化學(xué)品鳥(niǎo)類(lèi)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由全國(guó)危險(xiǎn)化學(xué)品管理標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC251)提出并歸口。本文件起草單位：生態(tài)環(huán)境部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、上海市檢測(cè)中心、中國(guó)化工經(jīng)濟(jì)技術(shù)發(fā)展中心、廈門(mén)尹巢科技有限公司、國(guó)化低碳技術(shù)工程中心、生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所、沈陽(yáng)化工研究院有限公司、貴州省分析測(cè)試研究院、廣東全慶檢測(cè)有限公司。林紹霞。Ⅱ本文件主要描述了用于評(píng)價(jià)化學(xué)品對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)急性經(jīng)口毒性的三種試驗(yàn)方法：限度劑量試驗(yàn)、LD??-斜率試驗(yàn)、LD?o-單一試驗(yàn)。其中LD?-斜率試驗(yàn)和LD?o-單一試驗(yàn)是序貫進(jìn)行的試驗(yàn)。根據(jù)是否同時(shí)需要精準(zhǔn)的經(jīng)口半數(shù)致死量(LD?o)和劑量-反應(yīng)曲線的斜率數(shù)據(jù)來(lái)選擇具體的試驗(yàn)方法。序貫試驗(yàn)程序的目的在于劑量的設(shè)計(jì)、試驗(yàn)需求與毒性終點(diǎn)精確度的統(tǒng)一性。序貫試驗(yàn)程序能盡量減少受試?guó)B的數(shù)量。名為SequentialDesignCalculator(SEDEC)的計(jì)算機(jī)軟件可用于幫助設(shè)計(jì)劑量并計(jì)算LD。、劑量反應(yīng)曲線斜率以及置信區(qū)間(見(jiàn)9.2)。這些方法是由1994年在美國(guó)佛羅里達(dá)彭薩科拉舉行的鳥(niǎo)類(lèi)毒性試驗(yàn)研討會(huì)發(fā)起，由SETAC/OECD1)鳥(niǎo)類(lèi)毒性試驗(yàn)工作組起草，隨后通過(guò)歐洲和美國(guó)的SETAC公開(kāi)會(huì)議和OECD專(zhuān)家組關(guān)門(mén)會(huì)議討論后，對(duì)序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行修改和完善。該序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)程序已通過(guò)廣泛的統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證。這三種試驗(yàn)方法的適用條件如下。——限度劑量試驗(yàn)：當(dāng)預(yù)測(cè)受試物的毒性低，且在限度劑量條件下受試?guó)B不可能發(fā)生死亡時(shí)，進(jìn)行該試驗(yàn)。限度劑量與評(píng)估目的對(duì)應(yīng)，通常設(shè)定為2000mg/kg。除對(duì)照組外，限度劑量下用5只或10只受試?guó)B進(jìn)行試驗(yàn)(見(jiàn)圖1)?！狶D?-斜率試驗(yàn)：當(dāng)管理部門(mén)或其他要求測(cè)劑量-反應(yīng)曲線斜率，和/或估計(jì)LD?。數(shù)據(jù)及置信區(qū)間時(shí)，選用此方法。除對(duì)照組外，階段3或階段4分別需要24只或34只受試?guó)B進(jìn)行試驗(yàn)(見(jiàn)圖2)。若計(jì)算斜率，可通過(guò)經(jīng)典的劑量-效應(yīng)試驗(yàn)(USEPAOPPTS850.2100)進(jìn)行替代計(jì)算?！狶D??-單一試驗(yàn)：當(dāng)只需要經(jīng)口半數(shù)致死量數(shù)據(jù)，而不需要?jiǎng)┝?反應(yīng)曲線斜率或LDso置信區(qū)間時(shí)，可選用此方法?？捎糜诠烙?jì)LD?物種敏感性分布的百分?jǐn)?shù)并為產(chǎn)品標(biāo)簽提供信息。該試驗(yàn)包括兩個(gè)階段，除了對(duì)照組外，用14只受試?guó)B來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)(見(jiàn)圖2)。LD??-斜率試驗(yàn)和LD??-單一試驗(yàn)由多個(gè)序貫執(zhí)行的試驗(yàn)階段組成(圖2)。本文件中的“序貫設(shè)計(jì)和序貫試驗(yàn)”是指LD?o-斜率試驗(yàn)和LD??-單一試驗(yàn)。相關(guān)的設(shè)計(jì)邏輯以及統(tǒng)計(jì)原理見(jiàn)附錄A。設(shè)計(jì)LD??-斜率試驗(yàn)得到的參數(shù)可用于計(jì)算機(jī)模擬試驗(yàn)，達(dá)到危害性評(píng)估的目的。這些參數(shù)包括LD??值、置信區(qū)間和劑量-反應(yīng)曲線斜率。在LD??-斜率試驗(yàn)或LD??-單一試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各個(gè)階段中，按照預(yù)測(cè)的受試物劑量，對(duì)1只或多只受試?guó)B一次性經(jīng)口染毒，劑量單位為“mg/kg”。這些劑量可用于估算LD??。染毒后觀察期14d,但主要依據(jù)染毒后三天受試?guó)B死亡率及毒性癥狀來(lái)選擇試驗(yàn)劑量，若出現(xiàn)受試?guó)B死亡或癥狀恢復(fù)較快，可縮短序貫試驗(yàn)(LD?-斜率試驗(yàn)或LDs?-單一試驗(yàn))最初可用從失敗的限度劑量試驗(yàn)(出現(xiàn)一只或多只受試?guó)B死亡)或其他方式獲取的信息開(kāi)始。對(duì)于預(yù)測(cè)可能具有高毒性的受試物，試驗(yàn)可從階段1開(kāi)始，每組4只受試?guó)B，分別按不同劑量染毒。選擇的劑量宜涵蓋估計(jì)的LDs區(qū)間范圍(例如以嚙齒類(lèi)動(dòng)物或其他鳥(niǎo)種的LD數(shù)據(jù)為依據(jù))。根據(jù)階段1的結(jié)果估算LD?。階段2使用極大似然估計(jì)法(MLE)確定劑量，共10個(gè)劑量，每個(gè)劑量1只受試?guó)B。若可從失敗的限度劑量試驗(yàn)中估算LD?,序貫試驗(yàn)也可從階段2開(kāi)始，對(duì)于LD??-斜率試驗(yàn)可連續(xù)進(jìn)行到階段3,也可能到階段4(停止試驗(yàn)的規(guī)則見(jiàn)~1)SETAC:國(guó)際環(huán)境毒理學(xué)與環(huán)境化學(xué)學(xué)會(huì)(SocietyofEnvironmentalToxicologyandChemistry)OECD:經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment)1化學(xué)品鳥(niǎo)類(lèi)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)警示——使用本文件的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)。本文件并未指出所有可能的安全問(wèn)題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國(guó)家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。本文件規(guī)定了鳥(niǎo)類(lèi)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的受試物信息、試驗(yàn)原理、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)程序、質(zhì)量保證與質(zhì)本文件適用于評(píng)價(jià)低揮發(fā)性、具備足夠準(zhǔn)確度與靈敏度分析方法的化學(xué)物質(zhì)對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)的急性經(jīng)口毒性。本文件不適用于高揮發(fā)性的化學(xué)物質(zhì)的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T21801化學(xué)品快速生物降解性呼吸計(jì)量法試驗(yàn)GB/T21802化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的MITI試驗(yàn)(I)GB/T21803化學(xué)品快速生物降解性DOC消減試驗(yàn)GB/T21810化學(xué)品鳥(niǎo)類(lèi)日糧毒性試驗(yàn)GB/T21811化學(xué)品鳥(niǎo)類(lèi)繁殖試驗(yàn)GB/T21831化學(xué)品快速生物降解性密閉瓶法試驗(yàn)GB/T21845化學(xué)品水溶解度試驗(yàn)GB/T21852化學(xué)品分配系數(shù)(正辛醇-水)高效液相色譜法試驗(yàn)GB/T21853化學(xué)品分配系數(shù)(正辛醇-水)搖瓶法試驗(yàn)GB/T21855化學(xué)品與pH有關(guān)的水解作用試驗(yàn)GB/T21856化學(xué)品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗(yàn)GB/T21857化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的OECD篩選試驗(yàn)GB/T22052用液體蒸氣壓力計(jì)測(cè)定液體的蒸氣壓力溫度關(guān)系和初始分解溫度的方法GB/T22228工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-'Pa至10?Pa范圍內(nèi)的測(cè)定靜態(tài)法GB/T22229工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-3Pa至1Pa范圍內(nèi)的測(cè)定蒸氣壓平衡法GB/T27850化學(xué)品快速生物降解性通則OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.104蒸氣壓(VapourPressure)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。2一次性經(jīng)口攝入或在24h內(nèi)多次攝入受試物后發(fā)生的不良反應(yīng)。攝入受試物的總量。注：表示為受試物的質(zhì)量(g、mg)或受試物的質(zhì)量/單位體重試驗(yàn)動(dòng)物(mg/kg,其中bwt為試驗(yàn)動(dòng)物體重)。經(jīng)口半數(shù)致死量medianlethaloraldoseLD??由統(tǒng)計(jì)學(xué)得出的一次性經(jīng)口攝入受試物后導(dǎo)致50%受試動(dòng)物死亡的劑量。注：LD值用攝入受試物的質(zhì)量/單位體重試驗(yàn)動(dòng)物(mg/kg)來(lái)表示。限度試驗(yàn)中上限的劑量。在試驗(yàn)中對(duì)多只受試?guó)B同時(shí)進(jìn)行染毒和觀察的時(shí)期。注：由前一個(gè)試驗(yàn)階段估算的LDo和斜率可能影響當(dāng)前階段的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。同樣，由現(xiàn)階段試驗(yàn)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)也可能影響下一個(gè)階段試驗(yàn)的設(shè)計(jì)。在某個(gè)試驗(yàn)階段所用劑量的最低數(shù)值(mg/kg)。在某個(gè)試驗(yàn)階段所用劑量的最高數(shù)值(mg/kg)。公比step用于計(jì)算各個(gè)劑量的倍增因子。當(dāng)對(duì)多只受試?guó)B用相同劑量受試物染毒時(shí)，出現(xiàn)一部分鳥(niǎo)死亡，另一部分存活的現(xiàn)象。注：部分死亡有時(shí)也稱作部分反應(yīng)。當(dāng)沒(méi)有設(shè)置平行組的單個(gè)受試?guó)B在接受不同劑量的受試物時(shí)，出現(xiàn)相鄰的低劑量組死亡而高劑量組存活的現(xiàn)象。注：即某劑量受試?guó)B的致死率高于下一個(gè)更高劑量的致死率。這時(shí)的劑量值可能接近LD?值。例如：“0”代表受試?guó)B存活，“1”代表死亡和有反應(yīng)的受試?guó)B，按照劑量遞增的順序進(jìn)行排列，排列順序?yàn)椤?001011111”和“000110111”都表示有一個(gè)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)，排列順序?yàn)椤?001010111”和“00011010011”都表示有兩個(gè)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)。進(jìn)一步示例見(jiàn)附錄B。與受試?guó)B群體健康狀況無(wú)關(guān)的死亡，和由自殘行為(如損傷腿或擦傷等)產(chǎn)生的死亡。34受試物信息4.1在試驗(yàn)前，應(yīng)掌握受試物的下列必備信息：a)按照GB/T21845的方法測(cè)定的水中溶解度；b)按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229和OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.104的方法測(cè)定的蒸氣壓和亨利常數(shù)。4.2可能需要受試物的下列信息：a)結(jié)構(gòu)式；b)純度；c)受試物在水溶液中的定量分析方法；d)按照GB/T21855的方法測(cè)定的水解作用數(shù)據(jù)；e)光穩(wěn)定性；f)按照GB/T21852或GB/T21853的方法測(cè)定的正辛醇-水分配系數(shù)；g)按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T21856、GB/T21857和GB/T27850的方法測(cè)定的快速生物降解性試驗(yàn)結(jié)果。4.3測(cè)定4.1和4.2中參數(shù)的溫度，應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中予以說(shuō)明。5試驗(yàn)原理試驗(yàn)由幾個(gè)獨(dú)立階段組成。每個(gè)階段，將受試物按設(shè)計(jì)劑量(mg/kg)以填喂的方式對(duì)所有受試?guó)B同時(shí)染毒。根據(jù)各階段的設(shè)計(jì)，每只鳥(niǎo)可能攝入不同劑量或多只鳥(niǎo)可能攝入相同劑量(即在此階段設(shè)置了該劑量的平行組)。對(duì)于不太可能出現(xiàn)明顯危害的受試物，宜按限度劑量試驗(yàn)方法同時(shí)對(duì)多只鳥(niǎo)染毒。若毒性可預(yù)知，宜采用序貫設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法而不用限度劑量試驗(yàn)方法。階段1和階段2不設(shè)平行劑量，而階段3和階段4應(yīng)設(shè)平行劑量。在階段1中，根據(jù)最有效的LD?估算值(例如嚙齒動(dòng)物的LD??)來(lái)設(shè)定劑量的范圍。后續(xù)試驗(yàn)階段的劑量依據(jù)前面所有階段觀察到的死亡數(shù)來(lái)確定。因此，LD。和劑量-反應(yīng)曲線斜率的估算同時(shí)進(jìn)行。染毒后，觀察14d來(lái)計(jì)算死亡率。在這期間若出現(xiàn)延遲效應(yīng)現(xiàn)象則應(yīng)延長(zhǎng)觀察期。對(duì)于染毒后幾天內(nèi)出現(xiàn)受試?guó)B死亡的化學(xué)品，采用分階段試驗(yàn)設(shè)計(jì)最容易進(jìn)行。對(duì)于這類(lèi)化學(xué)品不需等到14d觀察期結(jié)束，即可開(kāi)始下個(gè)階段的試驗(yàn)，但應(yīng)繼續(xù)觀察所有受試?guó)B。較短間隔后觀察到的死亡率可用于確定后續(xù)試驗(yàn)階段的劑量(通常是3d)。受試?guó)B如有明顯的痛苦跡象，應(yīng)實(shí)施安樂(lè)死。在某個(gè)試驗(yàn)階段，染毒后前三天通?？傻玫接糜谂袛嗍茉?guó)B能否從中毒癥狀中恢復(fù)、死亡率能否增加的足夠信息。對(duì)于某個(gè)試驗(yàn)階段，通過(guò)對(duì)第3天的試驗(yàn)期間數(shù)據(jù)的估算，可在較短時(shí)間內(nèi)完成整個(gè)試驗(yàn)的全部劑量設(shè)計(jì)。若第3天的信息表明，在這個(gè)階段中可能還有受試?guó)B死亡，則LD??的試驗(yàn)期間估算應(yīng)延遲到幸存的受試?guó)B中毒癥狀有明顯恢復(fù)。有些情況下可能需要等到14d后才能進(jìn)行下個(gè)階段試驗(yàn)。根據(jù)從全部試驗(yàn)階段積累的14d結(jié)果來(lái)進(jìn)行最終計(jì)算。死亡率是本試驗(yàn)方法首要的毒性終點(diǎn)。假設(shè)背景死亡率可忽略不計(jì)。應(yīng)設(shè)置對(duì)照組來(lái)監(jiān)控受試?guó)B的健康及飼養(yǎng)情況，保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。對(duì)照組受試?guó)B的使用程序和時(shí)間在7.3中討論。試驗(yàn)期間，受試?guó)B如有明顯的痛苦跡象，應(yīng)實(shí)施安樂(lè)死。6試驗(yàn)方法6.1儀器設(shè)備本試驗(yàn)可采用GB/T21810和GB/T21811中的儀器設(shè)備。46.2.1受試?guó)B的選擇首選人工繁育的背景死亡率低且反芻習(xí)性低的鳥(niǎo)類(lèi)物種作為受試?guó)B。通常符合這些要求的物種有宜捕捉野生鳥(niǎo)類(lèi)用于試驗(yàn)。如選其他鳥(niǎo)類(lèi)，應(yīng)增加該物種的敏感性試驗(yàn)。除鵪鶉外，可用(但不限于)綠頭野鴨(Anasplaty-undulatus)等作受試?guó)B。所用受試?guó)B應(yīng)是羽翼成熟，不在繁殖期內(nèi)。首選野生表型，人工馴化的鳥(niǎo)應(yīng)來(lái)源于相同的繁育種群。為了保持基因的多態(tài)性所進(jìn)行的異系繁殖歷史宜明確。若不能用野生表型的鳥(niǎo)，則應(yīng)從不同表型的混合體中選擇，以限制近親繁殖。從非繁殖期的混合性別組或單一性別組中選擇受試?guó)B，隨機(jī)分配到各試驗(yàn)組中。使用非繁殖期受試?guó)B有助于降低由性別不同引起的敏感性差異。不同性別的鳥(niǎo)對(duì)某些化學(xué)品的敏感性可能不同。各種化學(xué)品對(duì)不同性別鳥(niǎo)的毒性差異可能不同。若懷疑由性別不同引起敏感性差異，則應(yīng)按不同性別分別進(jìn)行試驗(yàn)并分別計(jì)算LD?。6.2.2馴養(yǎng)條件和試驗(yàn)條件本文件的試驗(yàn)方法是在試驗(yàn)的早期階段每個(gè)濃度設(shè)置一只受試?guó)B。如果發(fā)生嘔吐現(xiàn)象，應(yīng)至少在試驗(yàn)最初的3d內(nèi)安置每只受試?guó)B單獨(dú)棲息。這樣能夠單獨(dú)觀察和詳細(xì)記錄每一只受試?guó)B的行為細(xì)節(jié)(包括嘔吐)。對(duì)于如斑胸草雀這樣的群居鳥(niǎo)類(lèi)，應(yīng)將鳥(niǎo)籠靠近排列，使各鳥(niǎo)之間有視覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)上的互動(dòng)。對(duì)其他鳥(niǎo)種宜如此操作。幾種受試?guó)B單獨(dú)棲息的最小面積為：鴿3333cm2、綠頭野鴨2000cm2、鵪鶉1000cm2、虎皮鸚鵡500cm2和斑胸草雀500cm2。鳥(niǎo)籠底部應(yīng)有適當(dāng)大小的網(wǎng)眼，既能使糞便通過(guò)，又不影響鳥(niǎo)的活動(dòng)。鴿、虎皮鸚鵡和斑胸草雀的籠中應(yīng)有棲木。可通過(guò)人工控制溫濕度和光照來(lái)保持試驗(yàn)條件。鵪鶉和綠頭野鴨適宜的溫度為15℃~27℃,在試驗(yàn)階段應(yīng)減少溫度的波動(dòng)。應(yīng)通風(fēng)良好，保證空氣至少每小時(shí)交換10次，鵪鶉和綠頭野鴨的光照周期應(yīng)是8h/16h(光照/黑暗)。對(duì)于其他鳥(niǎo)種，應(yīng)將光照增加到10h。試驗(yàn)期間提供新鮮飼料和水，保證鳥(niǎo)類(lèi)自由采食和飲水。應(yīng)確保飼料的營(yíng)養(yǎng)成分符合受試?guó)B生長(zhǎng)要求，可使用市售商業(yè)化飼料和維生素。在染毒之前14d、染毒期間以及觀察期內(nèi)避免進(jìn)行藥物治療。同時(shí)應(yīng)定期分析飼料和水質(zhì)，檢查可能影響鳥(niǎo)類(lèi)健康雜質(zhì)的含量。6.2.3受試?guó)B的準(zhǔn)備每只鳥(niǎo)應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行鑒定。人工繁育的受試?guó)B在試驗(yàn)開(kāi)始前至少需要14d適應(yīng)試驗(yàn)條件和飼料。捕獲的野生鳥(niǎo)需要更長(zhǎng)的適應(yīng)期。在適應(yīng)期內(nèi)，所有的鳥(niǎo)都應(yīng)保持健康，籠養(yǎng)受試?guó)B如果死亡超過(guò)5%或野生受試?guó)B死亡超過(guò)10%則不能用于試驗(yàn)。若捕獲的野生鳥(niǎo)不能適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境條件，應(yīng)在捕捉地附近放生。考慮到動(dòng)物福利及周齡差異、基因組成和健康情況等不可控因素，不宜使用捕獲的野生鳥(niǎo)類(lèi)。野生鳥(niǎo)類(lèi)在被捕捉、運(yùn)輸和關(guān)養(yǎng)期間會(huì)受到精神壓力，進(jìn)而可能導(dǎo)致更高的死亡率。對(duì)于人工繁育的受試?guó)B盡可能選擇同一周齡。將受試物灌入膠囊或溶解、懸浮在合適的介質(zhì)中，通過(guò)填喂法染毒。通常情況下對(duì)于可溶或可懸浮的受試物，首選使用水溶液或水懸液，其次考慮使用食用油溶液或乳狀液(如：玉米油),最后考慮其他介5質(zhì)。使用非水介質(zhì)前應(yīng)了解該介質(zhì)的毒性信息，且不應(yīng)造成嘔吐。根據(jù)染毒前24h內(nèi)所測(cè)體重來(lái)確定每只鳥(niǎo)的染毒劑量。受試物染毒的方式是單一劑量經(jīng)口灌胃染毒法。染毒用藥體積與鳥(niǎo)的體重保持一定的比例，且每千克體重不應(yīng)超過(guò)10mL。受試?guó)B在染毒的前一晚應(yīng)禁食12h～15h。像北美鵪鶉和日本鵪鶉這類(lèi)體重較大的鳥(niǎo)宜整夜禁食。對(duì)體重較小的鳥(niǎo)，整夜禁食可能有害；對(duì)于體重50g左右或小于50g的鳥(niǎo)，禁食不超過(guò)2h。嘔吐影響毒性評(píng)估結(jié)果，應(yīng)記錄嘔吐現(xiàn)象。宜用與糞便顏色明顯不同的無(wú)毒染色飼料(例如，食用色素亮藍(lán)1號(hào)，雙4-N-乙基-N-3-磺酸苯甲基氨基苯基-2-磺酸甲苯基二鈉鹽，CAS號(hào)57-55-6),來(lái)識(shí)別是否嘔吐。嘔吐是鳥(niǎo)類(lèi)急性經(jīng)口試驗(yàn)的一個(gè)特點(diǎn)，可能與染毒技術(shù)或受試物性質(zhì)有關(guān)。減少染毒體積或改變載體會(huì)降低嘔吐的頻率。尤其是選用雀形目受試?guó)B時(shí)，宜先進(jìn)行摸索劑量范圍的預(yù)試驗(yàn)來(lái)評(píng)估它們的嘔吐習(xí)性?？赏ㄟ^(guò)減少染毒體積、使用膠囊或更換載體來(lái)消除或降低嘔吐頻率。如果仍然存在嘔吐現(xiàn)象，考慮更換另一種受試?guó)B。若沒(méi)有不嘔吐的受試?guó)B種可用，則不可能精確計(jì)算出LD??。唯一可能得出的結(jié)論是受試物的LD??大于引發(fā)嘔吐和死亡的最低劑量。染毒后2h內(nèi)應(yīng)持續(xù)觀察鳥(niǎo)的嘔吐情況和臨床癥狀，當(dāng)天光照期間至少等間隔額外觀察三次臨床癥狀，此后14d內(nèi)每天至少觀察一次。然而，觀察期的時(shí)間跨度不應(yīng)很快固定。觀察應(yīng)持續(xù)到不再有臨床癥狀和死亡發(fā)生為止。若某個(gè)試驗(yàn)階段觀察期延長(zhǎng)，則隨后的所有試驗(yàn)階段應(yīng)相應(yīng)延長(zhǎng)。明顯不是受試物導(dǎo)致的死亡(如物理?yè)p傷)應(yīng)在計(jì)算過(guò)程中排除。若對(duì)照組中有偶然死亡發(fā)生，則需要增加對(duì)照組的受試?guó)B(見(jiàn)7.3)。應(yīng)在染毒前和染毒后第3天、第7天和第14天(或依據(jù)試驗(yàn)持續(xù)的情況推遲)測(cè)鳥(niǎo)的體重變化。在染毒后3d內(nèi)、3d～7d和7d～14d,每天測(cè)量食物消耗量。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)全部受試?guó)B，包括對(duì)照組和試驗(yàn)組中存活的鳥(niǎo)進(jìn)行病理分析，有助于識(shí)別偶然死亡和各種中毒癥狀。若無(wú)死亡和明顯臨床癥狀記試驗(yàn)期間，若受試?guó)B有明顯的痛苦癥狀，應(yīng)實(shí)施安樂(lè)死。7試驗(yàn)程序7.1限度劑量試驗(yàn)限度劑量試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括按限度劑量同時(shí)染毒的試驗(yàn)組5只受試?guó)B和虛擬染毒的對(duì)照組受試?guó)B。對(duì)照組受試?guó)B的染毒程序和時(shí)間在7.3中討論。染毒后觀察14d。觀察到受試?guó)B死亡后，按圖1中描述的程序操作。為避免受試?guó)B因毒性效應(yīng)而蒙受痛苦所進(jìn)行的安樂(lè)死與觀察試驗(yàn)處理組的死亡率同樣重要。65只鳥(niǎo)，按限度劑量給藥5只鳥(niǎo)，按限度劑量給藥結(jié)果；0只死亡結(jié)果：1只死亡結(jié)果：2只～4只死亡結(jié)果；5只死亡是存活的鳥(niǎo)是否出現(xiàn)毒性癥狀否限度劑量給藥是進(jìn)行序貫設(shè)計(jì)的階段1進(jìn)行序貫設(shè)計(jì)的階段2死亡率=1/10?否注：不包括對(duì)照組的鳥(niǎo)。圖1限度劑量試驗(yàn)的程序如果染毒后14d內(nèi)沒(méi)有受試?guó)B死亡，可推斷在95%的置信水平下LD?大于限度劑量，試驗(yàn)結(jié)束。失敗的限度劑量試驗(yàn)不能得出這個(gè)結(jié)論，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行序貫設(shè)計(jì)的階段1或階段2。若觀察到試驗(yàn)組中有1只受試?guó)B死亡，沒(méi)有觀察到其他受試?guó)B出現(xiàn)中毒癥狀，可再增加5只受試?guó)B，按該限度劑量染毒?；蚋鶕?jù)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人和委托方的判斷進(jìn)行序貫設(shè)計(jì)的階段2。新增劑量可在14d的觀察期結(jié)束前開(kāi)始染毒。若上述限度劑量試驗(yàn)期限延長(zhǎng)，只有1只受試?guó)B死亡，且總數(shù)10只受試?guó)B中，沒(méi)有觀察到其余的鳥(niǎo)出現(xiàn)中毒癥狀，可推斷在95%的置信水平下，LD?大于限度劑量，毒性試驗(yàn)若在5只受試?guó)B的試驗(yàn)組里出現(xiàn)1只死亡且其余4只有中毒癥狀，或有2只～4只死亡，或在10只受試?guó)B的試驗(yàn)組中出現(xiàn)2只或2只以上死亡，按以下要求和圖2中所描述的序貫設(shè)計(jì)，從階段2開(kāi)始若試驗(yàn)組的受試?guó)B全部死亡(包括安樂(lè)死),則使用圖2中的序貫設(shè)計(jì)，開(kāi)始階段1試驗(yàn)。增加的劑量組可在14d的觀察期結(jié)束之前開(kāi)始。從限度劑量試驗(yàn)到序貫設(shè)計(jì)的階段2試驗(yàn)，需要一個(gè)試驗(yàn)期間LD??的估算值來(lái)確定階段2的染毒劑量?？墒褂帽?(限度劑量為2000mg/kg)中的LD??劑量的計(jì)算方法。附錄C中描述了在一個(gè)失敗的限度劑量試驗(yàn)中在任意限度劑量下計(jì)算試驗(yàn)期間LD??估算值的方法。注：在某些情況下，如果染毒劑量不大于限度劑量就無(wú)法獲得LD。。由于使用高劑量受試物的染毒條件有很多限制，不是總能獲得低毒受試物的LD?o。7基于現(xiàn)有信息評(píng)估LDso(例如其他試驗(yàn)或限度劑量試驗(yàn)的結(jié)果)階段14個(gè)劑量，每個(gè)劑量1只鳥(niǎo)后終止試驗(yàn)并計(jì)算LD。階段210個(gè)劑量；每個(gè)劑量1只鳥(niǎo)(依據(jù)限度劑量試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)可從階段2開(kāi)始)依據(jù)階段1+階段2的結(jié)果，計(jì)算試驗(yàn)期間LDg和斜率2個(gè)劑量，每個(gè)劑量5只鳥(niǎo)如果沒(méi)有或只出現(xiàn)1個(gè)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)，依據(jù)階段1+階段2的結(jié)果，計(jì)算試驗(yàn)期問(wèn)LDgo階段3b5個(gè)劑量，每個(gè)劑量2只鳥(niǎo)如果出現(xiàn)2個(gè)或更多個(gè)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)，或山現(xiàn)2個(gè)或更多個(gè)部分死亡如果出現(xiàn)0或1個(gè)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)，且出現(xiàn)0或1階段4注：LD??-斜率試驗(yàn)和LD?o-單一試驗(yàn)，不包括對(duì)照組的鳥(niǎo)。圖2序貫設(shè)計(jì)試驗(yàn)的程序表1由2000mg/kg的限度劑量試驗(yàn)死亡率得出序貫設(shè)計(jì)階段2試驗(yàn)中使用的LD?的試驗(yàn)期間估算值LD?o/(mg/kg)7.2LD??-斜率試驗(yàn)和LDso-單一試驗(yàn)本節(jié)(7.2)詳細(xì)說(shuō)明了序貫試驗(yàn)每個(gè)階段的劑量設(shè)計(jì)。圖2給出了序貫設(shè)計(jì)中鳥(niǎo)類(lèi)染毒詳細(xì)流程。圖3列出了4個(gè)階段的取樣時(shí)間，各階段觀察期均為14d。對(duì)照組的試驗(yàn)程序和時(shí)間在7.3中討論。8階段1受試?guó)B的觀察階段2受試?guó)B的觀察階段3b受試?guó)B的觀察d036階段4受試?guó)B的觀察第6天-一應(yīng)用階段1、階段2的有效數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)階段3b的試驗(yàn)劑量第3天-一應(yīng)用階段1的有效數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)階段2的試驗(yàn)劑量圖3觀察期為14d的4個(gè)階段(階段1、階段2、階段3b和階段4)序貫設(shè)計(jì)的取樣時(shí)間可根據(jù)已知受試物毒性信息(如對(duì)哺乳動(dòng)物毒性的試驗(yàn)數(shù)據(jù))或同類(lèi)化學(xué)品中結(jié)構(gòu)相似化合物的相關(guān)信息來(lái)估算最初的LD?值。對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)階段，應(yīng)重新計(jì)算最低劑量、最高劑量和公比，以便確定該階段的劑量序列。極大似然估計(jì)法(MLE)是計(jì)算模型參數(shù)值的程序。對(duì)于本試驗(yàn)方法，確定的參數(shù)是斜率和概率模型的截距，用于計(jì)算LD??。極大似然估計(jì)法(MLE)的運(yùn)用條件是至少有2個(gè)部分死亡或2個(gè)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)。如果條件符合，序貫設(shè)計(jì)可根據(jù)試驗(yàn)階段1、階段2(若至少有2個(gè)效應(yīng)逆轉(zhuǎn))及更高階段(若至少有2個(gè)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)或至少2個(gè)部分死亡)的毒性反應(yīng)來(lái)使用極大似然估計(jì)法(MLE)計(jì)算LD??和斜率。確定效應(yīng)逆轉(zhuǎn)和部分死亡對(duì)正確進(jìn)行隨后幾個(gè)階段的試驗(yàn)至關(guān)重要。效應(yīng)逆轉(zhuǎn)和部分死亡作為是否進(jìn)行下個(gè)階段試驗(yàn)或停止(完成)試驗(yàn)的判據(jù)。宜先統(tǒng)計(jì)部分死亡的個(gè)數(shù)，如果有必要再計(jì)算效應(yīng)逆轉(zhuǎn)個(gè)數(shù)。附錄B中給出有部分死亡和效應(yīng)逆轉(zhuǎn)的假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果的例子。7.2.2序貫設(shè)計(jì)詳述序貫設(shè)計(jì)各階段計(jì)算公式中的變量、代號(hào)～和圖1、圖2中描述了停止試驗(yàn)的規(guī)定，對(duì)序貫設(shè)計(jì)的描述見(jiàn)附錄A。序貫涉及各階段計(jì)算公式中的變量、代號(hào)如下：dose?！?jiǎng)┝?,當(dāng)最低試驗(yàn)劑量出現(xiàn)死亡時(shí)，試驗(yàn)期間LD?的計(jì)算中增加劑量0;dose?——?jiǎng)┝?,第1個(gè)劑量；dose?——?jiǎng)┝?,第2個(gè)劑量；doseg——?jiǎng)┝?,第3個(gè)劑量；9dose?——?jiǎng)┝?,第4個(gè)劑量；doses——?jiǎng)┝?,第5個(gè)劑量；doseio——?jiǎng)┝?0,第10個(gè)劑量；dose;——?jiǎng)┝浚?第i個(gè)劑量；hdose——最高劑量；ldose——最低劑量；LDoie—-LD的最初估算值；LD?o—-試驗(yàn)期間LD?;slope.——試驗(yàn)期間斜率；step——公比。階段1——在LDs?最初估算值附近按對(duì)數(shù)值等比設(shè)4個(gè)染毒劑量階段1中最低劑量、最高劑量和公比的計(jì)算如下。a)使用下面的公式計(jì)算試驗(yàn)處理組的低劑量和高劑量，其中LD?的最初估算值是根據(jù)嚙齒類(lèi)動(dòng)物或其他物種毒性試驗(yàn)的LD?得出，也可從表1中失敗的限度劑量試驗(yàn)中得出(附錄C中包括限度劑量不是2000mg/kg時(shí)LD??的計(jì)算): hdose=dose?=7.071×LDsoi.e b)若hdose>3330mg/kg,則設(shè)定hdose=3330mg/kg(若受鳥(niǎo)體自身?xiàng)l件的限制，可低于此值),且重新計(jì)算ldose:ldose=hdose/50………(3)c)計(jì)算公比：step=501/3=3.679……(4)d)計(jì)算劑量2和劑量3: f)觀察受試?guó)B一段時(shí)間(通常是3d),記錄死亡或存活情況。計(jì)算“試驗(yàn)期間LD?估算值”(見(jiàn)表2)。這個(gè)試驗(yàn)期間LD?估算值將用于設(shè)計(jì)階段2的染毒劑量。g)繼續(xù)觀察11d(總共14d)。h)若第3天的信息表明這個(gè)階段還可能有更多鳥(niǎo)死亡，可推遲計(jì)算試驗(yàn)期間LD?估算值，直到剩余受試?guó)B明顯恢復(fù)。有些情況下，需要等14d后再進(jìn)行下個(gè)階段的試驗(yàn)。如果前期計(jì)算試驗(yàn)期間LD??的觀察期延長(zhǎng)，則所有后續(xù)階段都要延遲。若14d后有延遲效應(yīng)現(xiàn)象，則試驗(yàn)階段可進(jìn)一步延長(zhǎng)。表2通過(guò)階段1的4個(gè)劑量計(jì)算試驗(yàn)期間LD?0b從階段1數(shù)據(jù)得到的試驗(yàn)期間LDs?OOOOOOOXOOXOOXOOGB/T41623—2022表2通過(guò)階段1的4個(gè)劑量計(jì)算試驗(yàn)期間LDsob(續(xù))dose?從階段1數(shù)據(jù)得到的試驗(yàn)期間LD?oXO)OOOXXOXXOXXOOOXOXXOXOXOOXOXXXXOXXXXOXXXXOXXXX用“O”表示存活，用“X”表示死亡。雖然在試驗(yàn)中只用了4個(gè)劑量[劑量1～劑量4(dose?~dose?)],但在表中提到了劑量0～劑量5(doseo~doses)。這些數(shù)值用于實(shí)際試驗(yàn)劑量的上一步或下一步的劑量。即：doseo=dose?/step,doses=dose?×step。當(dāng)最低試驗(yàn)劑量出現(xiàn)死亡時(shí)，試驗(yàn)期間LD??的計(jì)算應(yīng)增加劑量0;最高試驗(yàn)劑量出現(xiàn)存活時(shí)，增加劑量5。階段2——在階段1或有部分死亡的限度劑量試驗(yàn)中得出試驗(yàn)期間LD?估算值附近設(shè)10個(gè)等比對(duì)數(shù)染毒劑量階段2中最低劑量、最高劑量和公比的計(jì)算如下。a)使用下面的公式計(jì)算試驗(yàn)處理組的低劑量和高劑量，其中試驗(yàn)期間LD估算值是依據(jù)階段1的試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)表1中失敗的限度劑量試驗(yàn)值(附錄C包含的限度劑量不是用2000mg/kg時(shí)的LD?估算),或是綜合依據(jù)限度劑量試驗(yàn)和階段1的結(jié)果：ldose=dose?=0.3425×LDs?* hdose=doseio=2.919×LDso (8)b)若hdose>3330mg/kg體重，則設(shè)置hdose=3330mg/kg(若受鳥(niǎo)體自身?xiàng)l件限制，可低于此值),并且重新計(jì)算最低劑量：ldose=hdose/8.5………(9)c)計(jì)算公比：step=(hdose/ldose)1/s…(10)d)計(jì)算中間的8個(gè)劑量：dose;=ldose×step+D,i=2～9……(11)e)10只鳥(niǎo)，每只鳥(niǎo)一個(gè)計(jì)算劑量。f)若進(jìn)行LDs?-單一試驗(yàn)，觀察14d。采用概率積分轉(zhuǎn)換模型從階段1、階段2和限度劑量試驗(yàn)(如果可以獲得)得出的最終數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算LD?。g)如進(jìn)行LD??-斜率試驗(yàn)，觀察一段時(shí)間(通常3d,若前面的階段觀察期較長(zhǎng)或出現(xiàn)延遲死亡則延長(zhǎng)觀察時(shí)間),記錄每只鳥(niǎo)的死亡、存活情況。計(jì)算效應(yīng)逆轉(zhuǎn)數(shù)量(下個(gè)高劑量組的死亡率要比當(dāng)前劑量組低，見(jiàn)附錄B的舉例),綜合限度劑量試驗(yàn)(若可得)、階段1和階段2死亡率數(shù)據(jù)，使用概率積分轉(zhuǎn)換模型得到試驗(yàn)期間LD?的估算值，如可能，計(jì)算出斜率。若觀察到2個(gè)或更多劑量的效應(yīng)逆轉(zhuǎn)，則進(jìn)行階段3a,否則進(jìn)行階段3b。h)再持續(xù)觀察11d(總共14d)。i)若第3天的信息表明這個(gè)階段還可能出現(xiàn)死亡，則推遲試驗(yàn)期間LD估算值的計(jì)算，直到其他被觀察的受試?guó)B明顯恢復(fù)。在有些情況下，需要等14d后再進(jìn)行下個(gè)階段。如果先前計(jì)算試驗(yàn)期間LD??的觀察期延長(zhǎng)，隨后所有階段都要延遲。若14d后仍有延遲效應(yīng)的現(xiàn)象，該試驗(yàn)階段可進(jìn)一步延長(zhǎng)。階段3a——(綜合限度劑量試驗(yàn)、階段1和階段2的數(shù)據(jù)，有2個(gè)以上效應(yīng)逆轉(zhuǎn))在從限度劑量試驗(yàn)(若可得)、階段1和階段2試驗(yàn)中得出試驗(yàn)期間LD?估算值的附近設(shè)置2個(gè)等對(duì)數(shù)間隔染毒劑量階段3a中最低劑量、最高劑量和公比的計(jì)算如下。a)若上述的試驗(yàn)期間斜率估計(jì)值大于15或小于1,則分別設(shè)置為15或1,重新計(jì)算最低劑量和最高劑量。若無(wú)法計(jì)算出試驗(yàn)期間斜率，則試驗(yàn)期間斜率設(shè)置為5,重新計(jì)算最低劑量和最高劑量。b)使用下列公式計(jì)算試驗(yàn)組低劑量和高劑量，其中試驗(yàn)期間LD?和試驗(yàn)期間斜率是依據(jù)當(dāng)前全部有效數(shù)據(jù)(限度劑量試驗(yàn)、階段1和/或階段2)得出的結(jié)果： (12) c)若hdose>3330mg/kg,則設(shè)置hdose=3330mg/kg(若受鳥(niǎo)體自身?xiàng)l件限制，可低于此值),并且重新計(jì)算最低劑量： d)按最低劑量和最高劑量分別對(duì)5只受試?guó)B染毒，總共10只受試?guó)B染毒。e)觀察14d,記錄每只鳥(niǎo)的死亡或存活情況。綜合限度劑量試驗(yàn)(若可得)、階段1、階段2和階段3a的死亡數(shù)據(jù)，使用概率積分轉(zhuǎn)換模型來(lái)獲得LD?和斜率的最終計(jì)算結(jié)果。試驗(yàn)到此結(jié)束。f)若概率積分轉(zhuǎn)換模型不合適，在報(bào)告中記錄，發(fā)生50%死亡率區(qū)域兩側(cè)劑量的幾何平均值作為L(zhǎng)D?的值。也可用其他插值法和移動(dòng)平均數(shù)法來(lái)計(jì)算LD500階段3b——(綜合限度劑量試驗(yàn)、階段1和階段2的數(shù)據(jù)，效應(yīng)逆轉(zhuǎn)少于2個(gè))在從限度劑量試驗(yàn)(若可得)、階段1和階段2中得到的試驗(yàn)期間LDs?估算值的附近設(shè)置5個(gè)等對(duì)數(shù)間隔染毒劑量階段3b中最低劑量、最高劑量和公比的計(jì)算如下。a)使用下列公式計(jì)算試驗(yàn)組低劑量和高劑量，其中試驗(yàn)期間LD??是依據(jù)當(dāng)前全部有效數(shù)據(jù)(限度劑量試驗(yàn)、階段1和/或階段2)得出的結(jié)果： (16)b)若hdose>3330mg/kg,則設(shè)置hdose=3330mg/kg(若受鳥(niǎo)體自身?xiàng)l件限制，可低于此值),并且重新計(jì)算最低劑量：ldose=hdose/2.6……(17)c)計(jì)算公比： (18)d)計(jì)算中間的3個(gè)劑量： e)5個(gè)劑量，每個(gè)劑量2只受試?guó)B，總共10只受試?guó)B。f)觀察一段時(shí)間(通常是3d,若前面的階段觀察期較長(zhǎng)或出現(xiàn)延遲死亡則延長(zhǎng)),記錄每只鳥(niǎo)的死亡或存活。綜合限度劑量試驗(yàn)(若可得)、階段1、階段2和階段3b的死亡數(shù)據(jù)，使用概率積分轉(zhuǎn)換模型來(lái)獲得試驗(yàn)期間LD??和試驗(yàn)期間斜率的估算值。g)如果觀察到至少有2個(gè)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)或至少2個(gè)部分死亡，并且已獲得試驗(yàn)期間斜率估算值，則不需要進(jìn)行階段4試驗(yàn)。繼續(xù)觀察直到第14天試驗(yàn)結(jié)束，綜合限度劑量試驗(yàn)(若可得)、階段1、階段2和階段3b的數(shù)據(jù)，使用概率積分轉(zhuǎn)換模型來(lái)獲得LD?。和斜率的最終計(jì)算結(jié)果。試驗(yàn)到此結(jié)束。h)若不滿足g)中描述的條件，則進(jìn)行階段4試驗(yàn)。i)再繼續(xù)觀察11d(總共14d)。j)若第3天的信息顯示這個(gè)階段可能還會(huì)出現(xiàn)死亡，則要推遲試驗(yàn)期間LD?的估算，直到其他有中毒癥狀的鳥(niǎo)明顯恢復(fù)。在某些情況下，需要等14d再進(jìn)行下個(gè)階段，若此階段計(jì)算試驗(yàn)期間LD之前的觀察期延長(zhǎng)，則隨后所有階段都延長(zhǎng)。若14d后有延遲效應(yīng)的跡象，這個(gè)階段可進(jìn)一步延長(zhǎng)。階段4——在從限度劑量試驗(yàn)(若可得)、階段1、階段2和階段3b中得到的試驗(yàn)期間LD??估算值的附近設(shè)置5個(gè)等對(duì)數(shù)間隔染毒劑量階段4中最低劑量、最高劑量和公比的計(jì)算如下。a)使用下列公式計(jì)算處理組低劑量和高劑量，其中試驗(yàn)期間LD是依據(jù)當(dāng)前全部有效數(shù)據(jù)(限度劑量試驗(yàn)、階段1、階段2和/或階段3b)得出的結(jié)果： hdose=doses=1.6113×LD??v (21)b)若hdose>3330mg/kg,則設(shè)置hdose=3330mg/kg(若受鳥(niǎo)體自身?xiàng)l件限制，可低于此值),并且重新計(jì)算最低劑量：c)計(jì)算公比：step=(hdose/ldose)1/4 (23)d)計(jì)算中間的3個(gè)劑量： f)觀察14d,記錄鳥(niǎo)的死亡、存活情況。綜合限度劑量試驗(yàn)(若可得)、階段1、階段2、階段3b和階段4的數(shù)據(jù)，使用概率積分轉(zhuǎn)換模型來(lái)獲得LDs和斜率的最終計(jì)算結(jié)果。試驗(yàn)到此結(jié)束。g)若階段4結(jié)束時(shí)不能得出極大似然估計(jì)，應(yīng)在報(bào)告中記錄，發(fā)生50%死亡率區(qū)域兩側(cè)劑量的幾何平均值作為L(zhǎng)D??值。也可用其他插值法和移動(dòng)平均法來(lái)計(jì)算LD??。7.3對(duì)照組對(duì)照組包括5只來(lái)自同批孵化、未經(jīng)染毒處理的受試?guó)B。采用與試驗(yàn)組相同的載體(或膠囊)虛擬染毒(不含受試物),保持所有操作條件與試驗(yàn)組相同。對(duì)照組受試?guó)B在染毒前，以及染毒后的第3天、第7天和第14天測(cè)體重。在試驗(yàn)組第1次染毒，即限度劑量試驗(yàn)(若有)和/或序貫試驗(yàn)開(kāi)始的階段(階段1或階段2),同時(shí)給對(duì)照組虛擬染毒。試驗(yàn)中若出現(xiàn)以下情況，對(duì)照組中應(yīng)再增加5只鳥(niǎo)：a)一個(gè)新的試驗(yàn)階段開(kāi)始時(shí)，如新增受試?guó)B與最初的受試?guó)B不是同一批孵化的，應(yīng)在新階段的試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，用與新增受試?guó)B同批次孵化的鳥(niǎo)設(shè)置對(duì)照組；b)若不同試驗(yàn)階段的染毒體積不同，按相應(yīng)體積給對(duì)照組虛擬染毒。此類(lèi)情況往往發(fā)生在最高劑量增加時(shí)，需要更大的體積來(lái)得到合適的溶液/懸浮液；c)在LD??-斜率試驗(yàn)里，如果各階段開(kāi)始的間隔時(shí)間較長(zhǎng)或有變化(例如從3d變?yōu)?0d),則應(yīng)在序貫試驗(yàn)中間的試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(在階段2或階段3開(kāi)始時(shí))給對(duì)照組受試?guó)B虛擬染毒。根據(jù)最初對(duì)照組的情況，可能需要增加對(duì)照組受試?guó)B數(shù)量(見(jiàn)第8章)。為此應(yīng)馴養(yǎng)備用的受試?guó)B。8質(zhì)量保證與質(zhì)量控制試驗(yàn)過(guò)程中，若出現(xiàn)一只受試?guó)B非偶然死亡或由其他原因死亡的受試?guó)B超過(guò)一只，則試驗(yàn)無(wú)效。若最初對(duì)照組(5只)中有一只偶然死亡，對(duì)照組應(yīng)再增加5只受試?guó)B，即在試驗(yàn)中對(duì)照組受試?guó)B總數(shù)為9數(shù)據(jù)與報(bào)告9.1數(shù)據(jù)用表格記錄并報(bào)告每只鳥(niǎo)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，包括染毒劑量、使用受試?guó)B數(shù)量、中毒癥狀、死亡數(shù)量以及人道方式處死的數(shù)量、每只鳥(niǎo)的死亡時(shí)間、發(fā)生中毒癥狀的起止時(shí)間，體重(在染毒前和染毒后第3天、第7天、第14天測(cè)；若由延遲死亡導(dǎo)致觀察期大于14d,則在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)再測(cè)),飼料消耗和病理學(xué)檢查結(jié)果。9.2LD??、斜率和置信區(qū)間的計(jì)算序貫試驗(yàn)LD?的計(jì)算方法與其他類(lèi)型的劑量反應(yīng)試驗(yàn)相同。基于假設(shè)序貫設(shè)計(jì)的劑量反應(yīng)曲線接近概率積分轉(zhuǎn)換模型，可用概率回歸模型(用劑量的對(duì)數(shù)作自變量)來(lái)計(jì)算LD??。在概率積分轉(zhuǎn)換模型中，lg(LD??)的極大似然估計(jì)為一a/b,其中a是截距，b是斜率。當(dāng)試驗(yàn)中所有階段的死亡數(shù)據(jù)都已匯總準(zhǔn)備分析時(shí)，若發(fā)現(xiàn)概率積分轉(zhuǎn)換模型不能充分?jǐn)M合數(shù)據(jù)，也可選用其他適合的模型。用標(biāo)準(zhǔn)的極大似然估計(jì)法擬合數(shù)據(jù)模型的條件是：觀察到有2個(gè)劑量出現(xiàn)部分死亡或出現(xiàn)2個(gè)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)時(shí)才能適用。這些條件(除特殊情況外)大都在序貫設(shè)計(jì)中存在。若不能得出極大似然估計(jì)，則要在報(bào)告中說(shuō)明，此時(shí)LD?的值為發(fā)生50%死亡率區(qū)域兩邊劑量的幾何平均值，也可使用其他插值法和移動(dòng)平均數(shù)法來(lái)計(jì)算LD?o。使用Fieller定理、似然比法或二項(xiàng)式法可得出LD置信區(qū)間。許多其他標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)程序也可用于計(jì)算LD??與其置信區(qū)間(例如SASR、LogXactR)。僅在LD?o-斜率試驗(yàn)中報(bào)告斜率及LD的置信區(qū)間。對(duì)于每個(gè)劑量-反應(yīng)試驗(yàn)，報(bào)告中應(yīng)有回歸模型擬合優(yōu)度的指標(biāo)(例如Pearson擬合優(yōu)度、似然比卡方Chi-square)描述。對(duì)于LDs?單一試驗(yàn)，可選擇是否報(bào)告擬合優(yōu)度量。注：從LD?o-單一試驗(yàn)的結(jié)果中經(jīng)常能計(jì)算出斜率和LD的置信區(qū)間。但是由于在試驗(yàn)中所用鳥(niǎo)的數(shù)量少且劑量試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容?！?hào)；——純度；——室溫下的穩(wěn)定性；——揮發(fā)性。b)試驗(yàn)方法和試驗(yàn)系統(tǒng)：——試驗(yàn)類(lèi)型；——試驗(yàn)方法的描述。c)試驗(yàn)操作：——試驗(yàn)分組和設(shè)計(jì)(試驗(yàn)處理組及平行、對(duì)照組的數(shù)量、個(gè)體或籠舍分組);——馴養(yǎng)條件和分組的過(guò)程(持續(xù)時(shí)間，隨機(jī));——染毒方法(經(jīng)口灌胃染毒/膠囊、載體/溶劑、體積/按鳥(niǎo)體重的百分比);——統(tǒng)計(jì)方法的描述。d)試驗(yàn)結(jié)果：——死亡(死亡時(shí)間、中毒癥狀);——LD?、斜率和置信區(qū)間的計(jì)算(若適用);——中毒癥狀的開(kāi)始和終止時(shí)間(精確到分鐘);——病理檢查；——個(gè)體的體重?cái)?shù)據(jù)；——食物消耗數(shù)據(jù)。GB/T41623—2022(資料性)序貫設(shè)計(jì)的總則、原理與統(tǒng)計(jì)基礎(chǔ)耐受性分布理論是對(duì)于受試物的某個(gè)特定劑量值，受試?guó)B個(gè)體如果攝入的劑量高于該值則死亡，如果攝入的劑量低于或等于該值則存活。這個(gè)特定劑量值稱作耐受值。假設(shè)耐受值對(duì)于每只鳥(niǎo)是固定的，但對(duì)于不同的鳥(niǎo)類(lèi)不同。因此可用耐受性分布表征化學(xué)品對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)種群的毒性影響。選用合適的統(tǒng)計(jì)模型可評(píng)估鳥(niǎo)類(lèi)樣本的耐受性分布。首先，假設(shè)耐受值符合以下呈正態(tài)分布的概率積分轉(zhuǎn)換模型：p——受試?guó)B個(gè)體耐受值低于劑量d的概率，即鳥(niǎo)類(lèi)攝入劑量d后的存活概率；g概率(p)和lg(d)之間相關(guān)直線的截距；β——概率(p)和lg(d)之間相關(guān)直線的斜率；用概率模型擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到α和β兩個(gè)參數(shù)的估測(cè)值，即參數(shù)a和b。受試?guó)B類(lèi)種群耐受性分布平均值(LD??)及耐受性分布方差的計(jì)算，可從下列公式得出：V=1/b…………(A.3)式中：lg(LD??)—-受試?guó)B類(lèi)種群耐受性分布平均值；a——截距(用概率模型擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到的參數(shù));b——斜率(用概率模型擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到的參數(shù));V——方差。如果能估算出耐受值分布(即：已估算出α和β值),則其分布的百分率也能計(jì)算出來(lái)(劑量水平與特定值p相關(guān))。Chapman,P.F.等人推薦了基于不同試驗(yàn)結(jié)果的LD?、斜率和置信區(qū)間計(jì)算的方法。如果至少兩個(gè)劑量組出現(xiàn)部分死亡和(或)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)，即可進(jìn)行斜率估算。整個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括幾個(gè)階段，每個(gè)階段多只受試?guó)B同時(shí)染毒并觀察一段時(shí)間。這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是在試驗(yàn)早期階段獲得的試驗(yàn)期間LD?和劑量反應(yīng)曲線斜率估值，有助于進(jìn)行下個(gè)試驗(yàn)階段的設(shè)計(jì)，尤其是設(shè)置染毒劑量?？傮w上，對(duì)于一個(gè)完整的試驗(yàn)，應(yīng)視具體情況確定進(jìn)行幾個(gè)階段的試驗(yàn)、每個(gè)階段設(shè)幾個(gè)劑量和每個(gè)劑量用幾只受試?guó)B等。雖然不同試驗(yàn)階段染毒劑量數(shù)及每個(gè)劑量使用鳥(niǎo)的數(shù)量可不同，但本文件通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬方法建立某些特定的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并規(guī)定試驗(yàn)第一階段使用4只受試?guó)B，后續(xù)的階段用10只。假設(shè)在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)對(duì)LD的初始估算是有效的。在實(shí)際操作中，可基于已知理化性質(zhì)、相似活性成分的毒性或用其他鳥(niǎo)種及哺乳動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果來(lái)估測(cè)LD??值。也可從限度劑量試驗(yàn)中獲得初始估算值。序貫設(shè)計(jì)中，前三個(gè)試驗(yàn)階段彼此間明顯不同。第一個(gè)階段是“范圍確定”,主要確定和調(diào)整最初的LD?估算。第二個(gè)階段是更加精確的定位LD?o。第三個(gè)及后續(xù)階段是確定LD?的置信區(qū)間和劑量反應(yīng)曲線的斜率或進(jìn)一步減少LD。估算的不確定性。由于不同試驗(yàn)階段的染毒方式相互交錯(cuò)，相應(yīng)的試驗(yàn)期間LD和斜率的評(píng)估要進(jìn)行多次重復(fù)計(jì)算。在每次重復(fù)計(jì)算中，受試?guó)B部分死亡的組數(shù)或死亡效應(yīng)逆轉(zhuǎn)數(shù)量都可能不同。有可能在試驗(yàn)開(kāi)始后第3天、第6天和第9天獲得試驗(yàn)期間估算結(jié)果，但每個(gè)階段的觀察時(shí)間應(yīng)持續(xù)到14d。在試驗(yàn)結(jié)論中，LD??和斜率(若可能，包括置信區(qū)間)的最終評(píng)估結(jié)論應(yīng)結(jié)合(所有階段)14d試驗(yàn)結(jié)果得出。試驗(yàn)的階段1,在LD??的最初預(yù)測(cè)值范圍內(nèi)，按照相同的等對(duì)數(shù)間隔設(shè)置4個(gè)劑量。在計(jì)算機(jī)模擬中發(fā)現(xiàn)4個(gè)劑量按照從高到低順序，以較大比率設(shè)計(jì)足以計(jì)算試驗(yàn)期間LD,同時(shí)為進(jìn)行斜率評(píng)估的后續(xù)階段保留受試?guó)B。在估算試驗(yàn)期間LD時(shí)，按照轉(zhuǎn)換劑量的幾何平均數(shù)計(jì)算，有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：首先，能在有較少信息量的情況下進(jìn)行合理的估算；其次，能在最低劑量出現(xiàn)死亡或最高劑量有存活的條件下進(jìn)行試驗(yàn)期間LD?估算。試驗(yàn)的階段2,目的是精準(zhǔn)估算LD?并得到斜率的初步估計(jì)值。在這個(gè)階段要得出LD。最終值來(lái)進(jìn)行LD??-單一試驗(yàn)和LD?-斜率試驗(yàn)的一個(gè)試驗(yàn)期間估計(jì)。在這些試驗(yàn)中，最低和最高劑量應(yīng)出現(xiàn)1%和99%的死亡率。當(dāng)假設(shè)5個(gè)斜率呈正態(tài)分布時(shí)，耐受性的平均值就是LD??值，標(biāo)準(zhǔn)偏差等于斜率的倒數(shù)(1/斜率)。根據(jù)美國(guó)環(huán)境保護(hù)局ECOTOX數(shù)據(jù)庫(kù)(/Ecotox/index.cfm)要求提交有關(guān)殺蟲(chóng)劑試驗(yàn)的歷史記錄表明