基因工程的基本工具和基本操作程序練習(xí)一、選擇題1.如圖表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相關(guān)的酶作用位點(diǎn)。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.甲、乙、丙都屬于黏性末端B.甲、乙片段可形成重組DNA分子,但甲、丙不能C.DNA連接酶的作用位點(diǎn)在圖乙中b處D.切割甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子2.圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn),AmpR表示氨芐青霉素抗性基因,neoR表示新霉素抗性基因。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí),可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過(guò)程中,不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段,無(wú)法避免自身環(huán)化和反向連接D.導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3.將外源基因送入細(xì)胞通常是利用質(zhì)粒作為載體。下列有關(guān)質(zhì)粒的敘述,正確的是()A.質(zhì)粒上常有特殊的標(biāo)記基因,以便于重組DNA分子的篩選B.質(zhì)粒從細(xì)胞中提取出來(lái)后即可以直接使用,無(wú)須人工改造C.質(zhì)粒是具有自我復(fù)制能力的DNA分子,只存在于原核生物中D.質(zhì)粒一般只有一個(gè)限制酶切割位點(diǎn),以便于目的基因插入4.農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移并隨機(jī)插入被侵染植物的染色體DNA中。研究者將圖中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán),并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出T-DNA插入位置兩側(cè)的未知序列,以此可確定T-DNA插入的具體位置。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是()A.PCR擴(kuò)增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理B.進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要耐高溫的DNA聚合酶C.利用圖中的引物②③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列D.通過(guò)與受體細(xì)胞的基因組序列比對(duì),可確定T-DNA的插入位置5.通過(guò)引物設(shè)計(jì),運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變,如圖為基因工程中獲取突變基因的過(guò)程,其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì),但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì),反應(yīng)體系中引物1和引物2分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述正確的是()A.限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)分別加在引物1和引物2的3′端B.PCR反應(yīng)體系中需要加入脫氧核苷酸、模板、Ca2+等C.第2輪PCR中,引物1與圖中②結(jié)合并形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因D.在第3輪PCR結(jié)束后,同時(shí)含引物1和引物2的DNA占3/46.OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四個(gè)基因分別編碼四種不同的酶,研究人員將這些基因分別與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(引導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體)基因連接,構(gòu)建多基因表達(dá)載體(載體中部分序列如圖所示),利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻,在水稻葉綠體內(nèi)構(gòu)建了一條新代謝途徑,提高了水稻的產(chǎn)量。下列敘述正確的是()A.可用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測(cè)四種酶在轉(zhuǎn)基因水稻中是否表達(dá)B.四個(gè)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)都以DNA的同一條單鏈為模板C.應(yīng)選用含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞D.四個(gè)基因都在水稻葉綠體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯7.(多選)戊型肝炎病毒是一種RNA病毒,ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白(pORF2)位于病毒表面,構(gòu)成病毒的衣殼。我國(guó)科研人員利用基因工程技術(shù),在大腸桿菌中表達(dá)pORF2,制備戊型肝炎疫苗,過(guò)程如圖。下列關(guān)于該疫苗的敘述正確的是()A.過(guò)程①需要的酶是RNA聚合酶,原料是A、U、G、CB.重組基因表達(dá)載體上的啟動(dòng)子需來(lái)源于大腸桿菌C.過(guò)程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)D.過(guò)程⑥大量制備pORF2蛋白前應(yīng)做相應(yīng)的檢測(cè)與鑒定8.關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn),下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是()A.過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解B.離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C.在一定溫度下,DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)9.如圖是“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖。下列相關(guān)敘述不正確的是()A.選用植物細(xì)胞提取DNA時(shí)需先研磨破碎細(xì)胞B.圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯(cuò)誤,可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯C.圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精,而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶于酒精D.圖2試管1的作用是證明物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺試劑出現(xiàn)藍(lán)色10.某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外,還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生,以下措施中有效的是()A.增加模板DNA的量 B.延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間C.延長(zhǎng)延伸的時(shí)間 D.提高復(fù)性的溫度11.關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn),下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A.凝膠中的DNA分子通過(guò)染色,可以在紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)B.微量離心管、蒸餾水和移液器在使用前均需進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理C.DNA向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng),遷移速率與凝膠濃度、DNA的大小和構(gòu)象有關(guān)D.PCR所用的緩沖液從冰箱拿出之后,應(yīng)放在冰塊上緩慢融化,目的是不破壞穩(wěn)定性較差的成分二、非選擇題12.塑料制品方便人們生活的同時(shí),也造成了短時(shí)期難以降解的“白色污染”。研究人員欲比較腸桿菌YT1和芽孢桿菌YP1兩類細(xì)菌降解塑料[主要成分為聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)和聚丙烯(PP)等],兩類細(xì)菌主要降解PE,并通過(guò)基因工程拼接黃粉蟲(chóng)腸道內(nèi)菌株WZ的降解PVC的胞外酶基因A,培育降解塑料的“超級(jí)菌”。(1)菌株的篩選。配制固體培養(yǎng)基,接種菌株后表層覆蓋0.1mm厚度的PE塑料。分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表所示:培養(yǎng)基及接種菌株培養(yǎng)基1培養(yǎng)基2培養(yǎng)基3單獨(dú)培養(yǎng)并接種YT1單獨(dú)培養(yǎng)并接種YP1混合培養(yǎng)YT1和YP1后,選取YP1接種降解圈(直徑D/mm)3.51.84.2①在篩選分解PE塑料能力大小的菌株時(shí),應(yīng)將兩類菌株接種到以為唯一碳源的培養(yǎng)基,從功能上講,該培養(yǎng)基屬于培養(yǎng)基。

②篩選分解PE塑料能力強(qiáng)的菌株不能直接以降解圈的大小為指標(biāo),其原因是

。

培養(yǎng)基3中接種混合培養(yǎng)后的YP1,其降解圈直徑明顯加大,其原因可能是

。

(2)培育“超級(jí)菌”。對(duì)菌株WZ的A基因測(cè)序可知,如果在其調(diào)節(jié)功能區(qū)增加一個(gè)堿基對(duì)A/T,則可以大大增強(qiáng)其基因表達(dá)能力。通過(guò)經(jīng)典的大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)在體外改造A基因,操作過(guò)程如圖1,然后與圖2所示的質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體,培育“超級(jí)菌”。①利用大引物PCR進(jìn)行定點(diǎn)誘變需要進(jìn)行兩輪PCR(PCR1和PCR2),在PCR中獲得的大引物是指(填“a”或“b”),利用大引物和引物2至少需要個(gè)PCR循環(huán)才能獲得完整的改良A基因。

②構(gòu)建改良基因表達(dá)載體時(shí),為實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒和改良基因的準(zhǔn)確連接,應(yīng)選用的限制酶是。表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌株時(shí),有的質(zhì)粒含有改良的A基因,有的質(zhì)粒為空白質(zhì)粒。在含氨芐青霉素和Xgal的平板上培養(yǎng)一段時(shí)間后,其中白色菌落含有重組質(zhì)粒,判斷的依據(jù)是

。

答案:1.C甲、乙的黏性末端相同,因此可在DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子,但甲、丙的黏性末端不同,它們之間不能形成重組DNA分子;DNA連接酶將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子,作用部位是磷酸二酯鍵,即圖乙中a處;切割甲的限制酶的識(shí)別序列為GAATTC∥CTTAAG,而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為GAATTG∥CTTAAC,因此切割甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子。2.D切割目的基因時(shí),用BamHⅠ切割會(huì)破壞目的基因,只用PstⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體,會(huì)出現(xiàn)目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化,或目的基因和質(zhì)粒的反向連接,而用PstⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切,能確保目的基因和質(zhì)粒的正向連接,并且質(zhì)粒上保留新霉素抗性基因作為標(biāo)記基因;在酶切過(guò)程中,不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因,至少需保留其中的一個(gè);用PstⅠ切割后,質(zhì)粒上氨芐青霉素抗性基因被破壞了,導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌不可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。3.A質(zhì)粒一般需要經(jīng)過(guò)人工改造才可以使用;質(zhì)粒存在于真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中;質(zhì)粒一般具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn),以供目的基因插入其中。4.C由于DNA的兩條鏈反向平行,且子鏈從引物的3′端開(kāi)始延伸,故利用圖中的引物①④組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列。5.DDNA的合成方向是從子鏈的5′端向3′端延伸,據(jù)此可知,圖中限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)分別加在引物1和引物2的5′端;PCR反應(yīng)體系中需要加入模板、脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶和擴(kuò)增緩沖液(含Mg2+)等物質(zhì);第3輪PCR中,引物1與圖中②結(jié)合并形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因;在第3輪PCR結(jié)束后,會(huì)產(chǎn)生23=8(個(gè))DNA分子,其中含有模板的DNA分子有2個(gè)只含有一個(gè)引物,則同時(shí)含引物1和引物2的DNA占3/4。6.A由題圖可知,在同一個(gè)T-DNA中OsGLO1啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的方向與其他三個(gè)基因的不同,說(shuō)明四個(gè)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)并不都以DNA的同一條單鏈為模板;卡那霉素抗性基因不在T-DNA中,而潮霉素抗性基因在T-DNA中,應(yīng)選用含潮霉素的培養(yǎng)基篩選被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞;由題意知,利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻,可使目的基因插入水稻細(xì)胞中染色體的DNA上,所以與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因連接的四個(gè)基因,在水稻細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,在核糖體中進(jìn)行翻譯。7.BD戊型肝炎病毒是一種RNA病毒,過(guò)程①是以病毒RNA為模板合成DNA,獲取目的基因的過(guò)程,需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶,原料是四種脫氧核苷酸;啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段,其作用是供RNA聚合酶的識(shí)別結(jié)合以驅(qū)動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄,啟動(dòng)子具有物種或組織特異性,構(gòu)建在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)pORF2的載體時(shí),需要選擇大腸桿菌細(xì)胞的啟動(dòng)子,而不能選擇其他物種的啟動(dòng)子;將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是Ca2+處理法,需要用Ca2+處理大腸桿菌,使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。8.B低溫時(shí)DNA酶的活性較低,過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解;離心研磨液是為了使細(xì)胞碎片沉淀;在沸水浴條件下,DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色;細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶于酒精,但可能有的蛋白質(zhì)不溶于酒精,在95%的冷酒精中與DNA一塊兒析出,故粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)。9.D圖2所示實(shí)驗(yàn)的試管中溶液的液面高于燒杯中的液面,可能導(dǎo)致加熱不充分,試管2中藍(lán)色變化不明顯;圖2中試管1起對(duì)照作用,目的是證明沸水浴下物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺試劑不會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色,而DNA遇二苯胺試劑出現(xiàn)藍(lán)色。10.D增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度,但不能有效減少非特異條帶的產(chǎn)生;延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間和延長(zhǎng)延伸的時(shí)間會(huì)影響變性和延伸過(guò)程,但對(duì)于延伸中的配對(duì)影響不大,故不能有效減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生;非特異性條帶增加的原因可能是復(fù)性溫度過(guò)低,造成引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)增加,故可通過(guò)提高復(fù)性的溫度來(lái)減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生。11.BPCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水在使用前都必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理,移液器不需要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理12.(1)①PE塑料選擇②菌體繁殖力不同,形成的菌落大小不同YP1和YT1混合培養(yǎng)過(guò)程中,YP1菌株整合了YT1的對(duì)PE塑料高分解力的基因,發(fā)生了轉(zhuǎn)化(2)①b3②XmaⅠ和BglⅡ含有改良基因A的重組質(zhì)粒不含有完整的LacZ基因,受體菌不能分泌分解Xgal而使培養(yǎng)基變藍(lán)的酶解析:(1)①在篩選分解PE塑料能力大小的菌株時(shí),應(yīng)將兩類菌株接種到以PE塑料為唯一碳源的培養(yǎng)基,不能分解PE塑料的細(xì)菌,因?yàn)槿鄙贍I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)碳源死亡;該培養(yǎng)基可以篩選出能分解PE塑料類的細(xì)菌,所以從功能上講屬于選擇培養(yǎng)基。②篩選分解PE塑料能力強(qiáng)的菌株不能直接以降解圈的大小為指標(biāo),因?yàn)榫w繁殖力不同,形成的菌落大小不同,故應(yīng)該看菌落直徑和降解圈直徑的比值來(lái)判斷菌株對(duì)PE塑料的分解能力。原本YP1對(duì)PE塑料的分解能力弱于YT1,而培養(yǎng)基3中接種混合培養(yǎng)后的YP1,其降解圈直徑明顯加大,其原因可能是YP1菌株整合了YT1的對(duì)PE塑料高分解力的基因,發(fā)