關于食品中致病菌和病毒8.1腸桿菌科腸桿菌科是存在于人和動物腸道或自然界中的一群生物學性狀很相似的革蘭氏陰性短小桿菌。無芽孢，多數有周身鞭毛，能運動。在普通培養(yǎng)基上能生長。培養(yǎng)溫度為35oC。需氧或兼性厭氧。能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，氧化酶試驗陰性，觸酶試驗陽性。第2頁,共74頁，星期六，2024年，5月8.1.1大腸桿菌大腸桿菌E.coli是腸道正常菌群。一般情況下，多不致病，是人和動物腸道中的常居菌。在一定條件下，可引起腸道道外感染。致病性大腸桿菌：腸產毒性大腸桿菌（EnterotoxigenicE.coli);腸致病性大腸桿菌（EnteropathogenicE.coli);腸侵襲性大腸桿菌（EnteroinvasiveE.coli);腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicE.coli)。引起腹瀉、出血性腸炎。第3頁,共74頁，星期六，2024年，5月腸產毒性大腸桿菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC)引起嬰幼兒和旅游者腹瀉，出現輕度水瀉，也可呈嚴重霍亂樣癥狀。腹瀉常為自限性，一般2~3d即愈。鑒定ETEC主要測定大腸桿菌腸毒素，血清型有一定的參考意義。第4頁,共74頁，星期六，2024年，5月腸致病性大腸桿菌（EnteropathogenicE.coli，EPEC)是嬰兒腹瀉的主要病原菌，具有高度傳染性，嚴重者可致死，成人少見。EPEC產生VT毒素。VT毒素具有神經毒素、細胞毒素和腸毒素性。鑒定EPEC根據臨床表現和血清型。腸致病性大腸桿菌第5頁,共74頁，星期六，2024年，5月腸侵襲性大腸桿菌（EnteroinvasiveE.coli，EIEC)EIEC的多數菌株無動力，生化反應和抗原結構均類似痢疾桿菌。EIEC可引起豚鼠角結合膜炎，臨床上可借此協助鑒定EIEC。第6頁,共74頁，星期六，2024年，5月腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicE.coli，EHEC)可引起散發(fā)性或爆發(fā)性出血性結腸炎。主要菌型是O157：H7，還可有O26、O111、O103、O145等。1996年O157：H7在日本引起萬人的食物中毒，此外，美國、加拿大、瑞典、澳大利亞、英國等國家和地區(qū)相繼報道了EHECO157：H7的散發(fā)性感染和爆發(fā)流行。我國于1999年在蘇、皖、魯、豫發(fā)生爆發(fā)流行。腸出血性大腸桿菌第7頁,共74頁，星期六，2024年，5月腸出血性大腸桿菌O157:H7的檢驗方法：1、培養(yǎng)基制備改良EC新生霉素增菌肉湯（mEC）：EC肉湯滅菌后添加20mg/mL過濾除菌的新生霉素，使終濃度為20μg/mL。改良山梨醇麥康凱瓊脂（TC-SMAC）：山梨醇麥康凱瓊脂加入過濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液，使終濃度2.5mg/L，頭孢克污，使終濃度為0.05mg/L。MUG-LST肉湯：LST肉湯中添加4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使終濃度為0.1g/L。2、增菌培養(yǎng)稱取25克樣品放入225mLmEC中，均質。于41±1℃培養(yǎng)18-24小時。第8頁,共74頁，星期六，2024年，5月3、分離將mEC肉湯培養(yǎng)物10倍遞增稀釋。從10-4，10-5，10-6稀釋度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培養(yǎng)18~24小時?？梢蒃HECO157:H7菌落扁平，透明或半透明，邊緣光滑，呈淡褐色中心，直徑約2mm。4、鑒定挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接種MUG-LST，于36±1℃培養(yǎng)18~24小時，出現產氣，且無熒光者，分離到普通營養(yǎng)瓊脂。對純菌落用EHECO157:H7標準血清或膠乳凝集試劑作凝集試驗，必要時進行生化試驗。在檢測過程中，也可以在選擇性增菌后，取出5mL增菌液，經100℃水浴15分鐘滅活后，供自動酶聯熒光免疫測試（VIDAS），迅速獲得初步結果，陽性反應者需作進一步證實。第9頁,共74頁，星期六，2024年，5月EHECO157:H7檢驗程序圖解

檢樣25g

↓

mEC225mL→酶聯熒光免疫測試VIDAS快速篩選

↓41±1℃，18-24h

10-4，10-5，10-6稀釋度涂布TC-SMAC

↓36±1℃，18-24h

挑取5-10個可疑菌落接種MUG-LST

↓36±1℃，18-24h

MUG陰性培養(yǎng)物轉種普通營養(yǎng)瓊脂

↓

↓

生化反應鑒定

血清凝集鑒定或膠乳凝集試驗第10頁,共74頁，星期六，2024年，5月生化試驗：

將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進行生化試驗。1色氨酸肉湯：在36±1℃培養(yǎng)24±2h后,加Kovacs氏試劑0.2～0.3mL,上層出現紅色為靛基質陽性反應。2MR-VP培養(yǎng)基：在36±1℃培養(yǎng)48±2h。以無菌操作移取培養(yǎng)物1mL至13mm×100mm試管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結晶,振搖試管后靜置2h,如出現伊紅色,為VP試驗陽性。

將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色,為甲基紅試驗陽性,若變黃色則為陰性反應。3Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1℃培養(yǎng)96h記錄有無生長。4LST肉湯：于36±1℃培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產氣。5革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。第11頁,共74頁，星期六，2024年，5月靛基質（Indole）試驗：某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。試驗方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗培養(yǎng)基管，于36±1C培養(yǎng)24h時后，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。

第12頁,共74頁，星期六，2024年，5月甲基紅（MethylRed）試驗腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。V-P試驗某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。大腸桿菌：MR+/VP-第13頁,共74頁，星期六，2024年，5月枸椽酸鹽試驗：某些細菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。第14頁,共74頁，星期六，2024年，5月用上述方法在樣品中分離獲得的純菌落，經抗E.coliO157:H7標準血清或EHECO157:H7膠乳凝集測試為陽性者，報告檢出腸出血性大腸桿菌O157:H7。如需要進一步檢測Vero毒素基因的存在，可通過接種Vero細胞或Hela細胞，觀察細胞病變進行判定，或可使用基因探針檢測和聚合酶鏈反應（PCR）檢測法。第15頁,共74頁，星期六，2024年，5月大腸桿菌的檢測（1）常規(guī)檢測方法

國家標準：國家標準采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗。乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產氣。分離培養(yǎng)：將產氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產氣情況。報告：根據證實為大腸桿菌陽性的管數，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。第16頁,共74頁，星期六，2024年，5月第17頁,共74頁，星期六，2024年，5月

原國家商檢局制訂的行業(yè)標準，等效采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進行檢測。本方法采用兩步法：推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產氣。證實試驗：將產氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產氣。以BGLB產氣為陽性。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。第18頁,共74頁，星期六，2024年，5月(2)PCR方法大腸桿菌是食品和水源污染糞便的指示菌。Gene-TARK研制出用浸染棒檢測大腸桿菌中16SrRNA的探針，樣品需前增菌處理，以異硫氰熒光素（FITC）標記探針，再用辣根過氧化物酶標記抗FITC抗體檢測雜交復合物。Hsu等報導此方法特異性（除相近的志賀氏菌外）達100％，假陽性率達1.2％。第19頁,共74頁，星期六，2024年，5月8.1.2沙門氏菌屬（Salmonella)沙門氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各國各類細菌性的食物中毒中，沙門氏菌常居前列。因此，沙門氏菌的檢測是各國檢驗機構對多種進出口食品的必檢項目之一。沙門氏菌屬是腸桿菌科中最復雜的菌屬。它屬于革蘭氏陰性桿菌?？筛鶕抽T氏菌的菌體抗原（O抗原）分群（A,B,C等），再根據其鞭毛抗原（H抗原）分血清型（1、2等）。第20頁,共74頁，星期六，2024年，5月沙門氏菌不產生外毒素，但能產生毒力較強的內毒素。沙門氏菌主要通過食物、飲水經口感染?？纱嬖诙喾N食物中，包括生肉、禽、蛋、奶制品、蝦、魚和田雞腿等。沙門氏菌主要通過食物、飲水經口感染。根據侵入機體沙門氏菌菌種的不同，在臨床上引起四種不同的疾病。第21頁,共74頁，星期六，2024年，5月（1）傷寒、副傷寒由沙門氏屬中的傷寒桿菌和甲、乙、丙型副傷寒桿菌引起。（2）食物中毒沙門氏菌屬引起的食物中毒，主要以腸炎桿菌、鼠傷寒桿菌、豬霍亂桿菌、丙型副傷寒桿菌和湯普遜桿菌等最為多見。臨床癥狀主要是胃腸炎。病程較短，一般2~4d,可完全恢復。（3）敗血癥多為豬霍亂桿菌引起，甲、乙、丙型副傷寒桿菌和腸炎桿菌亦可引起敗血癥。（4）慢性腸炎沙門氏桿菌可引起慢性、持久性腸炎。第22頁,共74頁，星期六，2024年，5月從食品中分離沙門氏菌樣品制備由于食品種類繁多，且每類中包括許多品種。因其加工方式不同，導致性狀各異。故在進行微生物學檢驗時，應按不同的形狀、加工方式及檢驗目的合理進行檢樣處理。檢樣處理冷凍的檢樣在檢樣前最好不要解凍，將沙門氏菌的損傷降低到最低限度。粉狀樣品應將225ml增菌液分數次加入，并用滅菌玻棒攪拌成均勻懸液。帶殼蛋類在流水下用刷子刷洗蛋類，并瀝干。將蛋類在含0.1％十二烷基磺酸鈉的200mg/kgCl-溶液中浸泡30min后方可破殼取蛋。第23頁,共74頁，星期六，2024年，5月檢測方法

從食品中分離和鑒定沙門氏菌，當前通常采用的方法共分5個步驟：前增菌：食品樣品在含有營養(yǎng)的非選擇性培養(yǎng)基中增菌，使受損傷的沙門氏菌細胞恢復到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。選擇性增菌：此培養(yǎng)基允許沙門氏菌持續(xù)增菌，同時阻止大多數其他細菌的增殖。選擇性平板分離：采用固體選擇培養(yǎng)基，抑制非沙門氏菌的生長，提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識別。生物化學篩選：排除大多數非沙門氏菌，也提供了沙門氏菌培養(yǎng)物菌屬的初步鑒定。血清學技術鑒定培養(yǎng)物菌種。第24頁,共74頁，星期六，2024年，5月（1）沙門氏菌的增菌和分離預增菌將制備好的預增菌試液于35℃培養(yǎng)24h后，輕輕振搖培養(yǎng)液。選擇性增菌

選擇性平板分離混勻培養(yǎng)物，用直徑3mm的接種環(huán)，1滿環(huán)（10ul）分別劃線接種于亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂和HEKTONE氏腸道菌（HE）瓊脂平板上，于35℃培養(yǎng)24h后，根據沙門氏菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征挑取典型或可疑菌落。第25頁,共74頁，星期六，2024年，5月（2）沙門氏菌的篩選和生化、血清學鑒定①篩選用滅菌接種針挑取每個典型或可疑菌落的中心部位，分別接種三糖鐵（TSI）、賴氨酸鐵瓊脂斜面，于35℃培養(yǎng)24h。在TSI瓊脂中，典型的沙門氏菌培養(yǎng)物可使斜面呈堿色（紅色），底層呈酸色（黃色），產生H2S（瓊脂變?yōu)楹谏┗虿划a生H2S。②生化學、血清學鑒定③混雜培養(yǎng)物對呈混雜的TSI瓊脂培養(yǎng)物，皆應劃線于MC、HE或XLD瓊脂上，于35℃培養(yǎng)24h后，進行重新分離并至少挑取2個可疑菌落接種到斜面上進行鑒定。第26頁,共74頁，星期六，2024年，5月④純培養(yǎng)物將每個可疑陽性的TSI瓊脂斜面培養(yǎng)物，分別接種于尿素肉湯中，35℃培養(yǎng)24h，獲取多量的瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于快速尿素肉湯中，于37℃水浴培養(yǎng)2h。棄去所有呈陽性結果的培養(yǎng)物，保留所有呈陰性反應的培養(yǎng)物作進一步鑒定。⑤血清學多價鞭毛（H）試驗⑥血清學多價菌體（O）試驗⑦菌體（O）群試驗⑧鞭毛（H）試驗陰性培養(yǎng)物的誘導（3）結果判定第27頁,共74頁，星期六，2024年，5月8.3彎曲菌彎曲菌是一組人畜共患的病原微生物，能引起人的腹瀉和食物中毒，在國外已被廣泛的重視，同時也被公認為新發(fā)現的病原菌之一。彎曲菌是革蘭氏陰性菌，呈弧形和S型。彎曲菌以病原菌和共生菌廣泛存在于動物中，家禽家畜是主要的貯存宿主和傳染源，在傳染或帶菌動物的腸道和生殖道內容物中含有大量的彎曲菌。食用被污染的食物、水，尤其是雞、鴨、蛋，未消毒或消毒不完全的牛奶，均可致病。第28頁,共74頁，星期六，2024年，5月檢驗方法（1）常規(guī)方法第29頁,共74頁，星期六，2024年，5月（2）現代檢驗技術①基因探針法核酸雜交試驗是以互補核酸鏈能夠特異性結合并形成穩(wěn)定的雙鏈復合物為基礎?；蛱结樝到y(tǒng)采用的是發(fā)光劑標記的單鏈DNA探針，該探針與核糖體RNA結合形成穩(wěn)定的DNA:RNA雜交體。選擇試劑將未雜交和雜交探針分開。標記的DNA:RNA雜交作用GEN-PROBE發(fā)光儀檢測。發(fā)光儀讀數大于或等于CUT-OFF值的為陽性，低于CUT-OFF值的為陰性。第30頁,共74頁，星期六，2024年，5月②PCR法根據彎曲菌屬16sRNA高保守序列設計一對引物；在合適的反應條件和反應體系下進行反應；最后利用電泳觀察結果。③熒光酶標試劑盒檢測彎曲桿菌的探針是用非放射性物質標記的。標記物為發(fā)光素。靶順序為rRNA。近年來用堿性磷酸酶人工合成的寡核苷酸檢測人工污染的糞便樣品，檢測量為一百萬個菌落形成單位（CFU)，敏感性和特異性達100％。此方法只在臨床檢測中應用，尚未用于食品檢測。第31頁,共74頁，星期六，2024年，5月8.4金黃色葡萄球菌葡萄球菌是一類革蘭氏陽性菌。它的致病力的強弱與其產生的毒素及酶類有關。人一旦感染該菌，當機體抵抗力減弱或皮膚受損時，易被感染，引起傷口化膿、中耳炎、毛囊炎等。產生葡萄球菌腸毒素的還可引起食物中毒。對人有致病性的葡萄球菌多產生α-溶血素；對動物有致病性的葡萄球菌多產生β-溶血毒素。第32頁,共74頁，星期六，2024年，5月金黃色葡萄球菌某些菌株能產生一種能引起急性腸胃炎的腸毒素，當這些菌株污染了食物，在溫度條件適宜時，即可產生相當數量的腸毒素，根據腸毒素的血清型別不同，分為A、B、C、D、E五型。其中以A型引起的食物中毒最多，B和C型次之。腸毒素是一種可溶性蛋白質純化的腸毒素，能耐高溫。第33頁,共74頁，星期六，2024年，5月血漿凝固酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標。血漿凝固酶具有抗原性，可分為8型。大多數致病性葡萄球菌能產生此酶，而非致病菌不產生?？蓱?個型的凝固酶抗血清進行分型試驗，用來研究葡萄球菌的流行病學情況。第34頁,共74頁，星期六，2024年，5月檢驗方法（1）常規(guī)檢驗方法第35頁,共74頁，星期六，2024年，5月（2）現代檢驗技術①利用mini－Vidas全自動免疫分析儀，它是應用酶聯免疫技術，用熒光分析技術通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標生物體，然后以帶熒光的酶聯抗體再次結合，經充分沖洗，通過激發(fā)光源檢測，即能自動讀出發(fā)光的陽性標本，其優(yōu)點是檢測靈敏度高、速度快，可在48h的時間內快速篩選鑒定出金黃色葡萄球菌及金黃色葡萄球菌腸毒素。第36頁,共74頁，星期六，2024年，5月②美國3M公司，利用耐熱核酸酶特性，設計出紙片法，能在24h快速檢測出金黃色葡萄球菌。③大多數檢測葡萄球菌的探針是針對腸毒素的。它們能同編碼腸毒素有關的基因序列雜交，這類探針能檢測腸毒素A、B、C和E。④PCR法：設計特異性引物根據產生腸毒素A-E基因（entA,entB,entC,entD和entE),檢測葡萄球菌exfoliative基因，檢測中毒休克毒素基因(tst)。第37頁,共74頁，星期六，2024年，5月8.5肉毒梭菌肉毒梭菌是嚴重食物中毒的病原菌之一，在厭氧的環(huán)境下能產生強烈的外毒素。這種毒素毒性強烈，是一種獨特的神經麻痹毒素，即肉毒毒素。該毒素性質穩(wěn)定，是目前已知化學毒物和生物毒素中毒性最強烈者，對人的致死劑量為0.1ug。第38頁,共74頁，星期六，2024年，5月肉毒梭菌在自然界的分布具有某種區(qū)域性差異，顯示出生態(tài)上的差異傾向。根據抗原特異性，可分為A、B、C、D、E、F、G七個型別。肉毒梭菌一年四季均可發(fā)生，發(fā)病主要與飲食習慣有密切的關系。歐美國家：肉類食品、罐頭食品；日本等沿海國家：進食水產品；我國內地：進食發(fā)酵食品（如臭豆腐、豆瓣醬、豆豉等）。第39頁,共74頁，星期六，2024年，5月檢驗方法1）常規(guī)肉毒梭菌的檢出GB/T4789.12-20032）PCR法報告（一）：檢樣含某型肉毒毒素報告（二）：檢樣含某型肉毒梭菌報告（三）：由樣品分離的菌株為某型肉毒梭菌第40頁,共74頁，星期六，2024年，5月8.6致病性弧菌

弧菌屬共有37個種（變種），其中已明確又12個種對人類有致病作用。在這12種致病菌種，最重要的，也是問題最多的是O1型霍亂弧菌、非O1型霍亂弧菌、副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌?；魜y弧菌(Vibrionaceaecholerae)霍亂弧菌是由O1血清群和O139血清群引起的烈性消化道傳染病。該病傳播快,波及面廣，是屬于國際檢疫的傳染病。水是傳播霍亂的主要媒介。與霍亂有關的食品主要是海產品、有殼的水生動物和甲殼動物，主要有魚、蝦、貝類、甲魚、牛蛙、蟹等。第41頁,共74頁，星期六，2024年，5月霍亂弧菌引起的疾病叫霍亂。由霍亂弧菌E1Tor生物型引起的癥狀較輕，病程也短。霍亂弧菌腸毒素會引起機體嚴重的嘔吐、腹瀉等臨床癥狀。霍亂弧菌的檢測方法生物學檢測方法，作霍亂弧菌O1+O139多價血清凝集試驗（水、食品）。PCR（對毒力基因ctxAB、tcpA進行擴增）。第42頁,共74頁，星期六，2024年，5月致病性弧菌的檢測方法1、具有代表性檢驗方法簡介（1）FDA的細菌學分析手冊霍亂、付弧、創(chuàng)傷弧菌和其他弧菌（19951998修訂）分別著重介紹了霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌的方法。用PCR方法檢測產腸毒素的霍亂弧菌敘述了霍亂腸毒素choleraToxin(T)基因（2）AOAC官方分析方法牡蠣中的霍亂弧菌：升溫富集法（1995.a）創(chuàng)傷弧菌的脂肪酸氣相色譜鑒定法AOAC.(1995.b）美國midi公司生產的shelock微生物鑒定系統(tǒng)。第43頁,共74頁，星期六，2024年，5月（3）ISO方法副溶血弧菌的檢測方法（ISO8914：1990E）（4）NMKL食品中致病性弧菌的檢測和計數（NMKLN0156）介紹了霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌的檢測程序。（5）不同國家的方法日本、瑞士等國均有相應檢驗方法。2、致病性弧菌的檢測方法以上介紹的方法均是以單一或少數目標菌（NMKL為四種）為目的的設計的程序。鑒于國外對出口食品中多種致病性弧菌的要求和重視，有必要探討“同一程序同時檢測多種弧菌”方法。第44頁,共74頁，星期六，2024年，5月檢驗程序

25g樣品+225mLAPW(1%NaClpH9.0)

增菌↓37℃8-16h

取10mL加入雙倍APW↓37℃6-8h

選擇選擇培養(yǎng)基TCBS（霍利斯用非選擇性的羊血球瓊脂）↓37℃24h

定弧菌取黃色或綠色菌落做G染色、氧化酶、動力↓O/129(150ug)、D-甘露糖

分組初步鑒定：0%NaCl,1%NaCl、硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧、鳥氨酸脫羧、(氧化酶)分成5組↓確證最后鑒定第45頁,共74頁，星期六，2024年，5月8.7病毒8.7.1諾瓦科病毒（Norwalkvirus）1972年首次發(fā)現。諾瓦科病毒是直徑27nm的圓形結構的病毒，無包膜，尚不能在實驗室培養(yǎng)。Norwalk病毒是最重要的引起腹瀉的腸道病毒。食品（包括水）被諾瓦科病毒感染后，出現以急性腸胃炎為主的臨床癥狀。目前，這類病毒尚無特效治療藥物。第46頁,共74頁，星期六，2024年，5月20世紀70年代在澳大利亞爆發(fā)了有2000多人感染諾瓦科病毒。另一起病例原因是運垃圾船將垃圾倒在正在捕撈貝類的區(qū)域。2006年11月，美國一艘名為“海洋自由”號的豪華郵輪，遭到了諾瓦克病毒的襲擊，在為期一周的航行中，300多名乘客和船員感染了諾瓦克病毒，受感染的人數是這艘船搭載的總人數的7%。諾瓦科病毒的毒力較強，發(fā)病有明顯的季節(jié)性（秋冬季），一般不造成爆發(fā)流行。第47頁,共74頁，星期六，2024年，5月在2006年底的一周內，日本各地小兒科醫(yī)療機構上報的諾瓦克病毒腹瀉人數，達到了6萬多人，發(fā)病率超過了有相關

統(tǒng)計25年來的歷年最高紀錄。根據推算，日本境內已經有超過300萬人感染諾瓦克病毒。自2002年以來，日本每年冬季都會爆發(fā)諾瓦克病毒，其中一些和牡蠣(生蠔)和生海鮮有關。2006年，日本媒體關注諾瓦克病毒和感染者在療養(yǎng)院死亡的情況。2006年到2007年，諾瓦克感染例子幾乎是之前的3倍。第48頁,共74頁，星期六，2024年，5月檢測方法（1）免疫電鏡法（IEM）

NV被發(fā)現后很長一段時間內，電鏡一直是檢測的主要手段，具有直接、可靠的優(yōu)點。電鏡觀察需要的樣品量為106～107個病毒顆粒/mL排泄物。這個技術僅在發(fā)病早期適用。免疫電鏡能使電鏡的靈敏度提高10-100倍。在顯微鏡下包被康復病人的血清。血清抗體玉同源病毒相結合，因此提高了診斷效率。但IEM不適合大規(guī)模流行病學調查。第49頁,共74頁，星期六，2024年，5月（2）放射免疫和生物素－親和素法（RIA法）檢測抗原與IEM法相比在靈敏度上沒有明顯差異，但用RIA法能檢測出急性期和恢復期之間抗體升高4倍以上，對流行病學調查更有意義。實驗需6d，同時還需要放射性同位素標記。（3）酶鏈免疫法（ELISA)

此法特異性強，靈敏度高，診斷迅速，且較經濟，是目前可廣泛應用的檢測方法。這種技術的檢測樣品量要求104～106病毒顆粒/mL排泄物。第50頁,共74頁，星期六，2024年，5月（4）雜交技術和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）

RT-PCR方法是檢測病人排泄物和環(huán)境中樣品的諾瓦科病毒基因的特異手段。這個方法的靈敏度為102～104病毒顆粒/mL排泄物。高敏感的RT-PCR方法依賴于PCR引物的設計。依賴RNA的RNA聚合酶區(qū)域被認為是諾瓦科病毒基因組的最保守的區(qū)域。盡管用于擴增的RdRp區(qū)域基因的引物能擴增大多數的諾瓦科病毒，但由于諾瓦科病毒遺傳多樣性使這些引物很難擴增所有的諾瓦科病毒。第51頁,共74頁，星期六，2024年，5月8.7.2甲肝病毒（HAV）病毒性肝炎是當前危害人類健康的疾病之一。目前認為病毒性肝炎病原體至少有五種，包括甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、戌型肝炎病毒（HEV），它們的特性、傳播途徑、臨床經過均不完全相同，但它們均能引起肝炎病變。第52頁,共74頁，星期六，2024年，5月項目甲型肝炎乙型肝炎丙型肝炎丁型肝炎戌型肝炎病毒HAVHBVHCVHDVHEV病毒分類微小核糖核酸病毒嗜肝脫氧核糖核酸病毒黃病毒（缺陷病毒）杯狀病毒病毒大小27nm42nm30～60nm40nm27～34nm基因ssRNA（+）7.8kbdsDNA3,2kbssRNA(+)10.5kbssRNA(-)1.7kbssRNA(+)3.5kb抗原HAVAg（VP1～4）HBsAgHBcAgHBeAgHCVAgHDVAgHEVAg傳播途徑腸道傳播腸道外及性傳播多數腸道外傳播多數和腸道外傳播腸道傳播潛伏期（范圍）25天（15～45天）75天（40～120天）50天（15～90天）50天（25～75天）40天（20～30天）慢性化無3～10%40～70%2～70%無暴發(fā)性肝炎0.2%0.2%0.2%2～20%0.2～10%第53頁,共74頁，星期六，2024年，5月1973年Feinslone首先用免疫電鏡技術在急性期患者的糞便中發(fā)現甲型肝炎病毒(HepatitisAvirus,HAV)。屬微小RNA病毒科，新型腸道病毒72型。人類感染HAV后，大多表現為亞臨床或隱性感染，僅少數人表現為急性甲型肝炎。一般可完全恢復，不轉為慢性肝炎，亦無慢性攜帶者。第54頁,共74頁，星期六，2024年，5月HAV第55頁,共74頁，星期六，2024年，5月甲型肝炎病毒主要的傳染病源是甲肝病人?？赏ㄟ^污染水源、食物、食具和手等方式進行傳播，特別是經水和食物，可引起爆發(fā)性流行。另外，通過血液也可傳播。病人的潛伏期為一個月，在潛伏后期和急性期，患者的糞便和血液均具有傳染性。第56頁,共74頁，星期六，2024年，5月檢驗方法（1）免疫電鏡敏感性高，標本中含有104~106顆粒/mL可被檢出。將標本加入特異性抗體HAV血清，經孵育后，HAV顆粒與抗血清發(fā)生凝集，再用超速離心加以濃縮，取其免疫復合物，用磷鎢酸鹽進行染色，于電鏡下檢查HAV球形顆粒。（2）固相放射免疫測定法將放射性同位素與免疫化學相結合的體外測定超微量物質的實驗方法，具有同位素技術的高靈敏性、準確性的優(yōu)點，同時又兼有抗原抗體反應的專一性。第57頁,共74頁，星期六，2024年，5月另外，檢查方法還有補體結合試驗、酶聯免疫吸附和免疫黏附血凝試驗等方法。通過利用葡萄糖球菌A蛋白可吸附IgG的方法，在單份血清中可區(qū)別甲肝抗體為IgM和IgG，根據急性期病人血清抗體為IgM，而恢復期病人的血清抗體為主要是IgG，可對甲肝急性期病人進行早期診斷。第58頁,共74頁，星期六，2024年，5月8.7.3瘋牛?。貌《警偱２?“madcow”disease)學名為“牛海綿狀腦病”(BovineSpongiformEncephalopath--BSE)，是一種發(fā)生在牛身上的進行性中樞神經系統(tǒng)病變，癥狀與羊瘙癢癥類似，俗稱“瘋牛病”。病牛腦組織呈海綿狀病變，并出現步態(tài)不穩(wěn)、平衡失調、搔癢、煩燥不安等癥狀，通常在14至90天內死亡。由于種類的不同，瘋牛病的潛伏期長短不同，一般在2到30年之間。第59頁,共74頁，星期六，2024年，5月20世紀80年代中期至90年代中期是瘋牛病暴發(fā)流行期，主要的發(fā)病國家如英國及其他歐洲國家有大量的?；疾〔⒈辉讱?，發(fā)生瘋牛病國家的牛肉及牛肉制品的出口受到了嚴格的限制。盡管歐洲各國紛紛采取預防措施，但是到了1989年，瘋牛病還是攻破了英國的近鄰愛爾蘭的大門。瑞士和法國1990年也各自發(fā)現了第一例瘋牛病。到1997年11月，葡萄牙、丹麥、德國、荷蘭、比利時也相繼出現瘋牛病。1998年瘋牛病又跨出了歐洲，來到南美洲的厄瓜多爾。2000年后，西班牙、瑞典、捷克、希臘、斯洛伐克、芬蘭、奧地利先后“陷落”。值得注意的是遠隔千山萬水的日本，在2001年也報告了亞洲首例瘋牛病。2002年，以色列和波蘭相繼出現了國內首例瘋牛病。第60頁,共74頁，星期六，2024年，5月2003年5月，加拿大發(fā)現一例瘋牛病，這是近10年來北美大陸發(fā)現的首例瘋牛病。2003年12月，美國發(fā)現首例瘋牛病。不到20年工夫，瘋牛病就已擴散到了歐洲、美洲和亞洲的幾十個國家。英國是發(fā)生瘋牛病最多的國家，1999年統(tǒng)計占總發(fā)病數的99％。到2000年7月，在英國有超過34000個牧場的17.6萬多頭牛感染了此病，最高發(fā)病時間是在1993年1月，每月至少有1000頭牛發(fā)病。截至到2002年，英國共屠宰病牛1100多萬頭，經濟損失達數百億英鎊。截至2003年12月底，中國尚未發(fā)現瘋牛病。第61頁,共74頁，星期六，2024年，5月

受瘋牛病危害的不僅是牛，人若食用了被污染了的牛肉、牛脊髓等，也有可能染上致命的新型克－雅氏癥?；颊吣X部會出現海綿狀空洞，先是表現為焦躁不安，后導致記憶喪失，身體功能失調，最終精神錯亂甚至死亡。新型克－雅氏癥患者以年輕人為主，發(fā)病時間平均為14個月。截至2003年底累計已有至少137人死于新型克雅氏癥，其中多數在英國。第62頁,共74頁，