DB32/TXXXX—2020I脫毒矮化自根砧蘋果苗木繁育技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了采穗圃營建、矮化砧木的選擇、砧木苗培育、嫁接及定植、嫁接苗管理、嫁接苗出圃等矮化自根砧蘋果苗木繁育技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于脫毒蘋果矮化自根砧苗木的繁育。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB8370蘋果苗木產(chǎn)地檢疫規(guī)程GB9847蘋果苗木GB/T12943—2007蘋果無病毒母本樹和苗木檢疫規(guī)程N(yùn)Y/T1085—2006蘋果苗木繁育技術(shù)規(guī)程3采穗圃營建按NY/T1085—2006規(guī)定執(zhí)行。4矮化砧木的選擇矮化砧木可以選擇M9T337、M9、B9等。5脫毒砧木苗及蘋果品種苗獲取見附錄A。6砧木苗培育6.1砧木組培苗移栽經(jīng)過病毒檢測的脫毒組培苗進(jìn)行煉苗并移栽到營養(yǎng)缽中，然后在設(shè)施大棚內(nèi)馴化培育到30cm高，根頸部位粗在0.5cm左右。按株距30cm、行距150cm，把以上馴化苗木移栽到田間培育。6.2第一年管理6.2.1水肥管理生長季根據(jù)天氣情況灌水，保持土壤相對含水量75%左右。施肥2～3次（最后一次時間為壓條后），每次施肥量為復(fù)合肥20kg/畝～30kg/畝，根據(jù)長勢追加適量尿素，同時補(bǔ)充葉面肥(頂綠螯合鐵6000倍+優(yōu)聰素700倍)。6.2.2除草雜草高于5cm時，應(yīng)進(jìn)行人工除草。期間可以適當(dāng)增加短截促進(jìn)分枝的處理，以保證后面壓條的枝條數(shù)量。6.2.3病蟲害防治按NY/T1085—2006規(guī)定執(zhí)行。6.2.4壓條6.2.4.1時間10月中下旬（新梢停長后）。6.2.4.2方法6.2.4.2.1修剪 壓條前剪去梢部不充實(shí)部分，同時剪去長勢弱、生長方向與壓條方向相反的側(cè)枝（剪到離側(cè)枝的基部3cm～5cm處）。6.2.4.2.2開溝沿砧木行兩側(cè)開寬50cm左右（寬度須足夠容納全部壓條）、深約10cm的淺溝。6.2.4.2.3壓條采用順行編織，輔以竹簽別枝的辦法將所有大枝錯落壓實(shí)，必須將全部枝條平臥在淺溝底部。6.2.4.2.4覆土壓條后用細(xì)土將裸露在外的枝條覆蓋。6.3第二年管理6.3.1水肥管理在苗木高度10cm～15cm和覆鋸末之前分兩次進(jìn)行追肥，每次施復(fù)合肥20kg/畝～30kg/畝。覆完鋸末以后，適時灌水，自根砧壓條繁殖，水分是生根的關(guān)鍵，始終保持土壤相對含水量75%左右。6.3.2覆鋸末6.3.2.1第一次覆腐熟鋸末子砧苗高度30cm左右時開始第一次覆鋸末，厚度5cm～10cm。6.3.2.2第二次覆腐熟鋸末子砧苗高度40cm～45cm時開始第二次覆鋸末，厚度5cm～10cm。以后多次覆蓋，直至鋸末厚度達(dá)到50cm。6.3.2.3覆土每次覆鋸末后，持續(xù)灌水，待鋸末濕度達(dá)到手握成團(tuán)時開始覆土，覆土高度3cm～5cm。6.3出圃秋季落葉后即可出圃，可采用機(jī)械出苗，按GB9847分級并貯藏。7嫁接及定植7.1接穗準(zhǔn)備落葉后剪取脫毒優(yōu)良蘋果品種芽體飽滿的一年生中庸枝條為接穗，沙藏或保濕冷藏。7.2嫁接時期和方法嫁接時期為春季，方法為枝接。采用坐地嫁接或室內(nèi)嫁接；砧木粗度要求0.8cm～1.0cm。7.3嫁接苗定植將嫁接好的苗木栽植到苗圃中，栽植密度為株距30cm、行距80cm。8嫁接苗管理8.1成活率檢查嫁接后10天檢查成活率，及時補(bǔ)接。8.2嫁接苗修剪秋季落葉后嫁接苗剪除分枝，第二年當(dāng)植株長至120cm時定干，同時連續(xù)施用整枝靈2次，間隔1周，促進(jìn)分枝，并立支架綁縛。第一次整枝靈畝用12ml，兌水20kg噴霧，第二次畝用13ml，兌水20kg～25kg噴霧，要噴在枝條的嫩尖和頂芽上。8.3肥水管理同6.1.1。8.4病蟲害防治同6.1.3。9嫁接苗出圃嫁接苗在苗圃中生長2年，當(dāng)苗木分枝達(dá)到5個以上，嫁接口上10cm處苗木直徑達(dá)到1.5cm以上可以出圃。按GB8370進(jìn)行蘋果苗木產(chǎn)地檢疫，檢疫合格可以出圃。10記錄對生產(chǎn)全過程進(jìn)行記錄，生產(chǎn)檔案保存2年。附錄A（規(guī)范性附錄）脫毒蘋果砧木苗及蘋果品種苗的獲得A.1蘋果品種和砧木初代組培苗獲得A.1.1培養(yǎng)基的配制采用1/2MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為：1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+1g/LPVP+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂。A.1.2植物材料準(zhǔn)備和滅菌接種剪取幼苗頂部1cm～2cm（含生長點(diǎn)）莖段作為外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)。用75%酒精處理45s，然后再用10%過氧化氫消毒20min后接種。A.2組培苗繼代增殖擴(kuò)繁繼代增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH=5.8。A.3蘋果莖尖超低溫脫毒處理A.3.1莖尖預(yù)培養(yǎng)取組培苗約2mm左右的莖尖，接種于MS+6.0g/L瓊脂粉+0.75mol/L蔗糖的培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)3d。A.3.2裝載取預(yù)培養(yǎng)過的莖尖，放入裝載溶液中，裝載溶液為MS+2mol/L甘油+0.75mol/L蔗糖，pH=5.8。處理溫度為25℃，處理時間為60min。A.3.3超低溫處理將裝載過的莖尖轉(zhuǎn)移到pH5.8的PVS-2溶液中，處理溫度為0℃，處理時間為2h。然后轉(zhuǎn)入10mL凍存管中，直接投入液氮中處理1h。PVS-2溶液為：MS+30%(W/V)甘油+15%(W/V)聚乙二醇+15%(W/V)DMSO(二甲基亞砜)+0.4mol/L蔗糖。A.3.4解凍從液氮中取出凍存管，快速轉(zhuǎn)移到40℃的水浴鍋中，處理2min。然后取出莖尖放入MS+1.2mol/L的蔗糖溶液中20min，直到莖尖漂浮在液體表面。A.3.5莖尖再生培養(yǎng)將處理過的莖尖轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1周后進(jìn)行光照培養(yǎng)。一個月后將再生株系進(jìn)行繼代擴(kuò)繁，增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂，pH5.8。A.4再生植株的病毒檢測按GB/T12943—2007進(jìn)行蘋果無病毒母本樹和苗木檢測，根據(jù)GenBank登錄的ACLSV、ASGV、ASPV、APMV、ASSVD等5種病毒外殼蛋白序列設(shè)計引物，結(jié)合蘋果內(nèi)參基因TUB特異性片段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，從而檢測再生植株是否含有病毒。A.5擴(kuò)繁、煉苗和移栽經(jīng)過病毒檢測的無病毒組培苗進(jìn)行擴(kuò)繁、煉苗和移栽。A.6脫毒原種的保存脫毒原種的保存的方式有田間原種保存圃保存和室內(nèi)組培保存。A.6.1田間原種保存圃保存無病毒原種樹定植于有防蟲保護(hù)網(wǎng)設(shè)備的網(wǎng)室