DB12RT-PCRassayfordetectionofporcinedeltacoronavirus天津市市場監(jiān)督管理委員會發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給1豬德爾塔冠狀病毒RT-PCR檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬德爾塔冠狀病毒（porcinedeltacoron儀器設(shè)備與試劑、樣品對照、方法步驟和結(jié)果判定等技本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬腸內(nèi)容物、糞便以及細(xì)胞培養(yǎng)物中PDCoV核PDCoV：豬德爾塔冠狀病毒（porcinePCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreactRT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscription-polymerRNA：核糖核酸（ribonucleicTaq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribM-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurinelPBS：磷酸緩沖液（phosphatebuffersolution）TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液（trisacetate-EDTAbuffPDCoV是一種RNA病毒。RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA可作為PCR模板進行擴增。根據(jù)PDCoVM基因保守基因伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA。依據(jù)PCR試驗結(jié)果，判斷樣品中是否含有PD4主要儀器設(shè)備2聚合酶、dNTP、DL2000DNAMarker、核酸染料、磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/L，pH7.2）、TAE電PDCoVM基因PCR擴增方法所用引物見表1.5mL離心管、剪刀、鑷子和棉拭子，經(jīng)121(±2）℃,15min高壓滅菌，50℃~60℃烘干備用。將采集的樣品放入保溫箱中，加入干冰，密封，24h內(nèi)送至實腸組織及腸內(nèi)容物：剪碎，用組織研磨機充分研磨，并按照質(zhì)量體積比1:5加入PBS，凍融3次，轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物：凍融3次，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，4000rpm/m37.2.2向各管中加入200μL2℃~8℃預(yù)冷的氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置5min。dNTP2μL，隨機引物1μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL條件為：30℃10min，42℃1h，99℃5min。得到的cDNA溶液直接用于下面的PCR擴增或者-20℃凍dNTP2μL，上游引物P11μL，下游引物P21μL，cDNA4μL將PCR擴增產(chǎn)物8μL與2μL上樣緩沖液混合，點樣于1％瓊脂糖凝膠板加樣孔中，瓊脂糖凝膠板一），45A.1PBS緩沖液A.1.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉71.6g，加適量滅菌去離子水溶解，定容至1000A.1.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉27.6g，加適量滅菌去離子水溶解，定容至1000A.1.3量取0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液36用滅菌去離子水溶解稀釋至1000mLA.250×TAE電泳緩沖液A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）A.2.2TAE電泳緩沖液（50×)0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(