細菌的耐藥性抗菌藥物種類及作用機制抗菌藥物敏感實驗細菌耐藥機制及耐藥性檢測從哪里來？到哪里去？√1細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024

抗菌藥物敏感性試驗（AntimicrobialSusceptibilityTest）：

測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法，簡稱藥敏試驗（AntimicrobialSusceptibilityTest,AST）1.抗菌藥物敏感性試驗的意義2.藥物敏感性試驗常規(guī)抗菌藥物選擇3.抗菌藥物敏感性試驗的方法肉湯稀釋法瓊脂稀釋法紙片瓊脂擴散法

E試驗

4.聯(lián)合藥物敏感試驗

2細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20241.抗菌藥物敏感性試驗的意義1、指導抗菌藥物臨床應用2、預測抗菌治療效果3、提示細菌耐藥機制存在4、監(jiān)測細菌耐藥性5、根據(jù)一些細菌對某類藥物表現(xiàn)出固有耐藥性（或敏感性）進行細菌鑒定。

標本：胸水診斷：肺炎檢驗：肺炎克雷伯菌MIC阿米卡星>32R頭孢匹肟=<0.25S頭孢曲松0.5S環(huán)丙沙星>4R慶大霉素>16R亞胺培南1S哌拉西林/他唑巴坦=<1S妥布霉素8I復方黃胺>4/76R診斷治療3細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20242.藥物敏感性試驗常規(guī)抗菌藥物選擇CLSI－臨床微生物檢驗的“圣經(jīng)”CLSI美國【臨床實驗室標準化協(xié)會】ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute前身NCCLSNationalcommitteeforclinicallaboratory美國CLSI的抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標準，是國內臨床細菌檢驗遵循的主要標準。由于制訂該項標準需要投入大量的人力、財力和物力，所以大多數(shù)國家包括中國都還沒有能力建立自己的標準而依賴CLSI的方法和標準。CLSI標準每年更新?。。?細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20242.藥物敏感性試驗常規(guī)抗菌藥物選擇A組：常規(guī)報告組，常規(guī)試驗并常規(guī)報告的藥物；B組：選擇性報告組，臨床上重要，針對院內感染控制，可用于常規(guī)試驗，選擇性報告藥物；C組：補充報告組，替代性的補充性的藥物，在A/B組過敏或耐藥時選用；U組：僅用于治療泌尿道感染的藥物5細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024S：敏感，SusceptibleI：中介，Intermediate

對SIR的內涵與外延藥物名稱MIC（ug/ml）解釋阿米卡星>32R頭孢匹肟=<0.25S頭孢曲松0.5S環(huán)丙沙星>4R慶大霉素>16R亞胺培南1S哌拉西林/他唑巴坦=<1S妥布霉素8I復方黃胺>4/76RR：耐藥，Resistant體外藥敏試驗只能預測體內治療效果，一般規(guī)律，耐藥=治療無效；敏感≠治療有效。6細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024抗菌藥物的臨床實踐劑量方案血藥濃度/時間其他組織或體液藥物濃度/時間感染部位藥物濃度/時間藥理學或毒副作用抗菌作用/時間藥代動力學PK藥效動力學PDPK：反應體內藥物濃度變化與時間關系PD：反應抗菌藥物在體外抗菌活性變化過程＋MICMBCPAEMPC7細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024T>MIC：時間依賴性Cmax/MICAUC/MIC：濃度依賴性T>MIC：β-內酰胺類抗菌藥物紅霉素克林霉素四環(huán)素萬古霉素；Cmax/MICAUC/MIC：氨基糖苷類喹諾酮類T>MIC即兩次給藥時間間隔中血清抗菌藥物濃度大于病原菌對該藥物MIC值的時間。AUC/MIC指抗菌藥物血清濃度曲線下面積與病原菌對該藥物MIC值之比值。8細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20243.抗菌藥物敏感性試驗的方法

紙片擴散法藥敏試驗（K-B法，Kirby-Bauer法）稀釋法藥敏試驗（MIC法）

濃度梯度法（E-Test）藥敏試驗肉湯稀釋法瓊脂稀釋法9細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，在紙片的周圍形成透明的抑菌圈。抑菌圈直徑大小受藥物在瓊脂中擴散速度和測試菌本身的耐藥性影響，反映了測試菌對藥物的敏感程度。微生物人員測量每種藥物的抑菌圈直徑，再根據(jù)CLSI最新抑菌圈直徑解釋標準折點，判定為S、I、R。3.抗菌藥物敏感性試驗的方法

紙片擴散法藥敏試驗（K-B法，Kirby-Bauer法）報告模式“藥物名稱＋藥敏方法＋抑菌圈直徑＋藥敏解釋”金黃色葡萄球菌“利奈唑胺30ugKB28S”。10細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024操作方法：1.將56℃左右恒溫的無菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm

的平板，其厚度4mm。11細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20242.無菌挑取孵育16-24h的血平板上4-5個菌落。3.置于無菌生理鹽水中，校正其濁度于McFarland0.5管。12細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20244.用無菌棉簽浸入細菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個方向均勻涂抹瓊脂表面（每次轉60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內緣涂抹一周。13細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20245.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內孵育，放置3-10分鐘后貼上標準抗生素紙片。6.根據(jù)選擇的菌株挑選相應的抗菌紙片14細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20247.用無菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動；各抗菌紙片中心距離應大于24mm，紙片距平板內緣應大于15mm。8.經(jīng)過35℃16-24h孵育。15細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20249.量取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標準，報告細菌對該抗生素敏感(S)、耐藥(R)、中介(I)。16細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024KB法影響因素

1.抗菌藥物紙片：紙片含藥量是影響抑菌圈大小的重要因素2.培養(yǎng)基：M-H培養(yǎng)基的質量對結果的準確性有直接影響，如培養(yǎng)基pH改變、瓊脂的厚度和硬度也可影響抑菌圈的大小。3.接種菌量：加大菌量可使抑菌圈減小，相反可使抑菌圈擴大。4.試驗操作質量

(1)試驗過程菌液層涂布應厚薄均勻；接種細菌后，平板應在室溫放置3-5min，待菌液被培養(yǎng)基吸收后，再貼紙片；孵育溫度、孵育時間應嚴格按照要求；堆放試驗平板不超過兩塊，以使其受熱均勻。

(2)結果觀察測量抑菌圈應仔細、精確。5.質控菌株本身的藥敏特性是否合格，有無變異。17細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024質量控制

采用參考菌株與待測菌株同批測試是藥敏試驗質控的主要措施。常用的質控菌株是：金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞桿菌ATCC27853等。每次實驗時應根據(jù)待測菌的不同而分別選用。當更換藥物和培養(yǎng)基時，也應用參考菌株進行檢測。18細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20243.抗菌藥物敏感性試驗的方法

稀釋法藥敏試驗（MIC法）

肉湯稀釋法瓊脂稀釋法稀釋法是將抗菌藥物作不同濃度的稀釋（通常為對倍稀釋），接種一定濃度的待測菌，35℃孵育18-24小時后，定量測定抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。肉湯稀釋法使用的稀釋物質為溶劑，使用待檢菌懸液檢測藥物MIC，而瓊脂稀釋法使用的稀釋物為瓊脂，待測菌株點種在瓊脂表面進行檢測。無論是哪種稀釋法均通過測量某菌種大量菌株的MICs來評價該菌是敏感還是耐藥，然后根據(jù)藥物的臨界濃度和其他相關因素來制定MIC界值。當待測菌對同種藥物檢測出MIC值時，就可以用檢測值與界值比較，小于界值為S，高于界值為I或R。報告模式藥物名稱＋藥敏方法＋MIC值＋藥敏解釋金黃色葡萄球菌“利奈唑胺MIC0.5S19細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024肉湯稀釋法4 8 16 3264128256ug/ml混

混清抗生素倍比稀釋，種菌105CFU/ml，孵育35℃，16～20h，判讀。體外藥敏試驗中使用的最低抑菌濃度(MIC)是指用稀釋法所測得的某抗菌藥物抑制檢測菌生長的最低濃度，用μg/ml表示。20細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20243.抗菌藥物敏感性試驗的方法

在微量聚乙烯微板孔中加入各種不同濃度的抗生素100μl，從低濃度往高濃度加樣，不需要更換吸管。挑選18~24小時的菌落置M-H肉湯增菌4~6小時。制備0.5麥氏比濁管，然后1:200稀釋，使之最終濃度105CFU/ml。用微量加樣器接種100μl菌液到96孔中，蓋上蓋板。同時作陽性、陰性對照。手工看濁度或儀器自動判讀。按照CLSI標準報告細菌對某抗菌藥物為敏感、耐藥和中介。21細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024瓊脂稀釋法

濃度16 32 64128256ug/ml制備含對倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點種菌，104/每個點，孵育，判讀結果優(yōu)點：金標準，精確可靠，多用于研究。稀釋法藥敏試驗（MIC法）

肉湯稀釋法瓊脂稀釋法缺點：勞動強度大22細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024

濃度0.5 124ug/ml大腸埃希菌頭孢噻肟23細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20243.抗菌藥物敏感性試驗的方法

濃度梯度法（E-Test）藥敏試驗E-Test即濃度梯度（多點藥物濃度法）瓊脂擴散試驗。E試紙條背面含有干化、濃度由高至低連續(xù)梯度分布的抗菌藥，藥物濃度按log2梯度遞減?？咕幬飶木哂袧舛瓤潭鹊乃芰显嚰垪l中向瓊脂中擴散，在試紙條周圍抑菌濃度范圍內受試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈，抑菌圈與試紙條的橫向相交處的讀數(shù)刻度為MIC值。該方法結合了稀釋法和擴散法的原理和特點，操作簡便，可得到微生物對抗菌藥物敏感度的定量結果，但價格較高。24細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20241.挑取16～20h的菌落2.用無菌生理鹽水制備成0.5麥氏比濁管濁度的菌液。操作方法：3.用無菌棉簽浸入細菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個方向平均涂抹瓊脂表面（每次轉60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內緣涂抹一周。25細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/20244.用鑷子將E-TEST試條的抗菌藥物的一面貼向瓊脂表面，有刻度的一面向外，直徑140mm的平板可放置

6條，90mm平板只能放置1～2試條。5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。6.孵育后形成一橢圓形抑菌圈，抑菌圈和試條的相交處的刻度即為抗菌藥物對該菌的最低抑菌濃度(MIC)。26細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024聯(lián)合藥物敏感試驗

臨床上常因下列情況需聯(lián)合使用兩種以上的抗菌藥物：①用于病原菌尚不確定的急、重癥感染的經(jīng)驗治療，如急性心內膜炎、敗血癥等；②治療多種細菌所引起的混合感染；③對于某些多耐藥菌株感染，可取得協(xié)同抗菌作用；④減少或推遲治療過程中細菌耐藥性的產(chǎn)生；⑤減少某些抗菌藥物的用量從而減輕其毒副作用。27細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024聯(lián)合藥敏試驗的結果判斷

聯(lián)合藥敏試驗可以出現(xiàn)四種結果：①協(xié)同作用：兩種抗菌藥物聯(lián)合作用時，藥效顯著大于其單藥抗菌活性的總和；②相加作用：兩種抗菌藥物聯(lián)合作用時，藥效等于兩藥單獨抗菌活性的總和；③無關作用：兩種抗菌藥物聯(lián)合作用時，藥效等于活性最大的抗菌藥物的藥效；④拮抗作用：兩種抗菌藥物聯(lián)合作用時，藥效顯著低于其單獨抗菌活性，即一種抗菌藥物的活性被另一種抗菌藥物所削弱。28細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024

聯(lián)合藥敏試驗的方法

棋盤稀釋法原理先測定兩藥單藥時各自的MIC值，再將各種稀釋度的兩藥混合，測定兩藥聯(lián)合時各藥的MIC值，比較兩藥聯(lián)合時MIC值與其單獨MIC值，計算部分抑菌濃度指數(shù)(fractionalinhibitoryconcectration，F(xiàn)IC)，作為協(xié)同、相加、無關和拮抗的判斷。結果判讀計算部分抑菌濃度指數(shù)（FIC）：判斷標準：FIC指數(shù)＜0.5協(xié)同作用

0.5～1相加作用

1～2無關作用＞2拮抗作用29細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024向臨床醫(yī)師報告的藥敏結果1.檢測報告必須包括抗菌藥：不要用商品名；結果：要解釋成S、I、R2.可選擇的，但有用的內容如果分離菌株屬于某一重要的耐藥表型，寫上其治療意義；抗菌藥物的費用；標準劑量最后，一般只給出一線用藥的結果，其他結果保存在微生物室，需要時提供。30細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024病原菌的藥敏試驗結果也許是臨床醫(yī)生最關心的問題，因為藥敏結果直接影響到臨床醫(yī)生對藥物的選擇。病原菌對某種藥物無論敏感（S）、中介（I），還是耐藥（R）（有些抗菌藥物無I這個類別），都是通過微生物實驗室使用特定的方法檢測出的結果。這些方法包括：紙片擴散法（K-B法）、E-Test法、瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。一般來說，稀釋法能夠測定幾乎所有藥物的MIC，且最為準確，是藥物敏感實驗中的“金標準”方法；K-B法能夠測定的藥物有限，且有與稀釋法不符合的現(xiàn)象，一些新藥是否能使用K-B法還存在爭議；E-Test法的準確性介于稀釋法和K-B法之間，臨床常規(guī)檢測較少使用此法。在稀釋法中，手工的肉湯稀釋法是最經(jīng)典的藥敏方法，但無論哪種稀釋法，其操作都非常復雜，微生物實驗室難以常規(guī)使用。目前，自動化微生物鑒定藥敏儀可以同時對待測微生物進行鑒定和藥敏檢測，藥敏所使用方法即是根據(jù)肉湯稀釋法改良的方法。由于自動化鑒定藥敏儀使用的是金標準的藥敏方法，因此在對自動化儀器結果有懷疑時，微生物專家只能依靠其他藥敏方法進行驗證，如K-B法或E-Test法。臨床醫(yī)生獲得的報告中不同藥物可能會出現(xiàn)兩種或多種方法的結果，因此臨床醫(yī)生需要仔細閱讀報告，以明確藥敏結果使用的方法。小結31細菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗kej5/9/2024體外藥敏試驗的局限性（1）CLSI制定藥敏界值時固有的局限性，如所有藥物都是按血藥濃度為基礎制定標準，然而局部感染中相應部位的藥物濃度高低無法考量，其他體液或組織藥物濃度可能高于或低于血藥濃度，因此造成臨床療效和藥敏檢測結果不符的現(xiàn)象；（2）體外藥敏試驗不能反映病原菌和藥物在體內復雜環(huán)境下的動態(tài)變化。不同的患者感染的病原菌種類和數(shù)量不同、藥物與個體血漿蛋白結合率不同、藥物代謝產(chǎn)物的抗菌活性與原藥可能不同等，這些因素都會改變藥物的臨床療效。（3）體外藥敏判斷標準無法覆蓋到藥代學因素，目前制定的折點和劑量的關系中某些藥物并不能達到折點、劑量和療效的統(tǒng)一。我國使用的判斷標準是依據(jù)CLSI（美國）制定的標準，因此近年來很多微生物專家呼吁建立自己國家的標準，目的就是達到折點、劑量和療效的統(tǒng)一。（4）未找到真正的感染原因。有菌