（)基因工程首都師范大生命科學(xué)學(xué)院祁曉廷

（;qxt-）基因工程概述現(xiàn)代生物技術(shù)是解決人類面臨的困境的有效途徑基因工程概述基因工程的地位發(fā)酵工程

細(xì)胞工程酶工程

蛋白質(zhì)工程

基因工程基因工程概述常用生物技術(shù)舉例干細(xì)胞技術(shù)：

恩同再造，無(wú)論換器官還是重生?；蛑委煟?/p>

遺傳物質(zhì)的局部改變，亟待提高安全性。哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)：

開(kāi)啟了一個(gè)人類無(wú)法預(yù)知的克隆人的大門(mén)，是福是禍？全基因組測(cè)序：

遺傳天書(shū)編排才開(kāi)始，讀懂它尚需時(shí)日。單克隆抗體技術(shù)：

細(xì)胞全能性和細(xì)胞融合技術(shù)的完美結(jié)合?！?基因工程概述干細(xì)胞技術(shù)基因工程概述基因治療技術(shù)基因工程概述1997年多利羊誕生使體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物成為可能基因工程概述多利和它的孩子基因工程概述人類基因組計(jì)劃--人類基因的破解基因工程概述基因工程

現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的核心，是基因乾坤大轉(zhuǎn)移和大融合的技術(shù)基因工程概述基因工程概述基因工程應(yīng)用微生物發(fā)酵：制備工業(yè)原料、食品添加劑等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)：動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)改良，提高抗逆性醫(yī)藥業(yè)：基因工程制藥（抗生素、疫苗、抗體等）軍事：生物武器航天：提高生物耐缺氧、耐輻射等性狀?；蚬こ谈攀龌蚬こ谈攀龌蚬こ谈攀龌蚬こ谈攀鲋参锘蚬こ藺CC合成酶利用反義RNA技術(shù)，抑制乙烯合成的前體耐貯運(yùn)對(duì)于番茄、草莓、香蕉、蘋(píng)果等果蔬最為重要基因工程概述基因工程概述

這些東西最好也不要出現(xiàn)！基因工程概述基因工程概述微生物基因工程基因工程概述轉(zhuǎn)基因植物基因工程概述番茄子葉分化

轉(zhuǎn)基因番茄的移栽

田間生長(zhǎng)與結(jié)實(shí)

ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株HBsAg活性

轉(zhuǎn)基因番茄的PCR鑒定

乙型肝炎表面抗原在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達(dá)基因工程概述體細(xì)胞核移植制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本過(guò)程基因工程概述胚胎干細(xì)胞的篩選和細(xì)胞移植培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本過(guò)程基因工程概述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因工程概述工具酶的總結(jié)基因工程概述克隆載體基因工程概述載體（Vector）的概念添加復(fù)制起始位點(diǎn)、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子可以解決“單獨(dú)”的外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制表達(dá)甚至被降解的“杯具”。這一需求催生了--載體。

載體是攜帶外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)完成的復(fù)制甚至表達(dá)人工構(gòu)建的DNA分子?；蚬こ谈攀鲚d體的分類根據(jù)用途可以分為：

克隆載體：在宿主細(xì)胞內(nèi)高保真地大規(guī)模復(fù)制。測(cè)序載體：用于測(cè)定DNA序列。表達(dá)載體：用于外源基因的表達(dá)。盡管如此，“三合一”的載體目前經(jīng)常用。根據(jù)來(lái)源不同可以分為：質(zhì)粒載體，病毒載體，人工染色體基因工程概述載體的基本條件1、能自我復(fù)制并能帶動(dòng)插入的外源基因一起復(fù)制。2、具有合適的多種限制酶的單一切點(diǎn)。3、具有適宜的篩選標(biāo)記。4、相對(duì)分子質(zhì)量小，細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)要多。5、在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，易分離純化。基因工程概述載體結(jié)構(gòu)多克隆位點(diǎn)，容許外源基因插入的合法位點(diǎn)宿主細(xì)胞能識(shí)別的復(fù)制起始序列，如果含有兩種以上復(fù)制起始位點(diǎn)，則為穿梭載體篩選標(biāo)記：抗生素分解基因（Amp,Km等）、報(bào)告基因（GUS,GFP,LUC,LacZ）。這些基因多為組成型啟動(dòng)子控制，恒定表達(dá)。啟動(dòng)子（宿主細(xì)胞能識(shí)別的啟動(dòng)子）終止子（轉(zhuǎn)錄終止序列，多來(lái)自宿主細(xì)胞病毒和細(xì)菌）基因工程概述體外重組

重組DNA向宿主細(xì)胞導(dǎo)入基因工程概述RecombinantDNA基因工程概述重組重組是通過(guò)T4DNA連接酶將目的DNA片段插入到載體相應(yīng)位點(diǎn)的DNA重組過(guò)程。通過(guò)優(yōu)化連接參數(shù)可以獲得高的連接效果。具體如下：1.插入片段摩爾數(shù)要多于載體摩爾數(shù)（3-10倍）；2.平末端連接采用低溫（4-8度過(guò)夜），而黏性末端在室溫下連接幾小時(shí)或16度連接過(guò)夜。3.連接體系一般為10-20微升，體積過(guò)大過(guò)小會(huì)影響連接效率。4.可以用T4RNA連接酶連接單鏈的DNA分子?；蚬こ谈攀?/p>

體外重組線路圖基因工程概述導(dǎo)入重組體主要方法

物理學(xué)方法：微注射技術(shù)、基因槍技術(shù)、電轉(zhuǎn)化法（電穿孔術(shù)）、超聲波化學(xué)方法：CaCl2低滲轉(zhuǎn)化大腸桿菌、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、PEG介導(dǎo)生物媒介方法：病毒介導(dǎo)法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法基因工程概述

轉(zhuǎn)化原理基因工程概述

負(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)組正對(duì)照基因工程概述藍(lán)白篩選結(jié)果基因工程概述根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的方法1.根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)的一般性質(zhì)：

冠癭病Ti質(zhì)粒（Tumorinducingplasmid)T-DNA(TramsferredDNA)區(qū)Vir區(qū)

基因工程概述

*冠癭瘤的特點(diǎn)：

激素自主性冠癭堿幻燈片5無(wú)正常分化能力*農(nóng)桿菌與Ti－質(zhì)粒的類型：

章魚(yú)堿型（octopinetype）胭脂堿型（nopalinetype）農(nóng)桿堿型（agropinetype）

*冠癭堿可以分為四類：

章魚(yú)堿族胭脂堿族甘露堿族農(nóng)桿素基因工程概述基因工程概述OctopineVir

基因的基本結(jié)構(gòu)與功能基因工程概述A:a.中間載體必須有T-DNA的同源序列，還有pBR的序列，進(jìn)入農(nóng)桿菌后高頻同源重組b.要有細(xì)菌選擇標(biāo)記基因，便于篩選共整合質(zhì)粒c.陽(yáng)性的這選擇標(biāo)記基因d.單一的限制內(nèi)切酶切點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)e.無(wú)Ti質(zhì)粒的邊界序列f.要有bom位點(diǎn)序列，可以在不同細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移B.二元載體系統(tǒng)的中間載體特點(diǎn)：

a.無(wú)同源序列b.有LB和RBc.無(wú)cellEI復(fù)制點(diǎn)基因工程概述T-DNA的整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程基因工程概述缺失啟動(dòng)子-GUS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草

對(duì)照抗性芽（Km:100ug/ml）生根的轉(zhuǎn)基因煙草苗（Km:100ug/ml）

轉(zhuǎn)化煙草土培苗開(kāi)花的土培苗基因工程概述電轉(zhuǎn)化法（electrotransfortion）

也稱電穿孔術(shù)（electroporation）,是利用高壓脈沖瞬時(shí)放電，使電場(chǎng)中的細(xì)胞膜穿孔，位于溶液中的外源基因得以進(jìn)入細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)化率的因素很多，如：電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖的長(zhǎng)度、DNA的構(gòu)象和濃度、培養(yǎng)液的離子成分等，需摸索反應(yīng)條件，優(yōu)化各項(xiàng)參數(shù)。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖長(zhǎng)度以一定方式組合而導(dǎo)致50％～70％細(xì)胞死亡時(shí)，轉(zhuǎn)化的水平達(dá)到最高。

特點(diǎn)：無(wú)受體細(xì)胞特異性，動(dòng)、植物細(xì)胞，原核細(xì)胞均可；轉(zhuǎn)化率不穩(wěn)定，需摸索確定轉(zhuǎn)化條件；具有成套專用設(shè)備?；蚬こ谈攀鍪疽怆娂まD(zhuǎn)化基因工程概述微注射技術(shù)（microinjection）

用微吸管吸入供體DNA溶液，在顯微鏡下準(zhǔn)確插入受體細(xì)胞核中，并將DNA注射進(jìn)去。特點(diǎn)：多用于動(dòng)物細(xì)胞；注射過(guò)程慢，技術(shù)要求高；有成套專用設(shè)備。基因工程概述DNA顯微注射示意圖

基因工程概述圖示微注射轉(zhuǎn)化的應(yīng)用基因工程概述基因槍技術(shù)（geneblastertechnique）

利用一個(gè)高速推動(dòng)力，加速重金屬粒子運(yùn)動(dòng)，使附著在重金屬粒子上的外源DNA隨同重金屬粒子一起射入靶細(xì)胞或組織內(nèi)。一般把DNA包被在金粒或鎢粒上，用彈藥槍（化學(xué)推進(jìn)劑為動(dòng)力）和電子槍（以放電為動(dòng)力）為工具將粒子向受體細(xì)胞轟擊。特點(diǎn)：無(wú)宿主特異性；能直接向細(xì)胞器中輸入DNA；轉(zhuǎn)化有壁的植物細(xì)胞有效；已有多種類型基因槍可供選用，還在不斷改進(jìn)和發(fā)展?；蚬こ谈攀龌蚬こ谈攀鲋|(zhì)體介導(dǎo)法

（liposomemediatedgenetransfer）

脂質(zhì)體（liposome人工膜泡）是由脂質(zhì)雙分子層組成的環(huán)形封閉囊泡，無(wú)毒、無(wú)免疫原性。在體外，脂質(zhì)體作為基因載體可將基因轉(zhuǎn)化到細(xì)菌、真菌、植物原生質(zhì)體和動(dòng)物細(xì)胞。利用脂質(zhì)體導(dǎo)入基因，一般都要將DNA或RNA包囊于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進(jìn)行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合，通過(guò)融合導(dǎo)入細(xì)胞?；蚬こ谈攀鰣D示脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化基因工程概述篩選概述篩選是從眾多轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的DNA片段的陽(yáng)性克隆的過(guò)程。具體的篩選程序?yàn)椋篋NA導(dǎo)入宿主細(xì)胞?[抗性篩選,報(bào)告基因，營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選]轉(zhuǎn)化子?[藍(lán)白篩選]重組轉(zhuǎn)化子?[PCR篩選,核酸分子雜交，免疫選篩選]陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子?[測(cè)序]陽(yáng)性克隆基因工程概述目的基因在哪里？基因工程概述獲得目的基因的策略1.化學(xué)直接合成（短基因，有錢(qián)）。2.同源基因RT-PCR(或PCR)直接獲得（全或部分序列已知）。3.文庫(kù)篩選法(構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的通用文庫(kù)，采用核酸雜交或免疫學(xué)篩選基因)。4.從蛋白質(zhì)出發(fā)的目的基因（蛋白質(zhì)N端序列測(cè)序，隨后設(shè)計(jì)兼并引物聯(lián)合RT-PCR）。5.電子克隆（基于數(shù)據(jù)庫(kù)，步步為營(yíng)）6.全基因組測(cè)序后預(yù)測(cè)（結(jié)合表達(dá)譜芯片可以高通量獲得表達(dá)發(fā)生變化的目的基因種類及其相對(duì)變化水平）?；蚬こ谈攀龌蚬こ谈攀?/p>

元件基因元件—組裝成基因

載體元件—

多克隆位點(diǎn)克隆元件—

銜接物或人工接頭引物測(cè)序或PCR探針核酸分子雜交用基因工程概述化學(xué)合成基因工程概述基因工程概述基因序列已知基因工程概述同源蛋白基因基因工程概述文庫(kù)是將某一物種基因組DNA或cDNA以克隆的方式（質(zhì)?；蚴删w）保存在大腸桿菌中的方式。基因工程概述基因工程概述構(gòu)建cDNA文庫(kù)基因工程概述文庫(kù)篩選基因工程概述基因工程概述免疫學(xué)篩選基因工程概述目的基因表達(dá)基因工程概述目的基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)需具備如下幾個(gè)特點(diǎn)：1.完整的表達(dá)框（啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-目的基因-標(biāo)簽-轉(zhuǎn)錄終止子）。其中選擇組成型、組織器官特異性、發(fā)育特異性和環(huán)境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以控制目的基因的特殊表達(dá)模式的需求。原核表達(dá)需要用SD序列作為核糖體結(jié)合位點(diǎn)，而真核表達(dá)需要有帽子位點(diǎn)即可。2.控制表達(dá)水平，盡量減少蛋白產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的正常生活的干擾，產(chǎn)生分泌蛋白是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，3.為了方便檢測(cè)和純化蛋白產(chǎn)物，可以表達(dá)一個(gè)融合標(biāo)簽（HA、HISx6、C-Myc、Flag、GST等）。基因工程概述原核表達(dá)體系基因工程概述真核表達(dá)體系基因工程概述體外轉(zhuǎn)錄翻譯體系基因工程概述表達(dá)載體基因工程概述SDSofthelysateofuninducedandinducedhostbacteria

E.coli

BL21(DE3)containingthecontrolexpressionvectorortherecombinantexpressionvectorandthepurifiedrecombinantprotein.

M

proteinmarker,

1

lysate