3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1DNA復(fù)制概述3.2原核生物的DNA復(fù)制3.3真核生物的DNA復(fù)制3.4DNA修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立為DNA自我復(fù)制機(jī)制做了初步解釋?zhuān)磯A基互補(bǔ)——兩條鏈互補(bǔ)，堿基配對(duì)——模板式復(fù)制。DNA復(fù)制機(jī)理的復(fù)雜性D.S.DNA→S.S.DNA能量的供求構(gòu)型的變化：超螺旋→線狀、開(kāi)環(huán)狀多種酶類(lèi)的互作→

Replisome3DNA的復(fù)制與修復(fù)復(fù)制的準(zhǔn)確性（修復(fù)，校正）DNA復(fù)制速度（E.coli105bp/min，高速解旋112km/h?）DNA復(fù)制模式不統(tǒng)一（dsDNA、sDNA、LinearDNA….）DNA復(fù)制起始控制機(jī)理3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1DNA復(fù)制概述3.1.1DNA復(fù)制研究選材3.1.2DNA復(fù)制的半保留性3.1.3DNA復(fù)制過(guò)程的順序性3.1.4DNA的半不連續(xù)復(fù)制3.1.5復(fù)制子3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1DNA復(fù)制概述為了保證遺傳的穩(wěn)定性，在每次細(xì)胞分裂之前，遺傳信息載體必須精確地復(fù)制自己。遺傳信息的載體是DNA，但許多病毒的遺傳信息載體是RNA而不是DNA。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1.1DNA復(fù)制研究選材原核細(xì)胞是研究DNA復(fù)制的最佳的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)①細(xì)胞小，生活周期短，易在人工條件下培養(yǎng)，原核生物易獲得各種突變體。原核生物中的大腸桿菌是在各方面研究最深入的一種。3DNA的復(fù)制與修復(fù)②噬菌體（phage）是研究復(fù)制機(jī)制的一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)：基因組小，易操作；DNA分子有線形、環(huán)形、單鏈和雙鏈形式，可代表不同類(lèi)型DNA的復(fù)制。如：線型，θ式，D型等復(fù)制。已研究過(guò)的典型噬菌體系統(tǒng)：Phageφx174、T4等。3DNA的復(fù)制與修復(fù)Watson和Crick發(fā)表了DNA雙螺旋模型之后又發(fā)表了DNA半保留復(fù)制（semiconservativereplicationmodel）模型，這一建立在堿基互補(bǔ)基礎(chǔ)上的機(jī)制，為DNA的轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、和分子雜交等奠定了基礎(chǔ)。3.1.2DNA復(fù)制的半保留性3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNA復(fù)制（replication）是在親代雙鏈DNA分子的每一條鏈上按堿基互補(bǔ)配對(duì)而準(zhǔn)確地合成一條新的互補(bǔ)鏈，結(jié)果生成兩個(gè)與親代鏈相同的DNA雙鏈的過(guò)程。3DNA的復(fù)制與修復(fù)在半保留復(fù)制模型提出之前，普遍認(rèn)為“蛋白質(zhì)和核酸是彼此互補(bǔ)的，DNA自我復(fù)制過(guò)程是通過(guò)核酸和蛋白質(zhì)的交替合成”。但Watson和Crick認(rèn)為DNA自我復(fù)制時(shí)親本鏈保持不變，但雙鏈分開(kāi)，每個(gè)親本鏈作為復(fù)制的模板，子代雙鏈含有一條親本鏈和一條新合成的鏈。這就是DNA復(fù)制的半保留模型。3DNA的復(fù)制與修復(fù)當(dāng)時(shí)人們對(duì)半保留模型是持懷疑態(tài)度的，因雙螺旋模型中存在最大的問(wèn)題是雙鏈?zhǔn)侨绾未蜷_(kāi)的？其所需的能量從何而來(lái)？Watson和Crick也承認(rèn)這是“最大的問(wèn)題”。人們?yōu)榱吮荛_(kāi)打開(kāi)雙鏈這個(gè)難題，又提出了全保留復(fù)制(conservativereplicationmodel)和分散(dispersivemodel)兩個(gè)模型。3DNA的復(fù)制與修復(fù)在全保留模型中兩條母鏈彼此結(jié)合，恢復(fù)原狀，新合成的兩條子鏈彼此互補(bǔ)結(jié)合形成一條新的雙鏈。在分散模型中親代雙鏈被切成雙鏈片段，而這些片段又可作為新合成雙鏈片段的模板，新、老雙鏈片段又以某種方式聚集成“雜種鏈”。后來(lái)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中半保留模型是正確的。3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNA復(fù)制的3種假說(shuō)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1.2.1半保留復(fù)制在DNA的半保留復(fù)制過(guò)程中復(fù)制區(qū)域雙螺旋解旋并分開(kāi)，以每條單鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，由DNA聚合酶催化合成新的互補(bǔ)鏈，結(jié)果由一條鏈成為互補(bǔ)的兩條鏈，這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與原來(lái)的DNA分子的堿基序列完全相同。由于每個(gè)子代DNA的一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復(fù)制方式稱(chēng)為半保留復(fù)制(semiconservationreplication)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1.2.2半保留復(fù)制的證據(jù)①M(fèi)eselson和Stahl的實(shí)驗(yàn)他們的同位素標(biāo)記和密度梯度離心實(shí)驗(yàn)支持了半保留復(fù)制方式。PhotographtakenbyF.L.HolmesofMattMeselsonandFrankStahlin1996,standingatthesitewheretheymetatWoodsHole42yearsearlier.CourtesyoftheHolmesfamily.3DNA的復(fù)制與修復(fù)1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N標(biāo)記DNA，而不用放射性同位素32P和14C。15N會(huì)導(dǎo)致DNA分子密度顯著增加，這樣可通過(guò)密度梯度離心將親本鏈和子代鏈區(qū)分開(kāi)來(lái)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)將大腸桿菌放在15NH4C1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)15代，使DNA被15N標(biāo)記后，再將細(xì)菌移到只含有14NH4C1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別取0代、1代、2代、3代的細(xì)胞，提取DNA，進(jìn)行密度梯度離心，分辨重鏈DNA、正常的輕鏈DNA和包含一條重鏈和一條輕鏈的DNA“雜種鏈”。3DNA的復(fù)制與修復(fù)離心后從管底到管口DNA分子就停留在與其相當(dāng)?shù)腃sC1密度處，紫外光下可以看到形成的區(qū)帶。14N-DNA密度較輕，停留在離管口較近的位置；15N-DNA密度較大停留在較低的位置。3DNA的復(fù)制與修復(fù)當(dāng)含有15N-DNA的細(xì)胞在14NH4C1培養(yǎng)液中培養(yǎng)1代后，只有一條區(qū)帶介于14N-DNA與15N-DNA之間。培養(yǎng)2代后則在14N-DNA區(qū)又出現(xiàn)一條帶。有等量的“雜種鏈”和輕鏈密度。這些結(jié)果只與半保留復(fù)制模型相符。全保留模型可以排除，但分散模型卻不能排除。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)Meselson等又將第1代的14N/15N雜種鏈變性使雙鏈分開(kāi)，再將變性前后的雙鏈和單鏈分別進(jìn)行CsCl密度梯度離心。變性前雜種雙鏈只有一種帶，密度為1.717g/cm3，變性后兩條單鏈的密度不同而呈現(xiàn)了兩條帶，一條為15N帶，（1.740g/cm3），另一條為14N帶（1.725g/cm3）。作為對(duì)照的是從肺炎球菌（S.pneumoniae）中提取的DNA，變性前后都只有一條帶，密度為1.700g/cm3。這一結(jié)果完全符合半保留復(fù)制預(yù)期的結(jié)果，并否定了全保留模型和分散模型。3DNA的復(fù)制與修復(fù)按照半保留復(fù)制方式培養(yǎng)兩代，只能出現(xiàn)14N和14N/15N兩種DNA分子，隨著代數(shù)的增加14N-DNA逐漸增加。而14N-15NDNA區(qū)帶逐漸減弱。3DNA的復(fù)制與修復(fù)②Taylor的實(shí)驗(yàn)真核細(xì)胞的每條染色單體是由一條DNA雙鏈組成，1958年HerbertTaylar用3H的胸腺嘧啶核苷酸處理蠶豆根尖細(xì)胞8小時(shí)，然后移入含有秋水仙素而沒(méi)有標(biāo)記放射性的培養(yǎng)液中。經(jīng)標(biāo)記處理后第一次分裂中期的染色體周?chē)@示放射性，每個(gè)染色體中有一條染色單體被標(biāo)記，另一條染色單體未被標(biāo)記。第二次分裂中期的染色體就只有一個(gè)顯示有放射性，而另一個(gè)卻沒(méi)有。證明真核DNA復(fù)制也符合半保留模型。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)③姐妹染色單體差別染色方法（sister-chromatiddifferentialstaining）在復(fù)制過(guò)程中用胸腺嘧啶的類(lèi)似物5-尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，BUdR）可摻入到新合成的DNA中。在兩細(xì)胞周期之后，一條染色單體中含有DNA分子的雙鏈都被BrdU取代，而另一條染色單體只有一條DNA單鏈中含有BrdU。若用熒光染料染色，DNA雙股都含有Brdu的染色單體的熒光強(qiáng)度要小于DNA的單股含BrdU的染色單體的熒光強(qiáng)度，在熒光顯微鏡下可觀察到兩條姐妹染色單體的熒光強(qiáng)弱不同。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)若用Giemsa染色，當(dāng)雙鏈都插入5-BudR時(shí)則染不上Giemsa，而一條插入5-BudR則可染色。若細(xì)胞的培養(yǎng)基加入5-BudR則第二復(fù)制周期時(shí)，兩條姊妹染色體染色狀況不同，一明一暗，稱(chēng)花斑染色體。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1.3DNA復(fù)制過(guò)程的順序性3.1.3.1邊解鏈邊復(fù)制DNA的復(fù)制是邊解鏈邊合成從SV40復(fù)制的早期電鏡照片可見(jiàn)復(fù)制部分和未復(fù)制部分。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1.3.2復(fù)制起點(diǎn)DNA復(fù)制是從DNA分子上特定位置（原點(diǎn)，origin）開(kāi)始，此位置稱(chēng)復(fù)制起點(diǎn)(Originofreplication，ori)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)復(fù)制起點(diǎn)（origin）是DNA復(fù)制所必需的一段特殊的DNA序列。噬菌體、細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和一些動(dòng)物病毒的DNA通常具有明顯的復(fù)制起點(diǎn)。酵母也有特異的復(fù)制起點(diǎn)，在細(xì)胞周期S期染色體復(fù)制時(shí)起重要的作用。3DNA的復(fù)制與修復(fù)大多數(shù)原核生物基因組和細(xì)菌質(zhì)粒只有一個(gè)Ori位點(diǎn)，而真核生物染色體中有多個(gè)Ori。例如，果蠅染色體DNA約有3000個(gè)Ori位點(diǎn)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1.3.3復(fù)制方向DNA復(fù)制方向的可能性。3DNA的復(fù)制與修復(fù)研究DNA復(fù)制的方向常用溫度敏感性變異菌株結(jié)合放射自顯影技術(shù)。大腸桿菌的一個(gè)溫度敏感株在42℃時(shí)能使DNA在完成復(fù)制后不再開(kāi)始新的復(fù)制過(guò)程，而在25℃時(shí)復(fù)制功能恢復(fù)。將此溫度敏感株在同一時(shí)間開(kāi)始復(fù)制，細(xì)菌同步生長(zhǎng)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)先將這種同步生長(zhǎng)的突變株在含高比度3H-TdR中生長(zhǎng)幾分鐘，再移入低比度3H-TdR中作脈沖標(biāo)記。然后對(duì)菌體DNA作放射自顯影分析。若復(fù)制是單向的，僅有一個(gè)高比度區(qū)，且高比度與低比度的放射性分布應(yīng)該鄰近。若復(fù)制是雙向的，有兩個(gè)分離的低比度放射性分布區(qū)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)枯草桿菌孢子在弱放射性DNA前體培養(yǎng)基萌發(fā)標(biāo)記一段時(shí)間，添加較強(qiáng)放射性前體3DNA的復(fù)制與修復(fù)果蠅（Drosophilamelanogaster）DNA復(fù)制的放射自顯影圖3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNA可進(jìn)行單向和雙向復(fù)制，大多數(shù)DNA的復(fù)制是雙向的。有些病毒（如腺病毒、Φ29噬菌體等）及線粒體DNA的復(fù)制是單向進(jìn)行的，滾筒式屬單向復(fù)制。3DNA的復(fù)制與修復(fù)SV40為5224bp的環(huán)形分子，有1個(gè)EcoRⅠ切點(diǎn)。中用EcoRⅠ酶切復(fù)制中的SV40得到復(fù)制眼大小不同的系列DNA分子，可見(jiàn)隨復(fù)制眼擴(kuò)大兩側(cè)DNA變短，說(shuō)明復(fù)制從原點(diǎn)開(kāi)始雙向復(fù)制。3DNA的復(fù)制與修復(fù)真核一般為多起點(diǎn)復(fù)制胚性蠑螈細(xì)胞DNA復(fù)制的放射自顯影圖，圖像顯示多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)可能同時(shí)開(kāi)始復(fù)制3DNA的復(fù)制與修復(fù)也可利用變形對(duì)DNA電泳遷移的作用來(lái)確定復(fù)制原點(diǎn)。例如用二維作圖方法，即復(fù)制中DNA的限制性片段在第一維方向進(jìn)行電泳，按分子量的大小分離。再在第二維方向電泳，第二維方向電泳移動(dòng)主要由形狀決定。不同復(fù)制中分子會(huì)有不同的路徑，這可以通過(guò)它偏離雙倍大小線形DNA分子的路線的程度來(lái)確定。3DNA的復(fù)制與修復(fù)復(fù)制起點(diǎn)的位置和復(fù)制叉的數(shù)目決定了限制性復(fù)制片段的形狀，這些形狀可通過(guò)不同的電泳路跡(實(shí)線)顯示出來(lái)。虛線顯示線形DNA的電泳路跡。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNA正在復(fù)制的分叉部位稱(chēng)為復(fù)制叉（replicationfork）3DNA的復(fù)制與修復(fù)非復(fù)制DNA的旁邊復(fù)制的DNA在電鏡下象只眼睛稱(chēng)復(fù)制眼（泡）3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1.4DNA的半不連續(xù)復(fù)制DNA復(fù)制是半保留復(fù)制，且是半不連續(xù)復(fù)制(Semi-discontinuousreplication)。DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，因此，在?fù)制起點(diǎn)處兩條DNA鏈解開(kāi)成單鏈時(shí)，一條是5’→3’方向，另一條是3’→5’方向。3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNA復(fù)制時(shí)，新生鏈延伸方向一條為3’→5’，另一條為5’→3’。但生物細(xì)胞內(nèi)所有催化DNA聚合酶都只能催化5’→3’延伸。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1.4.1半不連續(xù)復(fù)制的證據(jù)Okazaki（岡崎）于1968年通過(guò)3H–脫氧胸苷酸（3H–dT）標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證明了半不連續(xù)復(fù)制。①實(shí)驗(yàn)材料T4感染的E.coli：野生型phage–T4；mutantT4（連接酶突變）3DNA的復(fù)制與修復(fù)②實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)3H-dT標(biāo)記phage-T4感染E.coli，分別進(jìn)行脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（pilse-labelingexperiment）和脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)（pulse-chaseexperiment），；密度梯度離心。檢測(cè)標(biāo)記DNA在不同時(shí)間合成的情況。再分離提取T4噬菌體DNA，變性后，進(jìn)行CsCl密度梯度離心，以檢測(cè)具放射性的沉降片段，判斷片段大小。3DNA的復(fù)制與修復(fù)③實(shí)驗(yàn)結(jié)果：短時(shí)間內(nèi)，首先合成較短的DNA片段（岡崎片段），接著出現(xiàn)較大的DNA分子。突變型連接酶T4中，大片段DNA很少或無(wú)。半不連續(xù)合成，放射性標(biāo)記一半出現(xiàn)于短片段（岡崎片段），另一半出現(xiàn)在長(zhǎng)片段DNA中。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)④結(jié)論：DNA復(fù)制是半保留半不連續(xù)復(fù)制。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1.4.2半不連續(xù)復(fù)制在復(fù)制起點(diǎn)兩條鏈解開(kāi)形成復(fù)制泡(replicationbubbles)，DNA向兩側(cè)復(fù)制形成兩個(gè)復(fù)制叉(replicationforks)。以復(fù)制叉移動(dòng)的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，一條模板鏈?zhǔn)?’→5’，以此為模板的新生DNA鏈合成沿5’→3’方向連續(xù)進(jìn)行，這條鏈稱(chēng)前導(dǎo)鏈(leadingstrand)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)另一條模板鏈的方向?yàn)?’→3’，以此為模板的新鏈合成方向也是5’→3’，但與復(fù)制叉前進(jìn)方向相反，且是分段的不連續(xù)合成，這條鏈稱(chēng)滯后鏈(laggingstrand)，合成的片段為岡崎片段(Okaxakifragments)。岡崎片段由DNA連接酶連成完整的DNA鏈。3DNA的復(fù)制與修復(fù)前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制，稱(chēng)為DNA合成的半不連續(xù)復(fù)制。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.1.5復(fù)制子DNA復(fù)制從起點(diǎn)開(kāi)始雙向進(jìn)行直到終點(diǎn)為止。①?gòu)?fù)制子(replicon)復(fù)制子（復(fù)制單元)是一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)（origin，ori）所控制的DNA序列。3DNA的復(fù)制與修復(fù)②原核生物中，只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，每個(gè)DNA分子上只有一個(gè)復(fù)制子；③真核生物中，每個(gè)DNA分子有多個(gè)復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子長(zhǎng)約50-200kb；其DNA復(fù)制是由多個(gè)復(fù)制子共同完成的。每個(gè)細(xì)胞中，染色體DNA復(fù)制子一般只復(fù)制一次。大腸桿菌DNA復(fù)制1次需42min；人類(lèi)復(fù)制叉前進(jìn)100bp/s，復(fù)制整個(gè)基因體需8hr；果蠅復(fù)制整個(gè)基因體僅需3~4min。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)④染色體外遺傳元件的復(fù)制子染色體外遺傳元件包括：原核生物細(xì)胞中的質(zhì)粒和噬菌體；真核生物細(xì)胞中的線粒體、葉綠體和病毒的DNA。染色體外遺傳元件一般為單復(fù)制子（只有一個(gè)origin），但為多次復(fù)制，為多拷貝。3DNA的復(fù)制與修復(fù)真核生物的線粒體和葉綠體復(fù)制一般與核DNA同步或稍滯后；原核生物的染色體DNA和質(zhì)粒（噬菌體）一般不同步，但整合后同步。3DNA的復(fù)制與修復(fù)質(zhì)粒整合前為θ式或滾筒式復(fù)制，整合后為一個(gè)復(fù)制子。質(zhì)粒為雙向復(fù)制。3DNA的復(fù)制與修復(fù)E.coli溫敏型突變體在30℃復(fù)制正常，42℃時(shí)，E.coli復(fù)制起動(dòng)受阻，而以質(zhì)粒origin開(kāi)始的單向復(fù)制。說(shuō)明復(fù)制起始是受調(diào)控的。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2原核生物DNA的復(fù)制3.2.1DNA的復(fù)制酶和相關(guān)蛋白3.2.2原核生物DNA復(fù)制的引發(fā)3.2.3DNA鏈的延伸3.2.4DNA復(fù)制的終止3.2.5DNA復(fù)制的保真機(jī)制3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.1DNA的復(fù)制酶和相關(guān)蛋白DNA復(fù)制實(shí)際上就是DNA指導(dǎo)的DNA合成代謝，需要有DNA作為復(fù)制的模板。體外復(fù)制實(shí)驗(yàn)證明，新合成DNA的特異性完全取決于事先加入的模板DNA。三磷酸核苷酸(dNTP)是合成原料。細(xì)胞內(nèi)還有許多酶和蛋白質(zhì)參與DNA的復(fù)制。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.1.1解旋酶(Helicase)DNA復(fù)制時(shí)，解旋酶在ATP的作用下可促使DNA母鏈不斷解開(kāi)形成單鏈。DnaB利用ATP水解的能量解開(kāi)雙螺旋，推動(dòng)復(fù)制叉向前延伸。3DNA的復(fù)制與修復(fù)InE.coli,DnaBisahexamericproteinofsix471residuesubunits.DnaBhelicaseisa5'to3'helicasethattravelsalongthelaggingsinglestrandasitunwindsupstreamduplexDNA.3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.1.2單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)解旋酶沿復(fù)制叉方向推進(jìn)產(chǎn)生了一段單鏈區(qū)，細(xì)胞內(nèi)大量的單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandDNAbindingproteinSSB)能和單鏈DNA結(jié)合，防止其重新配對(duì)形成雙鏈DNA。3DNA的復(fù)制與修復(fù)單鏈結(jié)合蛋白通過(guò)與磷酸骨架結(jié)合使DNA單鏈相互分開(kāi)，它們離開(kāi)暴露的堿基，所以那些堿基可以作為DNA合成的模板。SSB與解旋酶不同，它不具備酶的活性。在E.coli細(xì)胞中主要SSB是177肽所組成的四聚體，可以和單鏈DNA上相鄰的32個(gè)核苷酸結(jié)合。T4噬菌體的單鏈結(jié)合蛋白是gp32，M13的單鏈結(jié)合蛋白是gp5。3DNA的復(fù)制與修復(fù)SSB的作用：使DNA單鏈保持一種伸展構(gòu)象，作為模板；使解開(kāi)的單鏈不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；保護(hù)DNA單鏈不受Dnase水解。3DNA的復(fù)制與修復(fù)SSB結(jié)合DNA單鏈有協(xié)同性(cooperativebinding)：一個(gè)SSB四聚體結(jié)合于單鏈DNA上可以促進(jìn)其他SSB四聚體現(xiàn)相鄰的單鏈DNA結(jié)合。第一個(gè)gp32的結(jié)合會(huì)使下一個(gè)gp32與DNA單鏈的親和力提高1000倍。3DNA的復(fù)制與修復(fù)SSB可以重復(fù)使用，當(dāng)新生的DNA鏈合成到某一位置時(shí)，該處的SSB便會(huì)脫落，并被重復(fù)利用。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.1.3DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶

(DNATopisomerase)拓?fù)洚悩?gòu)體（topoisomer)：具有不同螺旋數(shù)的同一DNA分子兩種異構(gòu)體。拓?fù)洚悩?gòu)酶：可使DNA的兩種拓?fù)洚悩?gòu)體互變的酶。DNA在細(xì)胞內(nèi)以超螺旋狀態(tài)存在，DNA拓?fù)涿复呋籇NA分子不同超螺旋狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。3DNA的復(fù)制與修復(fù)拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能：與DNA形成共價(jià)結(jié)合中間體，使DNA磷酸二酯鍵斷裂，形成DNAnick，DNA的一條鏈進(jìn)行解旋，旋轉(zhuǎn)而改變DNA分子的拓?fù)錉顟B(tài)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)拓?fù)洚悩?gòu)酶可使DNA發(fā)生連環(huán)化（catenate）、脫連環(huán)化（decatenate）、打結(jié)（knot）和解結(jié)（unknot）。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)拓?fù)洚悩?gòu)酶參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的重組等過(guò)程。3DNA的復(fù)制與修復(fù)拓?fù)洚悩?gòu)酶的種類(lèi)分為Ⅰ型和Ⅱ型。原核拓?fù)錁?gòu)酶Ⅰ：MW=100kD，單肽鏈，含3~4個(gè)Zn。作用是暫時(shí)切斷一條DNA鏈，形成酶-DNA共價(jià)中間物而使超螺旋DNA松弛，然后再將切斷的單鏈DNA連接起來(lái)。每次改變一個(gè)連環(huán)數(shù)。E.Coli的拓?fù)錁?gòu)酶Ⅰ具有松弛負(fù)超螺旋作用，真核生物和古細(xì)菌的拓?fù)錁?gòu)酶Ⅰ具有松弛負(fù)超螺旋和正超螺旋的作用。3DNA的復(fù)制與修復(fù)原核拓?fù)錁?gòu)酶Ⅰ作用機(jī)制：①酶與DNA結(jié)合使雙鏈解旋；②使一條鏈切開(kāi)，但酶與切口的兩端結(jié)合阻止了螺旋的旋轉(zhuǎn)；③酶使另一條鏈經(jīng)過(guò)缺口，然后再將兩斷端連接起來(lái)；④酶從DNA上脫落，兩條鏈復(fù)原，得到的DNA比原來(lái)少一個(gè)負(fù)超螺旋。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ也稱(chēng)旋轉(zhuǎn)酶。廣泛存在于各種生物中。使正超螺旋轉(zhuǎn)化為負(fù)超螺旋，每次改變兩個(gè)連接數(shù)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ催化模型3DNA的復(fù)制與修復(fù)1超螺旋DNA、2無(wú)酶、3–10酶量增加11缺ATP、12缺亞精胺、13缺MgCl2、14(同10)但缺ATP3DNA的復(fù)制與修復(fù)大多數(shù)天然狀態(tài)的雙鏈DNA均以負(fù)超螺旋的方式存在（極端嗜熱菌的DNA為正超螺旋），特別是進(jìn)行半保留復(fù)制的DNA均以種種拓?fù)洚悩?gòu)體的形式存在。負(fù)超螺旋是DNA復(fù)制的必需條件，負(fù)超螺旋可使DNA雙鏈堿基對(duì)打開(kāi)所需要的能量降低4.1KJ/mol，因而，有利于DNA的雙鏈分開(kāi)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)真核生物拓?fù)洚悩?gòu)酶酵母、兩棲類(lèi)動(dòng)物、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物和植物的Ⅰ拓?fù)洚悩?gòu)酶的特性相似，但與原核的酶有明顯差異。Ⅰ型：MW=95kD，單體蛋白，不需ATP。Ⅱ型：MW=150~180kD，均為二聚體，需ATP和Mg2+。3DNA的復(fù)制與修復(fù)Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶剪切一條鏈二條鏈機(jī)制酶非共價(jià)與DNA結(jié)合。一條鏈剪切，3’-P基團(tuán)共價(jià)與激活位點(diǎn)的酪氨酸殘基結(jié)合。未剪切的鏈從缺口處通過(guò)。打斷的鏈重新連接。酶非共價(jià)與DNA結(jié)合。兩條鏈都剪切，5’-P基團(tuán)共價(jià)與激活位點(diǎn)的酪氨酸殘基結(jié)合(這涉及對(duì)回旋酶和真核拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ有4bp交錯(cuò))。未被切割的雙鏈通過(guò)構(gòu)象改變從缺口通過(guò)。打斷的雙鏈重新連接。需要ATP不是大腸桿菌topoI(ω蛋白)、topoⅢ釋放負(fù)超螺旋回旋酶(topoⅡ)：誘導(dǎo)負(fù)超螺旋topoIV：去連接連鎖的環(huán)真核拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ：釋放正和負(fù)超螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅲ：釋放負(fù)超螺旋(弱活性)，不去連接拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ：釋放正和負(fù)超螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ：釋放負(fù)超螺旋，可能也能釋放正超螺旋3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.1.4引發(fā)酶(Primase)引發(fā)酶以單鏈DNA為模板，利用核糖核苷酸合成RNA（10~12nt）作為DNA合成的引物。3DNA的復(fù)制與修復(fù)引物的意義在于減少致死突變。DNA合成中最初幾個(gè)核苷酸正確性遠(yuǎn)比其后的低。引物RNA隨后被降解，從而減少了復(fù)制錯(cuò)誤。3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNA合成以RNA為引物的實(shí)驗(yàn)證據(jù)Reiji以α-32P-dNTP標(biāo)記＋未標(biāo)記NTP為底物。引發(fā)合成后，用稀堿處理。3DNA的復(fù)制與修復(fù)32P出現(xiàn)在水解產(chǎn)物中（RNA水解），證明RNA為引物。3DNA的復(fù)制與修復(fù)引物的大小從野生型和突變型菌株中分離岡崎片段發(fā)現(xiàn)RNA引物用[32P]GTP和加帽酶標(biāo)記岡崎片段中的完整引物a–d,DNase消化前e–h,DNase消化后a,e,RNaseH(-);b,f,DNApolⅠ(-)c,g,RNaseHandDNApolⅠ(-)d,h,wild-type3DNA的復(fù)制與修復(fù)引發(fā)酶催化引物RNA分子的合成，但它不同于RNA聚合酶。引發(fā)酶對(duì)rifampicin不敏感，而RNA聚合酶則敏感；引發(fā)酶只在復(fù)制起點(diǎn)處合成RNA引物而引發(fā)DNA的復(fù)制，而RNA聚合酶則是啟動(dòng)DNA轉(zhuǎn)錄合成RNA從而將遺傳信息由DNA傳遞到RNA。3DNA的復(fù)制與修復(fù)大腸桿菌的引發(fā)酶由一條多肽鏈組成，MW為60kD（比RNA聚合酶小很多），每個(gè)細(xì)胞中有50~100個(gè)分子，由大腸桿菌的dnaG基因編碼。但在單鏈?zhǔn)删wM13DNA和質(zhì)粒Co1E1DNA復(fù)制時(shí)，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。噬菌體T7的Gene4蛋白，T4的Gene41和61蛋白等也具有引發(fā)酶的活性和具有大腸桿菌引發(fā)酶相似的功能。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.1.5DNA聚合酶(DNAPolymerase)有30多種蛋白共同參與E.coli的DNA復(fù)制，其中催化DNA合成的DNA聚合酶（Polymerase）在不同生物中也具有同源物。E.coli中存在3種DNA聚合酶。3DNA的復(fù)制與修復(fù)原核DNA聚合酶：DNApolymeraseⅠ、DNApolymeraseⅡ和DNApolymeraseⅢ3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNApol的發(fā)現(xiàn)1956年，Kornberg用無(wú)細(xì)胞E.coli系統(tǒng)證明DNA是模板合成。1958年發(fā)現(xiàn)DNApolⅠ。3DNA的復(fù)制與修復(fù)①大腸桿菌DNApolymeraseⅠ1958年ArthurKornberg發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，又稱(chēng)Kornberg酶。此酶已經(jīng)研究清楚且代表了其他DNA聚合酶的基本特點(diǎn)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)酶的性質(zhì)DNApolⅠ由一條多肽鏈組成，約含1000個(gè)氨基酸殘基，MW為102KD。分子含有一個(gè)二硫鍵和一個(gè)SH基。每個(gè)分子中含有一個(gè)Zn2+，在DNA聚合反應(yīng)起著很重要的作用。每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中含有約400個(gè)分子，每個(gè)分子37℃下能催化600nt/min摻入正在生長(zhǎng)的DNA鏈。3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNApolⅠ可被枯草桿菌蛋白酶裂解成2個(gè)片段，大片段稱(chēng)為Klenow片段，具聚合酶和3’→5’外切酶的活性，由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。小片段具有5’→3’外切酶活性。3DNA的復(fù)制與修復(fù)酶的活性中心位置上至少有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：模板DNA結(jié)合位點(diǎn)；DNA生長(zhǎng)鏈或引物結(jié)合位點(diǎn)；引物末端結(jié)合位點(diǎn)；脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點(diǎn)；5’→3’外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合生長(zhǎng)鏈前方的5’-端脫氧核苷酸并切除之；3’→5’外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合和切除生長(zhǎng)鏈上未配對(duì)的3’-端核苷酸。3DNA的復(fù)制與修復(fù)酶的功能a.聚合作用在引物的3’-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個(gè)聚合上核苷酸。酶的專(zhuān)一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對(duì)時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3’-OH與5’-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。3DNA的復(fù)制與修復(fù)b.3’→5’外切酶活性（校對(duì)作用）3’→5’外切酶活性是從3’→5’方向識(shí)別和切除不配對(duì)的DNA生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。錯(cuò)誤核苷酸進(jìn)入polⅠ的結(jié)合位點(diǎn)不能與模板配對(duì)，無(wú)法改變酶的構(gòu)象而被3’→5’外切酶活性位點(diǎn)所識(shí)別并切除。3DNA的復(fù)制與修復(fù)在T4噬菌體突變株中分離得到的T4DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性很低，使DNA復(fù)制的真實(shí)性降低，而易發(fā)生突變。具有抗突變能力的T4突變株中的DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復(fù)制真實(shí)性好，變異率低。3’→5’外切酶活性的主要功能是校對(duì)作用。維持了DNA復(fù)制真實(shí)性。3DNA的復(fù)制與修復(fù)c.5’→3’外切酶活性（切除修復(fù)作用）：5’→3’外切酶活性是從5’→3’方向水解DNA生長(zhǎng)鏈前方的DNA鏈。它只作用具切口的雙螺旋DNA，并在切口以外的配對(duì)區(qū)切割。3DNA的復(fù)制與修復(fù)5’→3’外切酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對(duì)岡崎片段5’-末端RNA引物的去除依賴(lài)此種外切酶活性（每次能切除10nt）。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNApolⅠ聚合酶活性和5’→3’外切酶活性協(xié)同作用雙鏈DNA上的單鏈切口可激活DNApolⅠ的5’→3’外切酶活力，從切口的5’-端切除舊鏈，同時(shí)從切口開(kāi)始合成新鏈，可使DNA鏈上切口向前推進(jìn)，產(chǎn)生缺口平移(nicktranslation)，即沒(méi)有新DNA合成，只有核苷酸交換。3DNA的復(fù)制與修復(fù)缺口平移可從切口開(kāi)始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣棣?32P-dNTP，則重新合成的新鏈為帶有同位素標(biāo)記的DNA分子，可以用作探針進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNAPolⅠ在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約6.5nm，在酶的縱軸上有一個(gè)約2nm的深溝(cleft)，帶有正電荷，是酶的活性中心位置。3DNA的復(fù)制與修復(fù)SomeDNApolymeraseshaveacommonstructure.3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNApolⅠ不是大腸桿菌中DNA復(fù)制的主要酶。在一些突變株中，polⅠ的活力只是野生型的1%，但DNA復(fù)制卻正常，但突變株對(duì)輻射和化學(xué)誘變劑卻高度敏感。DNApolⅠ在DNA修復(fù)中起著重要的作用。1971年ThomasKornberg和MalcolmGefter發(fā)現(xiàn)DNApolⅡ和polⅢ3DNA的復(fù)制與修復(fù)②大腸桿菌DNApolⅡ1971年發(fā)現(xiàn)DNApolⅡ，MW為120KD，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)約有100個(gè)酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。聚合作用：polⅡ催化DNA的聚合，它最適模板是雙鏈DNA而中間有小空隙(gap，50~200nt)的單鏈DNA部份。3DNA的復(fù)制與修復(fù)polⅡ具有3’→5’外切酶活性，但無(wú)5’→3’外切酶活性。polⅡ基因缺陷的大腸桿菌突變株的DNA復(fù)制正常。表明polⅡ不是DNA復(fù)制的主要酶，它可能在DNA損傷修復(fù)中起一定作用。3DNA的復(fù)制與修復(fù)③大腸桿菌DNApolⅢDNApolⅢ的發(fā)現(xiàn)1969年，Cairns發(fā)現(xiàn)E.coli的一種突變體的細(xì)胞抽提液，雖然反應(yīng)顯示﹤1%的DNApolⅠ活力，但該突變體能以正常速率繁殖。突變體對(duì)紫外輻射和化學(xué)誘變十分敏感，表明可能存在另一種DNApol。3DNA的復(fù)制與修復(fù)磷酸纖維素柱層析PolⅠ的存在掩蓋了polⅢN-乙烷基馬來(lái)酰亞胺抑制PolⅢ野生型缺失DNApolⅠ突變株3DNA的復(fù)制與修復(fù)E.coli突變株3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNApolⅢ至少以10種亞基組成復(fù)合物（DNA聚合酶全酶）參與DNA復(fù)制。3DNA的復(fù)制與修復(fù)a、

及

亞基構(gòu)成核心聚合酶(corepolymerase)。a具有聚合酶活性；

有3’→5’核酸外切酶的活力。a和有相互增進(jìn)活性的作用

亞基有促進(jìn)

活性等的作用3DNA的復(fù)制與修復(fù)blueandgreen,polIIIcoreorangeandred,ε-subunit.3H-labeledsyntheticDNAε-subunit3DNA的復(fù)制與修復(fù)

構(gòu)成聚合酶的卡箍(clamp)，結(jié)合在DNA模板鏈上。3DNA的復(fù)制與修復(fù)polⅢ全酶的結(jié)構(gòu)是一種非對(duì)稱(chēng)二聚體。polⅢ在細(xì)胞內(nèi)數(shù)量少（每個(gè)E.coli中只有10~20個(gè)酶分子），但催化dNTP摻入DNA鏈的速率高達(dá)1000nt/s（體外約為700nt/s）。polⅢ具有聚合酶和3’→5’外切酶活性。3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNApolⅢ是細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度(nonpermissivetemperature)內(nèi)是不能生長(zhǎng)的，此種突變株的裂解液也不能合DNA，但加入polⅢ則可以恢復(fù)其合成DNA的能力。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.1.6DNA連接酶(DNAligase)DNA在隨后鏈上的復(fù)制是不連續(xù)的，合成的DNA片段需要連接酶連接。DNA連接酶的主要功能是借助ATP或NAD水解提供的能量，催化雙鏈DNA上的單鏈斷點(diǎn)的5’-端與3’-端生成磷酸二酯鍵，封閉DNA雙鏈上的斷點(diǎn)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNA連接酶的作用條件①被連接的兩鏈必須與另一鏈（模板鏈）互補(bǔ)；②兩鏈相鄰；③每次只能連接一個(gè)切口；④使一條鏈的5’-P與另一鏈的3’-OH形成磷酸二酯鍵。⑤連接需要能量（細(xì)菌DNA連接酶依賴(lài)NAD，真核DNA連接酶利用ATP）。⑥缺口缺失核苷酸不連接。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)連接酶作用機(jī)制①NAD+或ATP將其腺苷?；D(zhuǎn)移到DNA連接酶的1個(gè)Lys殘基的ε-NH2上。②酶-腺苷酸中間物上的腺苷?；D(zhuǎn)移到DNA的5’-磷酸基端。③被激活的5’-磷?；撕虳NA的3’-OH端生成磷酸二酯鍵。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNA連接酶催化的連接反應(yīng)是可逆的。逆反應(yīng)過(guò)程可在AMP存在時(shí)，使共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNA產(chǎn)生有缺口的DNA-腺苷酸，生成松弛的閉環(huán)DNA。大腸桿菌的DNA連接酶(MW75KD)被胰蛋白酶水解形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶與NAD（不是ATP）反應(yīng)形成酶-AMP中間物，但不能繼續(xù)將AMP轉(zhuǎn)移到DNA上促進(jìn)磷酸二酯鍵的形成。3DNA的復(fù)制與修復(fù)大腸桿菌細(xì)胞中約有300個(gè)分子的DNA連接酶。與DNA聚合酶Ⅰ的分子數(shù)相近。連接酶在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組中起重要作用，連接酶有缺陷的突變株不能進(jìn)行DNA復(fù)制、修復(fù)和重組。3DNA的復(fù)制與修復(fù)在真核生物細(xì)胞中的DNA連接酶，分為連接酶Ⅰ和Ⅱ，反應(yīng)中利用ATP所提供的能量。DNA連接酶Ⅰ分子量約為200KD，主要存在于生長(zhǎng)旺盛細(xì)胞中，DNA連接Ⅱ分子量約85KD，主要存在于生長(zhǎng)于不活躍的細(xì)胞中(restingcell)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)在DNA復(fù)制過(guò)程中還有許多蛋白質(zhì)參與，如大腸桿菌細(xì)胞中就有三十多種蛋白質(zhì)參與DNA復(fù)制，許多蛋白質(zhì)的功能目前尚不明了。DNA復(fù)制過(guò)程中還有許多未知的因子參與，DNA復(fù)制過(guò)程中許多具體的細(xì)節(jié)尚不十分清楚。3DNA的復(fù)制與修復(fù)T4Ligase特性①催化雙鏈DNA或RNA的5'-磷酸末端和3'-羥基末端形成磷酸二酯鍵。②催化平滑末端或粘性末端DNA之間的連接，還可修復(fù)雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切口。T4Ligase可作為重組工具酶。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.2原核生物DNA復(fù)制的引發(fā)盡管原核生物是較簡(jiǎn)單的單細(xì)胞生物體，但其復(fù)制過(guò)程很復(fù)雜，并且是一個(gè)順序性過(guò)程，涉及到多種酶和蛋白因子，是這些酶和蛋白因子協(xié)同作用的結(jié)果。3DNA的復(fù)制與修復(fù)對(duì)E.coliDNA復(fù)制機(jī)制的認(rèn)識(shí)是利用E.coli突變體和φx174的復(fù)制進(jìn)行初步研究的結(jié)果。研究方法：①獲得突變體，對(duì)突變基因研究獲得其功能；②反義RNA基因工程；③點(diǎn)突變基因工程。3DNA的復(fù)制與修復(fù)大腸桿菌復(fù)制基因3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)利用噬菌體研究原核DNA復(fù)制噬菌體DNA有線型、環(huán)型、單鏈、雙鏈，其復(fù)制機(jī)制可表明各種形式的DNA復(fù)制模式；噬菌體利用寄主的基因產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)制，復(fù)制行為與寄主相似。3DNA的復(fù)制與修復(fù)φX174和G4的DNA為模式底物，可以鑒定E.coilDNA復(fù)制體系中的重要組分：可用遺傳和生化方法，分離復(fù)制缺陷突變體，再用野生型蛋白對(duì)突變體提取物進(jìn)行功能互補(bǔ)。用生化方法，分離純化所有必需組分，體外重組裝復(fù)制系統(tǒng)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.2.1M13噬菌體復(fù)制的引發(fā)M13基因組為6407nt的單鏈環(huán)狀DNA分子，在5480~5820nt間有5個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中第3個(gè)最重要，有59個(gè)nt，此雙鏈區(qū)是一個(gè)復(fù)制起始的信號(hào)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)M13利用宿主細(xì)胞的RNApol在發(fā)夾結(jié)構(gòu)前6nt開(kāi)始合成引物RNA。對(duì)于RNApol如何識(shí)別這個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)作為起始位點(diǎn)的還不清楚，可能還涉及其他一些蛋白質(zhì)。當(dāng)RNA鏈合成到20~30nt時(shí)形成的RNA-DNA雜交體使發(fā)夾結(jié)構(gòu)破壞，將另一半發(fā)夾結(jié)構(gòu)釋放出來(lái)。因此，SSB就結(jié)合到這段序列上。3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNApolIII以RNA為引物合成DNA鏈直到RNA引物的開(kāi)始處。引物被RnaseH/DNApolI切除并補(bǔ)齊因RNA切除后形成的空缺，切口再由連接酶連接起來(lái)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)G4噬菌體(5577nt)的復(fù)制與M13的不同之處在于它不是由RNA聚合酶起始復(fù)制，G4是由引發(fā)酶直接結(jié)合到其DNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)上，合成一段約29nt的RNA引物，互補(bǔ)于發(fā)夾結(jié)構(gòu)一條鏈的RNA。DNA鏈在RNA3’-OH上延長(zhǎng)，此后的反應(yīng)和M13是相同的。3DNA的復(fù)制與修復(fù)A：引物合成時(shí)不加dNTP；B：引物合成后加入dNTP；C：起始反應(yīng)時(shí)加入dNTP和NTP3DNA的復(fù)制與修復(fù)M13的復(fù)制能被RNA聚合酶的抑制劑——利福平所抑制，而G4和φX174的復(fù)制則不被利福平所抑制。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.2.2φx174的復(fù)制φX174的復(fù)制比M13和G4復(fù)雜，需要更多的蛋白質(zhì)因子參與，形成一個(gè)類(lèi)似大腸桿菌中的復(fù)制引發(fā)體，并且可能在幾個(gè)位點(diǎn)起始DNA的合成，可作為岡崎片段合成起始的范例。3DNA的復(fù)制與修復(fù)φx174的復(fù)制模式Φx174的DNA復(fù)制除模板外，復(fù)制系統(tǒng)均由寄主提供。Φx174（+）鏈（SS）

合成φx174（-）鏈，形成RFφx174（SS→RF）

RF繁殖（RF→RF）

新的φx174（+）鏈產(chǎn)生（RF→SS）3DNA的復(fù)制與修復(fù)

X174的(－)鏈合成(SS→RF)①

xl74的(+)鏈進(jìn)入寄主細(xì)胞，除分子中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)外，其它部分被SSB覆蓋。(－)鏈合成(SS→RF)需引物體(primosome)參與。3DNA的復(fù)制與修復(fù)在基因F和G間的70nt片段是引物體組裝位點(diǎn)(primosomeassemblysite，pas)，pas形成44nt組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可被PriA識(shí)別，在PriB和PriC參與下形成復(fù)合物。3DNA的復(fù)制與修復(fù)②由PriA、PriB和PriC組成的復(fù)合物與DnaT、DnaB和DnaC組裝成預(yù)引物體(preprimosome)。其中DnaB和DnaC形成由ATP穩(wěn)定化的B6C6復(fù)合物。預(yù)引物體與引發(fā)酶（DnaG）結(jié)合成引物體。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)③引發(fā)體在pas位點(diǎn)上形成，但引物合成是在很多位點(diǎn)上，表明引發(fā)體可沿著單鏈DNA引發(fā)位點(diǎn)移動(dòng)。當(dāng)引物合成后，PriA水解ATP引起DnaB變構(gòu)而降低與單鏈DNA的親和性，移動(dòng)到另一個(gè)起始位點(diǎn)，ADP又被ATP取代，引發(fā)酶能穩(wěn)定DnaB·ATP·ssDNA復(fù)合物，開(kāi)始另一個(gè)引發(fā)反應(yīng)。引發(fā)體至少含DnaB、PriA和引發(fā)酶。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)PriA可識(shí)別pas位點(diǎn)，并且還具有水解ATP和置換SSB的活性，這對(duì)引發(fā)體移動(dòng)到其它位點(diǎn)進(jìn)行引發(fā)非常重要。M13和G4僅有一個(gè)引發(fā)點(diǎn)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)④DNAPolⅢ全酶從引物延伸合成DNA片段。引發(fā)體移動(dòng)的方向同DNA鏈延長(zhǎng)方向相反，這說(shuō)明雙鏈DNA復(fù)制時(shí)，隨從鏈合成岡崎片段的情形。當(dāng)復(fù)制叉向前移動(dòng)時(shí)，在引發(fā)體前方就形成單鏈，每一次引發(fā)反應(yīng)以后，引發(fā)體就沿著單鏈向前移動(dòng)到下一個(gè)岡崎片段合成開(kāi)始的位點(diǎn)。因此，引發(fā)物移動(dòng)的方向同復(fù)制叉相同，同隨從鏈DNA合成方向相反。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)⑤切除RNA引物填補(bǔ)缺口，連接DNA片段。形成的雙鏈DNA稱(chēng)為RF。⑥引物體繼續(xù)與DNA相結(jié)合以備參與(+)鏈的合成。

xl74(－)鏈合成是不連續(xù)的。3DNA的復(fù)制與修復(fù)

X174的(+)鏈合成(RF→SS)(+)鏈合成涉及噬菌體編碼的gpA和大腸桿菌的Rep。gpA（60kD）對(duì)(+)鏈原點(diǎn)具有專(zhuān)一性的核酸內(nèi)切酶活力。gpA的功能是引發(fā)復(fù)制起始。3DNA的復(fù)制與修復(fù)①gpA借引物體結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)，專(zhuān)一性切割4305和4306間的磷酸二酯鍵產(chǎn)生切口。gpA通過(guò)其酪氨酸殘基與4306位5’端結(jié)合，保存鏈能。②Rep蛋白結(jié)合于gpA處的(－)鏈。Rep蛋白從(+)鏈?zhǔn)筭pA復(fù)合物從(+)鏈的5’端開(kāi)始使雙鏈DNA解鏈，分離出的(+)鏈被SSB保護(hù)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)③polⅢ全酶從(+)鏈3’端使DNA鏈不斷延伸，形成環(huán)化的滾環(huán)結(jié)構(gòu)(loopedrollingstructure)。而原來(lái)的(+)鏈在復(fù)制叉移動(dòng)時(shí)仍與gpA相連，如同逐步被剝離。3DNA的復(fù)制與修復(fù)④復(fù)制繞(－)鏈超過(guò)完整一周后產(chǎn)生1個(gè)雙股復(fù)制原點(diǎn)，gpA在此再做專(zhuān)一切割，再與新形成的5’端共價(jià)結(jié)合，gpA的第2次切割產(chǎn)生單位長(zhǎng)度的

X174DNA，它的3’-OH向gpA5’-P做親核攻擊形成環(huán)狀分子（+鏈）。3DNA的復(fù)制與修復(fù)每個(gè)gpA分子含2個(gè)活性酪氨酸，故可完成相繼地切割，并與5’-端相連。3DNA的復(fù)制與修復(fù)在由

x174感染的中期，每個(gè)新合成的(+)鏈指導(dǎo)(－)鏈合成從而形成RF。在感染的后期，新合成的(+)鏈通過(guò)噬菌體編碼的病毒成熟蛋白和衣殼蛋白(gpB、E、D、F、G和H)形成新的病毒粒子。3DNA的復(fù)制與修復(fù)φx174（-）鏈合成為隨后鏈復(fù)制模式?？捎糜谘芯縀.coli隨后鏈的合成機(jī)制，不連續(xù)合成。φx174（+）鏈合成為主導(dǎo)鏈復(fù)制模式?？捎糜谘芯縀.coli主導(dǎo)鏈的合成機(jī)制。連續(xù)合成。3DNA的復(fù)制與修復(fù)大腸桿菌基因組是雙股環(huán)形DNA，其復(fù)制是由單一原點(diǎn)（origin）開(kāi)始的

式復(fù)制。origin處形成復(fù)制叉，經(jīng)過(guò)先導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制，到達(dá)終點(diǎn)完成復(fù)制。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.2.3E.coliDNA復(fù)制的引發(fā)E.coli的DNA復(fù)制起始指從origin（原點(diǎn)）開(kāi)始的起始過(guò)程，這一過(guò)程不同于隨后鏈上岡崎片段的起始。DNA復(fù)制的引發(fā)包括：起始識(shí)別→解鏈→解旋→引發(fā)體組裝。3DNA的復(fù)制與修復(fù)復(fù)制原點(diǎn)（origin)DNA復(fù)制不是隨機(jī)的從DNA分子上的任何一點(diǎn)起始，而是從特定的區(qū)域開(kāi)始。大腸桿菌的復(fù)制起始點(diǎn)(oriC)位于其基因組天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操縱子間。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)最小的oriC包含245bp（方括號(hào)內(nèi)）3DNA的復(fù)制與修復(fù)ori的特性復(fù)制起點(diǎn)幾乎都是富含A-T的序列；已經(jīng)分離出大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起點(diǎn)oriC。由245bp的DNA片段組成。3DNA的復(fù)制與修復(fù)oriC含有2個(gè)系列的重復(fù)單位，其中有3個(gè)13bp重復(fù)序列和4個(gè)9bp重復(fù)序列，均富含AT。富含AT、回文序列3DNA的復(fù)制與修復(fù)Ori在細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)中都是保守的很多細(xì)菌的ori區(qū)在結(jié)構(gòu)上相似，序列上有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?，且在分?lèi)關(guān)系上愈接近的細(xì)菌間其同源性愈高。腸桿菌3DNA的復(fù)制與修復(fù)將一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)連接到任一DNA上，都能支持其復(fù)制。9bp（A位點(diǎn)）為DnaA蛋白識(shí)別位點(diǎn)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)引發(fā)體的形成復(fù)制開(kāi)始的是形成引發(fā)體，這需要很多蛋白因子的參與。3DNA的復(fù)制與修復(fù)①足跡法證明DnaA蛋白識(shí)別起始序列并結(jié)合于oriC的9bp重復(fù)序列，形成oriC負(fù)超螺旋包裹在外，2~4個(gè)DnaA蛋白在內(nèi)的復(fù)合物。3DNA的復(fù)制與修復(fù)引發(fā)復(fù)合物和復(fù)制泡的形成3DNA的復(fù)制與修復(fù)②HU蛋白參與并促進(jìn)DnaA蛋白識(shí)別3個(gè)13bp串聯(lián)重復(fù)序列使DNA熔鏈形成開(kāi)放復(fù)合物。用核酸酶P1（作用ssDNA）證明解鏈部分約為45bp。3DNA的復(fù)制與修復(fù)③DnaB和DnaC（引發(fā)體成員）蛋白進(jìn)入解鏈區(qū)形成前引物復(fù)合體，DnaC可推動(dòng)解旋酶DnaB與DNA的結(jié)合。3DNA的復(fù)制與修復(fù)④SSB結(jié)合在被解開(kāi)的單鏈上，由DnaA、HU、DnaC、DnaB和拓?fù)洚悩?gòu)酶等組成引發(fā)前體(preprimosome)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)⑤引發(fā)前體進(jìn)一步與引發(fā)酶(DnaG，primase)組裝成引發(fā)體(primosome)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)⑥在SSB和旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶）的參與下，引發(fā)體可在單鏈DNA上移動(dòng)，在DnaB亞基的作用下識(shí)別DNA復(fù)制起點(diǎn)位置。引發(fā)體先在前導(dǎo)鏈上由引發(fā)酶催化合成RNA引物，此過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄激活(transcriptionalactivation)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)⑦DNApolⅢ組裝和復(fù)制叉上二聚體形成。3DNA的復(fù)制與修復(fù)⑧引發(fā)體在滯后鏈上沿5’→3’方向相對(duì)移動(dòng)，并在模板鏈上斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成滯后鏈的引物RNA，供DNA聚合酶Ⅲ合成岡崎片段使用。在RNA引物3’端DNA開(kāi)始聚合。3DNA的復(fù)制與修復(fù)許多因子協(xié)同作用才使引發(fā)體在滯后鏈上移動(dòng)，識(shí)別合適的引物合成位置，并將核苷酸在引發(fā)位置上聚合成RNA引物。在同一種生物體細(xì)胞中這些引物都具有相似的序列，表明引發(fā)酶要在DNA滯后鏈模板上比較特定的位置（序列）上才能合成RNA引物。3DNA的復(fù)制與修復(fù)E.coli的RNA引物通常10~12nt，序列以pppAG開(kāi)始，對(duì)應(yīng)于模板3’-GTC-5’a-d,beforeDNasedigestione-h,afterdigestionaande,RNaseHfpolIcandg,RNaseHpolIdandh,wild-type3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)RNA引物形成后，DNApolⅢ的亞基組裝成非對(duì)稱(chēng)DNA聚合酶Ⅲ二聚體，它催化將第一個(gè)脫氧核苷酸按堿基互補(bǔ)原則加在RNA引物3'-OH端而進(jìn)入DNA鏈的延伸階段。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.3DNA鏈的延伸3.2.3.1正超螺旋的消除解旋酶在復(fù)制叉處邊移動(dòng)邊解開(kāi)雙鏈，DNA聚合酶Ⅲ催化DNA新生鏈的合成。DNA解鏈時(shí)必產(chǎn)生正超螺旋，當(dāng)達(dá)到一定程度后就會(huì)造成復(fù)制叉難以繼續(xù)前進(jìn)而終止DNA復(fù)制。而細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制不會(huì)因出現(xiàn)拓?fù)鋵W(xué)問(wèn)題而停止。3DNA的復(fù)制與修復(fù)解除正超螺旋的機(jī)制①DNA在生物細(xì)胞中本身就是負(fù)超螺旋，當(dāng)DNA解鏈而產(chǎn)生正超螺旋時(shí)，可以被原來(lái)存在的負(fù)超螺旋所中和。②DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可打開(kāi)一條鏈，使正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變成松弛狀態(tài)；同時(shí)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(旋轉(zhuǎn)酶)也可以在復(fù)制叉前方將負(fù)超螺旋引入雙鏈DNA。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.3.2復(fù)制體(replisome)的形成DNA復(fù)制體是在復(fù)制叉附近，由DNApolⅢ二聚體、引發(fā)體和DnaB等構(gòu)成的類(lèi)似核糖體大小的復(fù)合體。復(fù)制體在DNA前導(dǎo)鏈模板和滯后鏈模板上移動(dòng)時(shí)便合成了連續(xù)的DNA前導(dǎo)鏈和由許多岡崎片段組成的滯后鏈。不同系統(tǒng)（噬菌體、E.coli、動(dòng)物、植物病毒）中的復(fù)制體組分雖有差異，但功能相似。3DNA的復(fù)制與修復(fù)復(fù)制體包括Ori的復(fù)制體（主導(dǎo)鏈和隨從鏈的是否相同）和復(fù)制起始后延伸過(guò)程的復(fù)制體兩種。延伸過(guò)程的復(fù)制體為非對(duì)稱(chēng)的DNApolⅢ二聚體、DnaB、隨從鏈上的SSB和引發(fā)體等組成。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.3.3DNA鏈的延伸前導(dǎo)鏈和滯后鏈由同一polⅢ二聚體延伸。前導(dǎo)鏈的合成：由DnaG（primase）在復(fù)制起始位點(diǎn)附近合成1個(gè)RNA引物，然后由polⅢ把dNTP加到該引物上。3DNA的復(fù)制與修復(fù)滯后鏈的合成：產(chǎn)生Okazakifragments，消除RNA引物并由DNApol補(bǔ)上一小段DNA序列，由DNAligase把兩個(gè)片段相連。3DNA的復(fù)制與修復(fù)DNA滯后鏈與主導(dǎo)鏈合成的不同步。在DNA復(fù)制叉處由一個(gè)非對(duì)稱(chēng)DNApolⅢ二聚體，同時(shí)分別進(jìn)行復(fù)制DNA前導(dǎo)鏈和滯后鏈。3DNA的復(fù)制與修復(fù)當(dāng)滯后鏈模板穿過(guò)全酶時(shí)，DNA合成就從RNA引物的3′端開(kāi)始并逐步延伸，直至抵達(dá)另一個(gè)已合成的岡崎片段。這時(shí)環(huán)就松開(kāi)，隨著先導(dǎo)鏈上DNA合成的繼續(xù)，新的滯后鏈模板又出現(xiàn)，它繼而回折成環(huán)并合成新的岡崎片段。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)通過(guò)電鏡對(duì)T4和T7噬菌體復(fù)制時(shí)觀察到的復(fù)制環(huán)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)2008年，SamirM.Hamdan等實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)先導(dǎo)鏈上DNA開(kāi)始合成以及復(fù)制叉向前移動(dòng)時(shí)，位于滯后連的引發(fā)體，在合成引物后，滯后鏈的模板即繞聚合酶回折成環(huán)。并與聚合酶的另一個(gè)活性中心按先導(dǎo)鏈的走向聚合。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)

3DNA的復(fù)制與修復(fù)這樣，DNA的兩股鏈就通過(guò)聚合酶Ⅲ全酶共同被合成。由于在復(fù)制叉上，一套酶可以同時(shí)在兩條鏈上進(jìn)行復(fù)制，所以先導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成速度不會(huì)相差很多。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)當(dāng)岡崎片段形成后，RnaseH/DNApolⅠ切除岡崎片段上的RNA引物；同時(shí)，利用后一個(gè)岡崎片段作為引物合成DNA。3DNA的復(fù)制與修復(fù)最后的單鏈斷點(diǎn)由DNAligase連接形成完整的滯后鏈。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.4DNA復(fù)制的終止3.2.4.1E.coliDNA復(fù)制的終點(diǎn)在DNA上存在著復(fù)制終止位點(diǎn)，復(fù)制叉在此位點(diǎn)相遇（forksmeet）。E.coli的DNA復(fù)制終點(diǎn)分別是一些22bp的短序列，TerA到TerF。3DNA的復(fù)制與修復(fù)終止位點(diǎn)的序列可被Tus蛋白（tus基因編碼，forterminusutilizationsubstance）識(shí)別，并結(jié)合于其上，它使復(fù)制叉在完成整個(gè)DNA復(fù)制前停頓在此。3DNA的復(fù)制與修復(fù)E.coli兩個(gè)復(fù)制叉分別由3個(gè)終止位點(diǎn)操控，TerE、TerD和TerA終止反時(shí)針?lè)较驈?fù)制叉；TerF、TerB和TerC終止順時(shí)針?lè)较驈?fù)制叉。3DNA的復(fù)制與修復(fù)當(dāng)兩個(gè)復(fù)制叉同時(shí)到達(dá)終止區(qū)域后DNA復(fù)制終止，其間大約有50~100bp的DNA未被復(fù)制，復(fù)制停頓的DNA開(kāi)始解鏈，進(jìn)一步修復(fù)缺口，后形成兩個(gè)連鎖的子代DNA，在拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ作用下解連鎖。3DNA的復(fù)制與修復(fù)大腸桿菌DNA復(fù)制起始的調(diào)控與DnaA對(duì)甲基化位點(diǎn)的識(shí)別密切相關(guān)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)大腸桿菌在一個(gè)細(xì)胞周期中可能發(fā)動(dòng)2次DNA復(fù)制。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.4.2DNA復(fù)制后的末端問(wèn)題DNA復(fù)制時(shí)，當(dāng)RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合Ⅰ所填充。而線性DNA分子以5’→3’為模板的滯后鏈的合成，末端的RNA引物被切除后是無(wú)法被DNA聚合酶所填充的。3DNA的復(fù)制與修復(fù)①T7DNA復(fù)制方式T7DNA兩端的DNA序列區(qū)有160bp長(zhǎng)的序列完全相同。T7DNA復(fù)制時(shí)，產(chǎn)生的兩個(gè)子代DNA的3’-端尾巴以互補(bǔ)結(jié)合。再由DNApolⅠ填充和DNA連接酶連接后，形成2個(gè)單位長(zhǎng)度的T7-DNA分子。3DNA的復(fù)制與修復(fù)這樣復(fù)制下去，便可形成多個(gè)單位長(zhǎng)度的T7DNA分子。這樣的T7DNA分子可被特異的內(nèi)切酶切開(kāi)，用DNApolⅠ填充，形成與親代DNA完全一樣的雙鏈T7DNA分子。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)②腺病毒(Adenovirus)DNA復(fù)制3DNA的復(fù)制與修復(fù)腺病毒是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)35973bp，兩端各有反向重復(fù)序列103－162bp，兩末端各有50bp為復(fù)制起點(diǎn)。腺病毒的基因組以線性的雙鏈DNA形式存在，由蛋白VII和一種mu的小蛋白緊密地環(huán)繞在其周?chē)?，起到?lèi)組蛋白樣的作用。蛋白V將這種DNA-蛋白復(fù)合物連接起來(lái)，并通過(guò)蛋白VI與病毒衣殼連接在一起。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)在兩條鏈的5’端各以共價(jià)鍵結(jié)合著一個(gè)DNA末端蛋白（TP）復(fù)合物（DNA-TPC）的特化的結(jié)構(gòu)，與腺病毒復(fù)制密切相關(guān)。腺病毒基因組的兩端各有一段的反向末端重復(fù)序列（ITR），是復(fù)制的起始位點(diǎn)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)在腺病毒的成熟病毒DNA分子5’端共價(jià)連接一個(gè)55kD的蛋白。在腺病毒DNA復(fù)制鏈上的蛋白是80kD，稱(chēng)為末端蛋白（Terminalprotein，TP）它比附著在成熟DNA上的要大。這種80kD蛋白實(shí)際上是起始復(fù)制的特異蛋白，但在成熟的病毒中，它被切成較小的蛋白保留在病毒中。3DNA的復(fù)制與修復(fù)腺病毒本身編碼一個(gè)80kD的蛋白，該蛋白和DNA聚合酶形成復(fù)合物。80kD蛋白末端絲氨酸＋dCTP→形成Protein-dCMP-OH其游離的3’-OH為DNApol延伸反應(yīng)提供引物。而在模板的5’末端有一分子量55kD的末端蛋白供80kDa蛋白識(shí)別，按CG堿基配對(duì)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)腺病毒感染細(xì)胞的過(guò)程：腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)粘附到細(xì)胞表面的特異性受體，病毒纖毛基底部五鄰體表面的三肽RGD與細(xì)胞表面的αvβ3和αvβ5整合素結(jié)合，通過(guò)內(nèi)吞作用將腺病毒內(nèi)化到細(xì)胞中并進(jìn)入溶酶體。在溶酶體中腺病毒衣殼的構(gòu)象發(fā)生變化，從溶酶體中釋放出來(lái)。腺病毒顆粒轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過(guò)核孔將DNA釋放到細(xì)胞核內(nèi)。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并啟動(dòng)病毒基因組的復(fù)制。腺病毒雙鏈DNA的每條單鏈的5’端有TP蛋白結(jié)合，TP通過(guò)其Ser-OH與DNA5’端的dCMP5’磷酸間形成磷酸二酯鍵。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)腺病毒的DNA復(fù)制首先是以5’端結(jié)合有TP的dCMP作為引物，以3’端的末端反向重復(fù)序列為模板，進(jìn)行鏈置換合成，置換出的單鏈分子可以自我退火環(huán)化，形成鍋柄樣環(huán)形分子，然后這種環(huán)形分子再以相同的機(jī)制合成出子代雙鏈DNA分子。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)環(huán)狀DNA的復(fù)制的末端終止階段則不存在問(wèn)題。環(huán)狀DNA復(fù)制到最后，由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切開(kāi)雙鏈DNA，將兩個(gè)DNA分子分開(kāi)成為兩個(gè)完整的與親代DNA分子一樣的子代DNA。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.2.5DNA復(fù)制的保真機(jī)制在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，DNA復(fù)制過(guò)程形成了一系列保真機(jī)制，保證復(fù)制準(zhǔn)確和遺傳穩(wěn)定。E.coli每復(fù)制109~1010nt便出現(xiàn)1個(gè)誤差。由于E.coliDNA有4.5×106bp，這樣每1000個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)1次分裂會(huì)產(chǎn)生1個(gè)錯(cuò)誤核苷酸。3DNA的復(fù)制與修復(fù)①堿基配對(duì)原則單純以堿基配對(duì)原則維持DNA復(fù)制準(zhǔn)確性時(shí)，誤差出現(xiàn)頻率約為10-5。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)②DNA聚合酶的校對(duì)作用當(dāng)新合成DNA中含錯(cuò)配核苷酸時(shí)，DNApol的3’→5’外切酶激活，切除錯(cuò)配核苷酸，重新聚合上正確的核苷酸。每個(gè)核苷酸的摻入有兩次被選擇機(jī)會(huì)，按堿基配對(duì)原則，錯(cuò)誤核苷酸摻入機(jī)率約為10-5，DNA聚合酶本身的校對(duì)作用又可使錯(cuò)誤核苷酸摻入的機(jī)率約為10-5。這樣每摻入一個(gè)核苷酸，發(fā)生錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)只有10-10。3DNA的復(fù)制與修復(fù)③RNA引物起始復(fù)制可減少?gòu)?fù)制錯(cuò)誤DNA合成起始時(shí)及岡崎片段合成開(kāi)始時(shí)都先合成一段未經(jīng)校對(duì)的RNA引物，RNA最終被切除可提高DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。④修復(fù)系統(tǒng)有多種機(jī)制和酶。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.3真核生物的DNA復(fù)制3.3.1研究真核生物DNA復(fù)制機(jī)制的選材一般選用結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的真核生物如：酵母、四膜蟲(chóng)以及真核病毒為材料。真核病毒DNA復(fù)制機(jī)制與真核染色體DNA復(fù)制相同，如SV40。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3.3.2真核生物的復(fù)制子復(fù)制時(shí)期在S期。3DNA的復(fù)制與修復(fù)①多復(fù)制起點(diǎn)真核和原核生物DNA復(fù)制的基本特征是相同的，但真核DNA比遠(yuǎn)比原核DNA大，且大多數(shù)真核生物是由多細(xì)胞組成的，因此在DNA復(fù)制上有所不同。3DNA的復(fù)制與修復(fù)3DNA的復(fù)制與修復(fù)真核生物的每一個(gè)染色體皆含有許多個(gè)復(fù)制子(replicon)，復(fù)制叉的移動(dòng)速度大約只有50bp/Sec?？赡茉蚴钦婧松锏腄NA與組蛋白構(gòu)成核小體，對(duì)復(fù)制叉的前進(jìn)造成阻礙。果蠅的復(fù)制整個(gè)基因體僅需3~4min。人類(lèi)DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，復(fù)制整個(gè)基因體需8h。3DNA的復(fù)制與修復(fù)②復(fù)制原點(diǎn)的特征接頭掃描突變3DNA的復(fù)制與修復(fù)酵母菌的復(fù)制起點(diǎn)稱(chēng)為ARS(autonomouslyreplicatingsequence)，有100多個(gè)bp。ARS由2個(gè)功能域組成：A功能域?yàn)锳RS的中心，可能是起始蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。A的序列為15bp，其中11bp為保守序列：(T/A)AAATA(T/C)AAA(T/A)；3DNA的復(fù)制與修復(fù)啤酒酵母的ARS分布在100～200bp的DNA序列中，ARS包括一個(gè)共有序列(A)和附加元件(B1~B3)。A元件在芽殖酵母中高度保守，是復(fù)制起始所必需的。其中有富含AT的11bp序列是復(fù)制起始識(shí)別復(fù)合物（originrecognitioncomplex,ORC）結(jié)合復(fù)制起始位點(diǎn)所必需的，對(duì)起始因子在復(fù)制起始位點(diǎn)的組裝起基本作用。3DNA的復(fù)制與修復(fù)B1元件緊靠A元件，也是ORC的識(shí)別序列。B2元件的功能還不清楚，可能參與雙鏈DNA的解旋。B3元件是轉(zhuǎn)錄因子Abf1的結(jié)合位點(diǎn)，可促進(jìn)DNA復(fù)制的起始。B功能域富含AT，可能是DNA熔鏈區(qū)。A元件決定哪一段DNA序列作為復(fù)制起始位點(diǎn)，B元件可以增加復(fù)制起始位點(diǎn)的效率。3DNA的復(fù)制與修復(fù)不同生物復(fù)制起始位點(diǎn)的共同特征多個(gè)短重復(fù)序列。重復(fù)序列被多亞基的復(fù)制起始位點(diǎn)結(jié)合蛋白識(shí)別，這些蛋白對(duì)于復(fù)制酶在復(fù)制起始位點(diǎn)的組裝起關(guān)鍵作用。復(fù)制起始位點(diǎn)附近一般都有富含AT的序列，以利于DNA雙鏈的解旋，產(chǎn)生DNA復(fù)制模板。3DNA的復(fù)制與修復(fù)ARS序列突變對(duì)復(fù)制有影響。真核生物Saccharomycescerevisiae有274個(gè)自主性復(fù)制序列（ARS）分布于16條染色體中。每一個(gè)復(fù)制子長(zhǎng)約36kb。3DNA的復(fù)制與修復(fù)多細(xì)胞生物的復(fù)制起始位點(diǎn)有多個(gè)，在基因組中的分布也不是隨機(jī)的。在基因組復(fù)制過(guò)程中只有一些復(fù)制起始位點(diǎn)起作用，這可能與染色體結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、生物發(fā)育過(guò)程和DNA甲基化等因素有關(guān)。例如在動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞周期的S期在胚胎期可以只有幾分鐘，而在成熟組織中可以長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)小時(shí)。DNA復(fù)制在S期的及時(shí)完成主要取決于有效復(fù)制起始位點(diǎn)的增加，而不是復(fù)制叉移動(dòng)速度的增加。3DNA的復(fù)制與修復(fù)復(fù)制起始位點(diǎn)可以決定基因組在S期復(fù)制的時(shí)間