第二章發(fā)酵工業(yè)菌種本章內(nèi)容

2.1

發(fā)酵工業(yè)菌種2.2發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的原則與基本技術(shù)2.3發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定2.4發(fā)酵工業(yè)菌種改良2.5菌種保藏、復(fù)壯與擴(kuò)培本章重點：菌種來源，篩選原則與方法，菌種衰退，分離純化難

點：菌種保藏、復(fù)壯及擴(kuò)大培養(yǎng)

微生物在自然界中分布極為廣泛，不斷開發(fā)和利用微生物資源是人類社會實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的必由之路，也是解決現(xiàn)代社會經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展所帶來的人口、資源、能源、環(huán)境、健康等問題的重要途徑。到目前為止，人類所知道的微生物種類不到總數(shù)的10%，而真正被利用的還不到1%，進(jìn)一步開發(fā)利用微生物資源的潛力很大。發(fā)酵工業(yè)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化工、食品輕工、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等諸多領(lǐng)域。發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用的微生物種類：可培養(yǎng)微生物+未培養(yǎng)微生物可培養(yǎng)微生物可分為四大類：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌，其中酵母菌和絲狀真菌為真核生物。2.1發(fā)酵工業(yè)菌種概述：特點：單細(xì)胞原核微生物，自然界分布最廣，數(shù)量最多，與人類生產(chǎn)和生活關(guān)系十分密切。應(yīng)用：醋酸桿菌（——醋）乳酸桿菌（雙歧桿菌、瑞士乳桿菌——酸奶）芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌——豆豉；納豆芽孢桿菌——納豆）丙酮丁醇梭菌（——有機(jī)酸）大腸桿菌（構(gòu)建工程菌——核酸與蛋白質(zhì)疫苗）谷氨酸棒狀桿菌（——味精）2.1發(fā)酵工業(yè)菌種2.1.1細(xì)菌特點：單細(xì)胞真核微生物，自然界普遍存在，主要分布于含糖較多的酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物葉子上以及果園土壤中。釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬（基因工程菌）應(yīng)用：用于釀酒、制造面包、生產(chǎn)脂肪酶以及生產(chǎn)可食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等。2.1發(fā)酵工業(yè)菌種2.1.2酵母菌特點：“發(fā)霉的真菌”，自然界分布廣泛，大量存在于土壤、空氣、水和生物體中，喜歡偏酸性環(huán)境。曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉2.1發(fā)酵工業(yè)菌種2.1.3霉菌應(yīng)用：可廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)酶制劑、抗生素、有機(jī)酸及甾體激素等。特點：介于細(xì)菌和真菌之間的單細(xì)胞微生物；原核生物類群，自然界分布廣，尤其在含有機(jī)質(zhì)豐富的微堿性土壤中分布較廣，大多腐生，少數(shù)寄生。鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動放線菌應(yīng)用：最大經(jīng)濟(jì)價值在于能產(chǎn)生多種抗生素，如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。從微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素有60%以上由放線菌產(chǎn)生。2.1發(fā)酵工業(yè)菌種2.1.4放線菌定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物，其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。特點：廣泛存在于各種自然環(huán)境中，尤其各種極端環(huán)境中，如高溫、低溫、高壓、高鹽度、高輻射以及較強(qiáng)的酸堿環(huán)境。研究方法：模擬自然培養(yǎng)法:

原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單細(xì)胞操作宏基因組分析法：是直接依據(jù)基因或基因組、蛋白質(zhì)序列，以及其調(diào)節(jié)表達(dá)機(jī)制構(gòu)建高效表達(dá)的工程菌等途徑進(jìn)行開發(fā)利用——獲得優(yōu)良基因資源。2.1發(fā)酵工業(yè)菌種2.1.5未培養(yǎng)微生物常見菌種及其產(chǎn)物列表微生物類群菌種代謝產(chǎn)物細(xì)菌枯草桿菌、大腸桿菌、短桿菌等有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸、酶、維生素、醇類、抗生素等放線菌鏈霉菌屬等抗生素、維生素、酶、甾體轉(zhuǎn)化等酵母菌釀酒酵母，酒精酵母單細(xì)胞蛋白、核苷酸、核黃素、細(xì)胞色素C等霉菌曲霉屬，紅曲霉屬，根霉屬，青霉屬等乙醇、有機(jī)酸、抗生素、酶、維生素等已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物抗生素是次級代謝產(chǎn)物，需要生物體進(jìn)行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來源如下：放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌植物或動物來源已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單

谷氨酸發(fā)酵的菌種：棒桿菌屬、短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細(xì)菌其它氨基酸生產(chǎn)菌：常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌食品酶制劑生產(chǎn)有關(guān)的微生物

開發(fā)一個新酶，都要經(jīng)過一系列研究的毒理試驗。關(guān)于食品用酶，美國需要得到FDA的批準(zhǔn)，目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能用于生產(chǎn)食品用酶。目前大多數(shù)的工業(yè)微生物酶的生產(chǎn)都局限于使用僅有的11種真菌、8種細(xì)菌和4種酵母菌。

α-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物微生物生產(chǎn)的酶類枯草芽孢桿菌α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、堿性磷酸酶等大腸桿菌谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等黑曲霉糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纖維素酶等米曲霉糖化酶和蛋白酶、氨基?；?、磷酸二酯酶、果膠酶等青霉葡萄糖氧化酶、果膠酶、纖維素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核酸酶等木霉纖維素酶等根霉糖化酶、α-淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶等毛霉蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等鏈霉菌纖維素酶、蛋白酶等啤酒酵母轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等假絲酵母脂肪酶、轉(zhuǎn)化酶等問題：生產(chǎn)抗生素的微生物能不能用于生產(chǎn)氨基酸？理論上來說，微生物（包括動、植物細(xì)胞）幾乎可以生產(chǎn)我們所需的一切產(chǎn)品，但是涉及到工業(yè)化生產(chǎn)對于某一種特定的產(chǎn)品，只有特定的微生物才具有大量表達(dá)的潛力。已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹2.2發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選原則與基本技術(shù)2.2.1

發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢與要求2.2.2符合發(fā)酵工業(yè)要求的菌種獲得途徑2.2.3分離篩選原理與技術(shù)2.2.4應(yīng)用舉例

（1）

菌種選擇的總趨勢野生菌→變異菌自然選育→代謝控制育種誘發(fā)基因突變→基因重組的定向育種

2.2.1發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢與要求

2.2發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選原則與基本技術(shù)能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，且生成的目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易于回收；

生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期較短；培養(yǎng)條件易于控制；抗噬菌體及雜菌污染的能力強(qiáng)；

（2）

菌種選擇的要求2.2.1發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢與要求

菌種不易變異退化；對放大設(shè)備的適應(yīng)性強(qiáng)；菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素。

（2）

菌種選擇的要求（續(xù)）2.2.1發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢與要求

從菌種保存機(jī)構(gòu)直接購買所需菌株。中國菌種保藏管理委員會（CCCCM）、美國典型菌種保藏中心（ATCC）、英國國家典型菌種保藏所（NCTC）、日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO）等；從自然界中篩選；從生產(chǎn)過程中已有菌種中篩選發(fā)生正突變的優(yōu)良菌種。

2.2.2符合發(fā)酵工業(yè)要求的菌種獲得途徑（菌種來源）（1）

篩選的指導(dǎo)思想（2）

分離篩選工作在實際中應(yīng)用的幾個方面（3）

新種分離篩選原理與技術(shù)2.2.3菌種分離篩選原理與技術(shù)（1）

篩選的兩種指導(dǎo)思想

先分離純化，再結(jié)合工藝要求進(jìn)行篩選。分離純化同時富于篩選條件，一步得出所需菌株。結(jié)果有兩種可能：獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株

(2)分離篩選工作在實際中應(yīng)用的幾個方面從被污染的生產(chǎn)及科研用菌中分離目的菌；

生產(chǎn)中長期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株；從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。從保藏機(jī)構(gòu)獲取菌種進(jìn)行分離篩選有兩個好處：經(jīng)濟(jì)性指導(dǎo)性設(shè)計篩選方案時必須考慮兩個要點

選擇性靈敏度

（3）

新種分離與篩選的步驟

調(diào)查研究（包括資料查閱）

試驗方案設(shè)計

含微生物樣品的采集（如何使樣品中含所需微生物的可能性大？）

樣品預(yù)處理（如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)）

菌種分離

根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點分

選擇性分離方法

隨機(jī)分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測系統(tǒng)進(jìn)行間接分離）

富集液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng)

(初篩)

菌種純化

復(fù)篩

菌種純化初步工藝條件摸索再復(fù)篩生產(chǎn)性能測試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)試驗?zāi)承┍匾囼灪突蜃鳛橛N的出發(fā)菌株毒性試驗等

含微生物樣品的采集采樣時應(yīng)注意的問題:土壤微生物的分布（耕地、菜園和近郊土壤——細(xì)菌和放線菌；山坡上的森林土壤——霉菌和酵母菌）采土深度（5-25CM土層適宜）土壤植被情況（葡萄根部附近土壤——酵母菌）采樣季節(jié)土壤的酸堿度（偏堿——細(xì)菌和放線菌；偏酸——霉菌和酵母菌）對于分離篩選新菌種，還存在另兩個選擇標(biāo)準(zhǔn)：土壤來源廣泛在已適應(yīng)相當(dāng)苛刻環(huán)境壓力的微生物類群中尋找新菌種樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理（減菌）；膜過濾法（濃縮）；離心法（濃縮）化學(xué)方法：通過在培養(yǎng)基中添加某些化學(xué)成分來增加特定微生物的數(shù)量。

幾丁質(zhì)——放線菌；CaCO3——嗜堿性放線菌誘餌法石蠟、花粉、蛇皮、毛發(fā)等分離方法的選擇

根據(jù)目的菌有無選擇性特征來選擇分離方法菌種的營養(yǎng)特征獨特

生長特征獨特

無選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進(jìn)行

隨機(jī)分離選擇性分離的關(guān)鍵：生長培養(yǎng)條件的選擇與控制，從而實現(xiàn)定向富集篩選。選擇性分離

選擇性分離原理和技術(shù)生長條件的選擇與控制原理控制營養(yǎng)成分

控制培養(yǎng)基酸堿度

添加抑制劑

控制培養(yǎng)溫度

控制通氣條件

選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)施加選擇壓力，進(jìn)行定向篩選

A.富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)技術(shù)特點：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長或不利于目的菌以外的其他菌型生長的條件培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長速率（μmax）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時間和次數(shù)等問題連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率（μ）篩選

比生長速率（μ）與限制性基質(zhì)濃度（S）有關(guān)。

μ

ABS0基質(zhì)濃度對A、B兩種菌的比生長速率（μ）的影響

當(dāng)S<S0時，富集什么菌株？當(dāng)S>S0時，富集什么菌株？連續(xù)富集培養(yǎng)技術(shù)分離菌株的優(yōu)點

分離的菌株特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過程有利于分離具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物

B.固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌

選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì)

隨機(jī)分離原理與技術(shù)從產(chǎn)物入手，通過設(shè)計高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機(jī)分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術(shù)關(guān)鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應(yīng)篩選方法的確定。隨機(jī)分離技術(shù)舉例

抗生素產(chǎn)生菌的篩選藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選生長因子產(chǎn)生菌的篩選多糖產(chǎn)生菌的篩選

高產(chǎn)培養(yǎng)基設(shè)計的幾個原則

制備一系列的培養(yǎng)基，其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長限制因素；使用一聚合或復(fù)合形式的生長限制養(yǎng)分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代謝物阻遏；確定含有所需的輔因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH緩沖劑以減少pH變化；前體、促進(jìn)劑及抑制劑的采用?？股禺a(chǎn)生菌的篩選篩選模型：試驗菌篩選方法：鋪菌法影印平板法液體培養(yǎng)篩選

抗藥性篩選篩選模型：氨芐青霉素和β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌（克雷白氏菌）協(xié)同

I II無試樣時（不含棒酸時），I對II菌作用不大有試樣時（含棒酸時），I對II菌恢復(fù)藥效，棒酸抑制水解酶活性

固體培養(yǎng)篩選試驗菌代表微生物類型金黃色葡萄球菌209p革蘭氏陽性球菌枯草桿菌6633 革蘭氏陽性桿菌 大腸桿菌革蘭氏陰性腸道細(xì)菌恥垢分枝桿菌607

結(jié)核桿菌 白色念珠菌 酵母狀真菌 青霉菌

絲狀真菌

藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選

藥理活性化合物是指能抑制人類代謝中某一個關(guān)鍵酶的微生物產(chǎn)物即酶抑制劑，從而達(dá)到治療的目的。篩選模型：目標(biāo)酶生長因子產(chǎn)生菌的篩選

篩選模型：營養(yǎng)缺陷型試驗菌

篩選方法：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進(jìn)營養(yǎng)缺陷型試驗菌生長氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預(yù)處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個單菌落復(fù)印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應(yīng)到copy前相應(yīng)

u.v線殺死長好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，對產(chǎn)物進(jìn)行定量測定篩選產(chǎn)物含量高的菌株多糖產(chǎn)生菌的篩選取樣特點：碳水化合物工業(yè)的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據(jù)液體培養(yǎng)測定多糖含量來篩選高產(chǎn)菌。細(xì)菌分離：以乳酸菌為例

取未成熟的醬醪樣品1g至無菌磨口瓶中

加麥芽汁至瓶口處，封塞，25℃培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)基中長出絹絲狀波動物，鏡檢桿狀，陽性染色初步斷定乳酸菌

用選擇性培養(yǎng)基分批富集培養(yǎng)2-3代稀釋分離法分離單菌落，培養(yǎng)基為含麥芽汁、CaCO3的瓊脂培養(yǎng)基

根據(jù)透明圈挑選菌落

性能測定（鏡檢桿狀，染色陽性；乳酸紙層析鑒定）

Rf值定性（有機(jī)酸呈黃斑點）

乳酸生成量測定（滴定法）放線菌的分離：

以產(chǎn)鏈霉素菌種的分離為例

（從退化菌種中篩選）

取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml無菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏高產(chǎn)菌恢復(fù)根據(jù)高產(chǎn)菌的特點，選擇目的菌落放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測試篩選模型：形態(tài)依據(jù)真菌的分離篩選：以啤酒酵母的分離為例

取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7

稀釋分離法取0.1ml加入固體培養(yǎng)基鋪平皿（×2）

在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48-72h

形態(tài)篩選根據(jù)正常株特點進(jìn)行挑選，接種斜面?zhèn)溆?/p>

純化，采用平板分離法進(jìn)一步純化，至少反復(fù)三次

①生成子囊孢子速度測定 ②發(fā)酵力測定性能測定③熱死溫度測定 ④凝集力測定 ⑤雙乙酰含量測定2.3發(fā)酵工業(yè)菌種的鑒定（自學(xué)）鑒定工作主要包括：測定一系列必要的鑒定指標(biāo)；查找權(quán)威性鑒定手冊，確定菌種類型。鑒定微生物的技術(shù)（四個水平）：細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性水平；細(xì)胞組分水平；蛋白質(zhì)水平；基因或核酸水平。經(jīng)典的分類鑒定方法現(xiàn)代分類鑒定方法菌種選育改良的具體目標(biāo)：提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品2.4發(fā)酵工業(yè)菌種改良

發(fā)酵工業(yè)菌種改良方法常規(guī)育種(誘變育種)細(xì)胞工程育種基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)基因工程育種蛋白質(zhì)工程育種代謝工程育種

2.4發(fā)酵工業(yè)菌種改良

代謝工程的定義利用多基因重組技術(shù)有目的地對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個新的學(xué)科領(lǐng)域。又稱作途徑工程，是多基因的基因工程。代謝工程育種思路（1）

改變代謝流：改變分支代謝途徑的流向，阻斷有害代謝產(chǎn)物的合成。a加速限速反應(yīng)b改變分支代謝途徑流向：提高代謝分支點的某一分支代謝途徑酶系的活力，在與另外的分支代謝途徑的競爭中占有優(yōu)勢，可以提高目的代謝末端產(chǎn)物的產(chǎn)量。c構(gòu)建代謝旁路d改變能量代謝途徑

代謝工程育種思路(2)擴(kuò)展代謝途徑

a在引入外源基因后，使原來的代謝途徑向后延伸，產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物。

b使原來的代謝途徑向前延伸，可以利用新的原料生物合成代謝末端產(chǎn)物。

代謝工程育種思路

(3)轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑

1)轉(zhuǎn)移代謝途徑:為生產(chǎn)某一新的化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物，將催化某一代謝途徑的基因組克隆到另一不具備該種能力的微生物中，達(dá)到代謝途徑轉(zhuǎn)移的目的，使之具備生產(chǎn)該種新化合物的能力。

2)構(gòu)建新的代謝途徑:利用基因工程手段，通過克隆少數(shù)基因?qū)⒃瓉砑?xì)胞中無關(guān)的兩條代謝途徑橋連在一起，形成新的代謝途徑。

本章內(nèi)容

2.1

發(fā)酵工業(yè)菌種2.2發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的原則與基本技術(shù)2.3發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定2.4發(fā)酵工業(yè)菌種改良2.5菌種保藏、復(fù)壯與擴(kuò)培一、菌種保藏的意義菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。2.5發(fā)酵工業(yè)菌種保藏、復(fù)壯與擴(kuò)培二、菌種保藏的原理菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于“體眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟(jì)，以便生產(chǎn)上能推廣使用。

菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：A斜面冰箱保藏法（酵母）斜面保藏是一種短期、過渡的保藏方法，用新鮮斜面接種后，置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子生長豐滿后，放在4℃冰箱保存。一般保存期為三個月到六個月。B石蠟油封存法（酵母）向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蠟油作碳源的細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期約一年左右。三、菌種保藏的方法C沙土管保藏法（細(xì)菌，霉菌，防線菌）這是國內(nèi)常采用的一種方法。適合于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物。它的制備方法是：

首先，將沙與土洗凈烘干過篩后，按沙與土的比例為l－2∶l混合均勻，分裝于小試管中，裝料高度約為1厘米左右，121°C間歇滅菌三次，滅菌試驗合格后烘干備用。一般沙用80目過篩，土用30－100目過篩。其次，將斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或?qū)⑿泵骀咦庸蜗轮苯优c沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱內(nèi)保存。一般保存期為1年左右。

D真空冷凍干燥保藏法（細(xì)菌，防線菌）

真空冷凍干燥保藏法是目前常用的較理想的一種方法。其基本原理是在較低的溫度下（－15℃），快速她將細(xì)胞凍結(jié)，并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。在這樣的環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時停止，不易發(fā)生變異。因此，菌種可以保存很長時間，一般5年左右。這種保藏方法雖然需要一定的設(shè)備，要求亦比較嚴(yán)格，但由于該方法保藏效果好，對各種微生物都適用。所以，國內(nèi)外都已較普遍地應(yīng)用。這種方法的基本操作過程是先將微生物制成懸浮液，再與保護(hù)劑混合，然后放在特制的安瓶管內(nèi)，用低溫酒精或干冰，使其迅速凍結(jié)，在低溫下用真空泵抽干，最后將安瓿管真空熔封，并低溫保藏。保護(hù)劑一般采用脫脂牛奶或血清。保護(hù)劑的作用可能是在冷凍干燥的脫水過程中代替結(jié)合水而穩(wěn)定細(xì)胞成分（細(xì)胞膜）的構(gòu)型，防此細(xì)胞膜因為凍結(jié)而破壞。保護(hù)劑還可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。E液氮超低溫保藏法（細(xì)菌，真菌）

液氮超低溫保臧法足近幾年才發(fā)展起來的，此法國外已較普遍采用，是適用范圍最廣的微生物保藏法。尤其是一些不產(chǎn)孢子的菌絲體，用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。其保存期最長。a原理用液氮能長期保存菌種。這是因為液氮的溫度可達(dá)一196℃，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其新陳代謝作用停止的溫度（一130℃），所以此時菌種的代謝活動已停止，化學(xué)作用亦隨之消失。b操作方法及步驟（1）安瓿管要求由于液氮保存于超低溫狀態(tài)，所使用的安瓿管需能承受大的溫差而不致于破裂，一般用95料或GCl7的玻璃管，安瓿管選好后印上標(biāo)記，加棉塞后滅菌，烘干后備用。（2）菌種準(zhǔn)備及分裝

因為液氮法菌種要經(jīng)受超低溫的冷凍過程。所以也需要保護(hù)劑，常用的保護(hù)劑為10％甘油。用保護(hù)劑制備好菌液后，加入準(zhǔn)備好的安瓶管中，一般安瓿管的裝量為0.2－1mL。（3）凍結(jié)液氮法的關(guān)鍵是先把微生物從常溫過渡到低溫。這樣在細(xì)胞接觸低溫前，使細(xì)胞內(nèi)自由水通過膜滲出而不使其遇冷形成冰晶而傷害細(xì)胞。美國ATCC采用先將菌液降溫到0℃，再以每分鐘降低1℃的速度，一直降低到－38℃，然后才把裝有菌液的安瓿管放入液氮罐的氣相中。由于液氮要蒸發(fā)，這樣溫度就會上升，冰晶狀態(tài)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致菌種死亡。所以要常常注意液氮的殘存量，定期補(bǔ)加。（4）重新培養(yǎng)當(dāng)要使用或檢查所保存的菌種時，可將安瓿管從冰箱中取出，室溫或35－40℃水浴中迅速解凍，當(dāng)升溫至0℃時即可打開安瓿管，將菌種移到適宜的培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)。我國國內(nèi)目前已有部分單位采用液氮法保存菌種。四、菌種的衰退與復(fù)壯（1）菌種衰退

菌種經(jīng)過長期人工培養(yǎng)或保藏，由于自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象。菌種退化的原因

基因突變；變異菌株性狀分離；誘變的單菌落是由—個以上孢子或細(xì)胞形成菌落由—個孢子或單個細(xì)胞形成，但它是多核細(xì)胞單核孢子發(fā)生突變時，雙鏈DNA上僅—條鏈上某個位點發(fā)生變化連續(xù)傳代其它因素菌種保藏不當(dāng)生長條件不滿足（培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件）防止菌種退化的措施控制傳代次數(shù)選擇合適的培養(yǎng)條件選擇合適的保藏方法菌種穩(wěn)定性檢查分離復(fù)壯（2）菌種復(fù)壯使衰退的菌種重新恢復(fù)原來的優(yōu)良特性。復(fù)壯措施：對已衰退菌種配合一定培養(yǎng)條件進(jìn)行單細(xì)胞分離純化淘汰衰退的個體選擇合適的培養(yǎng)基68

五、

菌種的擴(kuò)培擴(kuò)培概述定義、種子概念、必要性、質(zhì)量要求種子制備工藝影響種子質(zhì)量