背景介紹近年來隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，器官移植、骨髓移植、重癥感染的患者逐年增多，發(fā)生侵襲性真菌感染和抗菌藥物的耐藥率迅速上升，唑類抗真菌藥物成為臨床應(yīng)用最廣泛的抗菌藥物之一。但一些抗真菌藥物在個體內(nèi)和個體間存在較大的個體變異，在治療過程中患者體內(nèi)的藥物濃度可能會“因人而異”，因此對其進行血藥濃度監(jiān)測具有臨床意義。本文闡述了一種能夠同時檢測多種抗真菌藥物的方法，能夠幫助臨床準確定量患者體內(nèi)的抗真菌藥物濃度，避免出現(xiàn)用藥不足或用藥過量而導(dǎo)致的副反應(yīng)。文章亮點01.建立了一種LC-MS/MS法檢測人血清中5種抗真菌藥物及2種代謝產(chǎn)物的血藥濃度的方法；02.對該方法進行了性能驗證，該方法準確度好，精密度高，基質(zhì)效應(yīng)小；03.研究了一種能夠使多種抗真菌藥物穩(wěn)定的基質(zhì)配方，病毒和微生物感染風(fēng)險小，為實現(xiàn)臨床檢測提供基礎(chǔ)。內(nèi)容介紹1實驗部分1.1

主要儀器與試劑1.2

樣品前處理1.3

分析方法1.4

溶液的配制標(biāo)準儲備液的配制：準確稱取適量VRC、VNO、PCZ、ICZ、HICZ、FCZ、CPF標(biāo)準品，用甲醇分別溶解并配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準儲備液。分別移取不同體積的儲備液于同一容量瓶中，配制成混合標(biāo)準溶液。儲備液于-80℃冰箱中保存，混合標(biāo)準溶液于-20℃冰箱中保存。1.5

定量方法采用空白基質(zhì)加標(biāo)做曲線，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，樣本與基質(zhì)匹配標(biāo)準品、質(zhì)控物樣本一同處理后進樣，用儀器自帶軟件繪制標(biāo)準曲線并定量。2結(jié)果與討論2.1

樣品前處理方法的建立通過對血液樣本進行蛋白沉淀后，并對上清液進行稀釋。稀釋后能夠減少樣品中雜質(zhì)成分進入檢測器對分析物產(chǎn)生干擾，同時減少基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生，但稀釋液的種類影響目標(biāo)分析物的穩(wěn)定性。2.2

液相方法的建立為了改善分離度和峰形，本方法通過改變流動相的pH來改善。采用5mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸的水溶液為流動相A，0.1%的甲酸乙腈溶液為流動相B，添加乙酸銨是為了增加響應(yīng)較低的伊曲康唑和羥基伊曲康唑的靈敏度；選擇添加甲酸，是為了改善卡泊芬凈的色譜峰形，在A相和B相中同時添加同濃度的甲酸，是為了保證在A相和B相任意比例混合時，始終保證體系在相同的酸堿度下進行分離，色譜分析更穩(wěn)定。圖2中a為流動相中未加酸的卡泊芬凈的色譜峰，b為流動相中添加甲酸后的卡泊芬凈的色譜峰，由圖可知，添加甲酸可改善卡泊芬凈的峰形。2.3

基質(zhì)匹配標(biāo)準品和質(zhì)控物基質(zhì)的考察由于基質(zhì)的添加，標(biāo)準品和質(zhì)控物的穩(wěn)定性存在一定問題，圖4為不加任何穩(wěn)定劑的兩種濃度的標(biāo)準品加速結(jié)果，伏立康唑氮氧化物、伊曲康唑等響應(yīng)降低。2.4

相對基質(zhì)效應(yīng)考察基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在進行離子化時，因相互競爭而導(dǎo)致目標(biāo)化合物信號強度有不同程度增強或減弱的現(xiàn)象。標(biāo)準曲線和分析物的基質(zhì)不同時，應(yīng)該進行基質(zhì)效應(yīng)評估。因此，評估基質(zhì)效應(yīng)是LC-MS方法驗證的關(guān)鍵組成部分[18]。采用混合實驗的方法，對本方法的相對基質(zhì)效應(yīng)進行評估。2.5

線性考察通過向空白人血清中添加一定濃度的混合標(biāo)準溶液制成低值樣本S1和高值樣本S7，將S1和S7按不同比例混合配制成線性樣本S2~S6。每個濃度點按照1.2方法重復(fù)測定3次，分別得出每個濃度點測定結(jié)果的均值，以稀釋濃度為自變量，以測定結(jié)果均值為因變量求出多項式回歸方程，計算相關(guān)系數(shù)R2。2.6

準確度考察通過向已知濃度人血清樣本中添加混合標(biāo)準溶液，測定加標(biāo)回收率，來評估方法的準確度。2.7

精密度考察通過向空白人血清樣本中添加混合標(biāo)準溶液，配制成低、中、高3個濃度的精密度樣本，每個濃度制備5個平行樣，按照1.2方法測定，考察批內(nèi)精密度，上述樣本重復(fù)制作并測定3d，考察批間精密度。結(jié)果表明，本方法有良好的精密度。3結(jié)論本文建立了一種能夠同時檢測人血清中5種抗真菌藥物及其代謝產(chǎn)物的HPLC-MS/MS方法，方法簡便，以同位素為內(nèi)標(biāo)，準確度高，基質(zhì)匹配標(biāo)