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃)或液

氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計

數(shù)器、

低溫高速離心機，玻璃器皿等。

119

6培養(yǎng)基和試劑

6.10.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液

成分：L-組氨酸(MW155)78mg

D-生物素(MW244)122mg

加蒸儲水至1000mL

配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min,儲于4c

冰箱。

6.2頂層瓊脂培養(yǎng)基

成分：瓊脂粉1.2g

氯化鈉1.0g

加蒸儲水至200mL

配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實驗時，加入0.5mmol/L組

氨酸-0.5mmol/L生物素溶液20mL。

6.3Vogel-Bonner(V-B)培養(yǎng)基E

成分：枸椽酸(C6H8O7?H2O)100g

磷酸氫二鉀(K2HPO4)500g

磷酸氫錢鈉(NaNH4HPO4?4H2O)175g

硫酸鎂(MgSO4?7H2O)10g

加蒸儲水至1000mL

配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸儲水至

lOOOmU于0.103MPa下高壓滅菌30min,儲于4℃冰箱。

6.420%葡萄糖溶液

成分：葡萄糖200g

加蒸儲水至1000mL

配制：加少量蒸儲水加溫溶解葡萄糖，再加蒸儲水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌

20min,

儲于4℃冰箱。

6.5底層瓊脂培養(yǎng)基

成分：瓊脂粉7.5g

蒸儲水480mL

V-B培養(yǎng)基E10mL

20%葡萄糖溶液10mL

配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分

混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h,備用。

6.6營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

成分：牛肉膏2.5g

胰陳5.0g

磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.0g

加蒸儲水至500mL

配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min,儲于4c冰箱。

6.7鹽溶液(1.65mol/LKCI+0.4mol/LMgCI2)

成分：氯化鉀(KCI)61.5g

氯化鎂(MgCI2?6H2O)40.7g

加蒸儲水至500mL

配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min,儲于4℃冰箱。

120

6.80.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）

成分：磷酸二氫鈉（NaH2Po4?2H2。）2.965g

磷酸氫二鈉（Na2Hp04-12H2O）29.015g

加蒸儲水至500mL

配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min,儲于4℃冰箱。

6.9S9混合液

成分：每毫升S9混合液

肝S9100ML

鹽溶液20uL

滅菌蒸儲水380uL

0.2mol/L磷酸鹽緩沖液500|JL

輔酶II（NADP）4nmol

6-磷酸葡萄糖（G-6-P）511moi

配制：將輔酶n和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入

各種成分，使肝S9加到己有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴

中。

實驗結(jié)束，剩余S9混合液應(yīng)該丟棄。

6.10菌株鑒定用和特殊用途試劑

6.10.1組氨酸一生物素平板

成分：瓊脂粉15g

蒸儲水944mL

V-B培養(yǎng)基E20mL

20%葡萄糖20mL

滅菌鹽酸組氨酸水溶液（0.5g/100mL）10mL

滅菌0.5mmol/L生物素溶液6mL

配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基和組氨酸溶液加進熱的瓊

脂溶液中。待溶液稍為冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。

6.10.2氨茉青霉素平板和氨葦青霉素/四環(huán)素平板

成分：瓊脂粉15g

蒸餡水940mL

V-B鹽溶液20mL

20%葡萄