T/CSBMT/CSBM0050.4—2024創(chuàng)面修復(fù)材料有效性評(píng)價(jià)第4部分：體外微血管形成試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法EffectivenessevaluationofwoundrepairmaterialsPart3:Invitromicroangiogenesisevaluationmethod中國生物材料學(xué)會(huì)發(fā)布I 3 4本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起本文件起草單位：杭州英健生物科技有限公司、中國食品藥品檢定1本文件適用于適用于創(chuàng)面修復(fù)材料促進(jìn)創(chuàng)面微血2規(guī)范性引用文件T/CSBM0050.1—2024創(chuàng)面修復(fù)材料有效性評(píng)價(jià)第1部分：水溶性T/CSBM0050.2—2024創(chuàng)面修復(fù)材料有效性評(píng)價(jià)第2部分：水不溶性材料4樣品制備5血管形成試驗(yàn)25.2.1器具m)基質(zhì)膠；5.2.2試劑和耗材b)磷酸緩沖液（PBS5.2.3細(xì)胞系5.3.1試驗(yàn)樣品5.3.2空白對(duì)照MEM低糖培養(yǎng)基，37℃、120r/min搖床中震蕩24h。5.4.1.1細(xì)胞復(fù)蘇將EA.HY926細(xì)胞凍存管于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)不斷晃動(dòng)，待細(xì)胞凍存液完全溶解，將凍存的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)，隨后加入MEM低糖培養(yǎng)基，用無菌巴氏吸管吹打均勻后1000r/min離心3min。5.4.1.2細(xì)胞傳代3當(dāng)細(xì)胞密度約為80％時(shí)，吸去培養(yǎng)瓶中原有的培養(yǎng)基，使用PBS輕洗兩次，加入1mL～2mL0.25%胰蛋白酶消化3min～5min，顯微鏡觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)，手指輕叩細(xì)胞瓶身，肉眼可見細(xì)胞脫落，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入一定量的MEM低糖培養(yǎng)基終5mLMEM低糖培養(yǎng)基，將細(xì)胞重新混懸，取適量混勻的細(xì)胞懸液于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代比例為1：4，2天～3天5.4.1.3細(xì)胞凍存然后將混勻的細(xì)胞懸液放入凍存管中，每管1mL，凍存密度為1×105/mL～1×106/mL。凍存管上應(yīng)標(biāo)明5.4.2小管形成試驗(yàn)d)待細(xì)胞融合至80％左右時(shí)，將細(xì)胞消化、離心并分別用試驗(yàn)液和空白對(duì)照小管形成試驗(yàn)結(jié)果：在觀察時(shí)間內(nèi)血管形成情況的描述，并免疫熒光染色結(jié)果：評(píng)價(jià)血管網(wǎng)形成的數(shù)量和血管形成的總長度，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)方法，料促進(jìn)血管形成的效果，并給出免疫熒光染色的結(jié)果圖片。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析試驗(yàn)組和空白對(duì)照組比較p<4A.1器具、試劑和耗材、細(xì)胞系A(chǔ).2.1浸提液制備A.2.2空白對(duì)照5MEM低糖培養(yǎng)基，37℃、120r/min搖床中震蕩24h±2h。A.3試驗(yàn)步驟A.3.1EA.HY926細(xì)胞培養(yǎng)按5.4.1進(jìn)行。A.3.2小管形成試驗(yàn)按5.4.2進(jìn)行。A.4血管形成試驗(yàn)結(jié)果A.4.1小管形成試驗(yàn)結(jié)果各組細(xì)胞分別加入處理后的樣品重懸，隨后接種到鋪板基質(zhì)膠的24孔板中培養(yǎng)9h,觀察各組血管結(jié)構(gòu)在不同時(shí)間的的生成情況。細(xì)胞剛接種時(shí)大多呈圓形，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞開始長出偽足，與相鄰細(xì)胞相連；3h時(shí)，部分細(xì)胞由圓形伸展為長梭形，部分細(xì)胞間逐漸建立連接；6h時(shí)，細(xì)胞多數(shù)于周圍細(xì)胞建立連接，線樣結(jié)構(gòu)增多且細(xì)胞逐漸形成管狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)；隨著時(shí)間的延長，形成的線樣結(jié)構(gòu)逐漸斷裂，細(xì)胞逐漸聚集，小管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量減少。×100顯微鏡下不同時(shí)間小管形成情況見圖A.1。樣品組圖A.1×100顯微鏡下不同時(shí)間小管形成情況A.4.2免疫熒光染色結(jié)果管狀形成反映了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外小管形成能力，樣品浸提液與對(duì)照組相