鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)方法DetectionmethodofSugarcanestreakmosaicvirusbyreal-timereverse國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局I1cDNA:與RNA鏈互補(bǔ)的單鏈DN異性的熒光雙標(biāo)記水解型寡核苷酸探針(TaqMan探針)。首先利用反轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA反轉(zhuǎn)成cDNA,再以cDNA為模板在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行實(shí)解型寡核苷酸探針(TaqMan探針);升降溫速度≥2度范圍4℃~100℃。24.4高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：離心力12000g以上。4.6無(wú)核酸酶(Nuclease)的1.5mL、2.0mL離心管，PCR反應(yīng)管、帶濾芯Tip頭、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管。4.7恒溫水浴鍋。4.8鼓風(fēng)干燥箱。4.9冰箱：2℃~8℃、-20℃、-80℃。4.10生物安全柜。5試劑與材料除非另有規(guī)定外，在分析中僅使用分析純?cè)噭瑢?shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682的二級(jí)水指標(biāo)，其中涉及PCR的用水要求達(dá)到一級(jí)水指標(biāo)。5.1.2異丙醇。5.1.3無(wú)水乙醇5.1.5裂解液：主要成分為是硫氣酸胍和苯酚，為RNA提取試劑。3'-引物。-GCGATTTcTGCTGGTGAGa擴(kuò)增片段大小為130bp5.1.8水解型寡核苷酸探針(TaqMan探針)5'-FAM-TGCTGCATTGATTTCGTGAT5.1.9用于一步法的夷光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合液包括一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液、5'-引物、3'-引物、水解型寡核苷酸探針(TaqMan探針)、逆轉(zhuǎn)錄酶混合液、ExTagHSDNA聚合酶等，具體配制方法見(jiàn)附錄B。5.2材料5.2.1陽(yáng)性對(duì)照：用已知含甘蔗條紋花葉病毒的甘蔗樣品作陽(yáng)性對(duì)照。5.2.2陰性對(duì)照：用已知不含甘蔗條紋花葉病毒的甘蔗樣品作陰性對(duì)照。5.2.3空白對(duì)照：用無(wú)核酸酶的無(wú)菌一級(jí)水代替樣品。6樣品的采集與前處理6.1取樣工具準(zhǔn)備砍刀、剪刀、鑷子等取樣工具應(yīng)經(jīng)121℃±2℃、1.1×10?Pa高壓滅菌15min或經(jīng)160℃于熱滅菌3采樣工具用75%乙醇進(jìn)行消毒。采集或處理的樣本在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)-24-h;若需長(zhǎng)期保存，要求放置-80℃冰箱，7.1.1RNA提取應(yīng)在樣品處理區(qū)進(jìn)行。取15mL無(wú)核酸酶(Nuclease)離心算，并對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)。7.1.3向1.5mL常心管中加人份未，等液氮?jiǎng)倱]零完章職加人1m裂解報(bào)，充分混勻，室溫下靜置7.1.5取上清液轉(zhuǎn)入另一新的15m離心管，加入等體積異丙醇，空溫靜置10min,4Q.12000g7.1.6棄上清液，加入1ml.5%乙醇洗棄上清液，加入1mL無(wú)水乙醇洗滌，爭(zhēng)4Ci200g離心10min.洗滌流淀一大，室溫晾干7.1.8加入50μL無(wú)核酸酶的水溶解，提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，若需期保存，應(yīng)放置7.1.9使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)上測(cè)260nm和280m處的吸光值A(chǔ)z?o和Aza?,并估算=A?60×N×40/1000……………(1)7.2.1實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)應(yīng)在核酸檢驗(yàn)區(qū)進(jìn)行。從試劑盒中取出熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈7.2.3在各設(shè)定的實(shí)時(shí)熒光PCR管中分別加入待測(cè)的RNA樣品2.0μL(RNA約100ng),蓋緊管蓋線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。采用感染了甘蔗條紋花葉病毒的甘蔗葉片總酸酶的無(wú)菌一級(jí)水代替模板RNA作空白對(duì)照。Ct值大于35.0且小于40.0,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣本應(yīng)進(jìn)行重做檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)5(資料性附錄)約10kb。甘蔗條紋花葉病毒主要為害葉片，以新葉基部癥狀最為明顯。病葉上有許多6ExTagHSDNA聚合酶(5U/μL)注1:PCR反應(yīng)體系中各種試劑的使用量可根據(jù)具注2:可采用商品化試劑盒進(jìn)行樣本熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磘hedetectionandquantitationofSugarcandphylogeneticrelationshipsofanewpotyvirus:sugarcanestreakmosaicvirus,andareetheclassificationofthePotyviridae.MolecularPhylogeneticsandEvolution,1998,10:[3]HemaM,JosephJ,GopiinterviralrelationshipsofaflexuousfilamentousviruscofficinarumL.)inIndia.ArchiveofVirology,1999,144:479-490.[4]HeZ,YasakaR,LiW,LiS,OhshimaK.GeneticstructureofpopulationsstreakmosaicvirusinChina:ComparisonwiththepopulationsinIndia.VirusResearch,2016,nomicvariabilityandmolecularevolutionofAsianisolatesofSugarcofVirology,2016,161:1493-503.[6]ViswanathanR,Balamura