臨床科研(kēyán)基本方法

共一百五十三頁學習(xuéxí)篇共一百五十三頁一、提高(tígāo)心智生活水平

（自我教育能力）

從哲學觀點來說，所謂心智生活水平包括二個方面：

心靈(xīnlíng)生活——“心靈愉悅”，表示學習知識的樂趣心智生活

智力生活——“智力快樂”，表示運用智力的樂趣共一百五十三頁二、科研(kēyán)意識培養(yǎng)科研機遇平等，結果不同！善于對事物(shìwù)的細微觀察好奇性

學—問—思—辨—行！共一百五十三頁三、培養(yǎng)強烈的創(chuàng)新(chuàngxīn)意識——民族生存(shēngcún)的靈魂，國家興旺的源泉！——個人事業(yè)不斷進取的關鍵共一百五十三頁四、培養(yǎng)創(chuàng)新科研意識(yìshí)

——創(chuàng)新貫徹科研活動的始終

設計(shèjì)創(chuàng)新方法理論成果藝術包裝營銷方式、渠道管理體制共一百五十三頁

創(chuàng)新性是一切(yīqiè)科研工作的生命，是科學發(fā)展的動力

臨床科研(kēyán)的創(chuàng)新性、科學性與求異思維共一百五十三頁（一）創(chuàng)新(chuàngxīn)的本質

在人類物質文明、精神文明(jīnɡshénwénmínɡ)的一切領域，一切層面上能先于他人，見人所未見，思人所未思，行人所未行，從而獲得人類文明的新發(fā)展、新突破。共一百五十三頁

（二）創(chuàng)新(chuàngxīn)的思想源泉

是求異思維，敏于生疑，敢于存疑，勇于質疑(zhìyí)。由此就能不斷地產(chǎn)生新異的、多彩的、多元的發(fā)展性、創(chuàng)新性、突破性的新構思、新思想、新思維。共一百五十三頁（三）科學(kēxué)的本質

是人類世世代代以每個人的有限認識能力，去探究無限的外界客觀存在和客觀規(guī)律的一個永無止境的過程。科學又總是后人(hòurén)不斷發(fā)現(xiàn)前人認識中的缺陷、不足、錯誤，并予以修正、補充，乃至推翻其中某些錯誤結論而前進、而發(fā)展的。共一百五十三頁（四）科學精神(jīngshén)的內(nèi)涵包含五大要素：客觀的依據(jù)理性的懷疑(huáiyí)多元的思考平權的爭論實踐的檢驗

“疑”字是核心，是關鍵。理性的懷疑，不疑不會有異，無異不會有新。只有：生疑→存疑→質疑，才能有新發(fā)現(xiàn)，新發(fā)明。求異思維從孩童期培養(yǎng)。共一百五十三頁五、科學精神(jīngshén)，“疑”為核心客觀依據(jù)理性懷疑(huáiyí)多元思考平權爭論實踐檢驗疑為核心敏于生疑敢于質疑勇于質疑娃娃抓起共一百五十三頁六、求異思維(sīwéi)是創(chuàng)新源泉逆向思維(sīwéi)異位反思自主思維排憂思維共一百五十三頁七、文化底蘊是生疑(shēnɡyí)的物質基礎

共一百五十三頁八、創(chuàng)新(chuàngxīn)與繼承的關系創(chuàng)新是最佳(zuìjiā)的繼承繼承為了更好的創(chuàng)新共一百五十三頁緒論(xùlùn)篇共一百五十三頁

一、醫(yī)學(yīxué)研究的概念

疾病(jíbìng)健康認識并掌握客觀規(guī)律采取增進健康防治疾病的一切探索性措施防止促進共一百五十三頁研究(yánjiū)目的(mùdì)完成具體工作方案最大效益本專業(yè)知識、相關專業(yè)知識流行病學、生物統(tǒng)計學、社會科學、分子生物學、免疫學等基本原理方法理論層次邏輯層次分析綜合哲學層次歸納演繹感性認識理性認識最小代價臨床科研設計示意圖經(jīng)驗層次二、科研設計共一百五十三頁循證醫(yī)學(yīxué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(yīxué)的比較基礎（病理(bìnglǐ)、生理）理論知識指導（個人）臨床經(jīng)驗基礎指導客觀（實驗）證據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)學循證醫(yī)學三、循證醫(yī)學共一百五十三頁循證醫(yī)學(yīxué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(yīxué)的特征比較合格臨床醫(yī)生：臨床經(jīng)驗與相關技能是必要條件，但非充分條件；累積(lěijī)經(jīng)驗，掌握疾病機理是必要的，但未經(jīng)嚴謹設計研究的“臨床經(jīng)驗和“理論”不能作為指導臨床實踐的充分依據(jù)；依據(jù)病理生理學原理進行診斷，有時可能有誤；非系統(tǒng)臨床經(jīng)驗是判斷預后、療效及評價的可靠途徑；掌握發(fā)病機制和病理生理原理足以指導臨床實踐；循證醫(yī)學傳統(tǒng)醫(yī)學共一百五十三頁循證醫(yī)學(yīxué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(yīxué)的特征比較掌握獨立準確評價證據(jù)的方法，對正確認識和引用某些文獻的研究結論至關重要！成本(chéngběn)—效益是考慮診療的重要因素。熟練的技能與臨床經(jīng)驗是指導實踐的基礎，可以評價新的診療方法；較少考慮成本—效益與衛(wèi)生經(jīng)濟學。循證醫(yī)學傳統(tǒng)醫(yī)學共一百五十三頁四、臨床流行病學(liúxínɡbìnɡxué)定義

現(xiàn)代流行病學衛(wèi)生統(tǒng)計學臨床醫(yī)學設計把基本原理和方法引入采用嚴密(yánmì)的測量醫(yī)學經(jīng)濟學研究領域評價醫(yī)學社會學

結局病因患者個體患者群體診斷醫(yī)學事件的從擴大到藉以探索治療等診治研究特性研究（研究）預后臨床基礎學科預防共一百五十三頁五、醫(yī)學(yīxué)科研特點

人道主義問題應該(yīnggāi)前瞻性研究混雜因素多執(zhí)行研究的人多依從性問題標準化的處理措施不易保證多中心多層次問題宜采用序貫實驗方法（一）臨床醫(yī)學科研特點共一百五十三頁（二）基礎醫(yī)學科研特點結構與功能假設的提出機理的驗證結論的科學性（依據(jù)）結果的重復性設計(shèjì)的嚴密性操作的正確性樣本的代表性共一百五十三頁（三）預防醫(yī)學科研特點宏觀為主宏觀與微觀相結合調(diào)查的代表性（抽樣合理性）干預的客觀性統(tǒng)計(tǒngjì)處理恰當結論的重復性方法的先進性共一百五十三頁科研(kēyán)設計篇共一百五十三頁前言共一百五十三頁只有(zhǐyǒu)經(jīng)過正規(guī)科研設計才能得出正確結論1.傷寒:1880年由艾伯發(fā)現(xiàn)(fāxiàn)發(fā)現(xiàn)(fāxiàn)傷寒桿菌，16年后(1896年)開始廣泛應用，但過了66年(1962年)，才由南斯拉夫傷寒全國委員會通過現(xiàn)場(實驗)流行病學的研究方法，才作出適當評價。2.卡介苗:1921年問世，30年后(1951年)經(jīng)現(xiàn)場評價，才作出肯定結論。共一百五十三頁3.脊灰苗:1909年發(fā)現(xiàn)病原體，45年后（1954年）其疫苗問世，經(jīng)現(xiàn)場評價，才作出肯定評價。4.百日咳:1900年發(fā)現(xiàn)病原體(痰涂片)，用甲醛滅活制成疫苗，初期的研究結論互相矛盾，46年后(1946年)經(jīng)大規(guī)模現(xiàn)場調(diào)查1萬人，嚴格分組，最終證實其效果。5.英年早逝:2006年，一位權威性的作者誤報：中關村、北大、清華科研人員的平均年齡為53歲(2004年全國(quánɡuó)普查的平均年齡為73歲)。共一百五十三頁一、科研設計(shèjì)的一個基本原理

共一百五十三頁基本原理

必須盡量(jǐnliàng)使實驗效應(effect)是處理因素(treatmentfactor)所引起，即:

T→e共一百五十三頁二、臨床(línchuánɡ)科研設計的兩個基本原則

(一)兩組間非處理因素(yīnsù)均衡一致原則用公式表示如下：

共一百五十三頁基本原則的公式(gōngshì)表示T1+N1Te1+Ne1T2+N2Te2+Ne2N1=N2

T1T2:處理(chǔlǐ)因素Te1Te2:

T產(chǎn)生的效應

N1N2:非處理應素Ne1Ne2:N產(chǎn)生的效應共一百五十三頁例1食管癌的病因(bìngyīn)研究(病例對照研究)

居住年限病例組人數(shù)對照組人數(shù)合計10~25~30~35~>40合計1117311960138123026195113823475738111276西安市食管癌病例(bìnglì)與對照居住年限的均衡性檢驗

χ2=4.81，P＞0.05共一百五十三頁例2新生兒黃疸是否與母親(mǔqīn)臨產(chǎn)時

使用催產(chǎn)素有關？

1972年～1986年爭論14年，6篇支持，6篇反對。臺灣婦產(chǎn)科一位學者從1986年5月～12月按下列標準從就診病人中選取206例合格(hégé)病例，進行各種條件嚴格控制的前瞻性研究。

共一百五十三頁------研究(yánjiū)對象與研究(yánjiū)方法1．納入標準與排除標準隊列研究設計應規(guī)定(guīdìng)明確的納入與排除研究標準。納入標準：孕婦健康、胎兒足月、經(jīng)陰道生產(chǎn)，胎兒為單胎頭位，新生兒出生后至少能在嬰兒室觀察5天。排除標準：有溶血性疾病與低體重嬰兒。共一百五十三頁根據(jù)產(chǎn)婦(chǎnfù)的生產(chǎn)情況，206例分成三組:Ⅰ組：60例，完全由催產(chǎn)素導產(chǎn)；實際為暴露組，為暴露I組。

Ⅱ組：95例，自然生產(chǎn)加催產(chǎn)素催產(chǎn)；實際也是暴露組，為暴露II組。

Ⅲ組：51例，完全為自然產(chǎn)程，未用催產(chǎn)素，這為非暴露組。2．分組共一百五十三頁3．給藥方式(fāngshì)

靜脈點滴給藥，用含電解質的溶液溶解(róngjiě)催產(chǎn)素，催產(chǎn)素濃度為5U/500ml。

共一百五十三頁------結果(jiēguǒ)

三組研究對象的均衡性

作者把三個組之間可能影響研究結果的主要變量作了比較(bǐjiào)，結果表明這些影響因素在三組之間無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

共一百五十三頁表1三組(sānzǔ)之間主要變量的比較

變量I組II組III組性別（男/女）嬰兒體重（均數(shù)，g）孕期（周）母乳喂養(yǎng)（％）Apgar記分（1min/5min）器械助產(chǎn)率（％）硬膜外麻醉地美露AFP（ng/ml）28/32322840.1608.9/9.6282212634744/51327040.9558.7/9.3352311247825/26328639.9668.8/9.53312109288共一百五十三頁2.三組新生兒總血清(xuèqīng)膽紅素水平（計量資料）比較三組新生兒出生后第一、第三(dìsān)、第五天的總血清膽紅素，用ｔ檢驗處理，未見顯著差異（P＞0.05）（表2）。

共一百五十三頁表2三組(sānzǔ)新生兒的血清總膽紅素（10mg/dl，x±S）

時間Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組第一天第二天第三天4.9±1.59.2±2.29.9±2.85.1±1.79.1±3.09.1±3.44.9±1.49.6±2.510.0±3.3共一百五十三頁3.三組新生兒高膽紅血癥比例的比較(bǐjiào)（計數(shù)資料）

如果把1次或多次的血膽紅素值≧10mg/dl作為高膽紅素血癥，則三組新生兒之間的高膽紅血癥的比例，用χ2檢驗(jiǎnyàn)無顯著差異。如果把這個“界線”定為≧12mg/dl或≧15mg/dl，三組之間仍然沒有統(tǒng)計學上的差異（P＞0.05）（表3）。共一百五十三頁表3三組(sānzǔ)新生兒高膽紅血癥的發(fā)生率

血清膽紅素Ⅰ組（N＝60）Ⅱ組（N＝95）Ⅲ組（N＝50）人數(shù)%人數(shù)%人數(shù)%≧10≧12≧153917364.028.03.35634359.036.03.22617352.034.06.0共一百五十三頁------結論(jiélùn)由上述結果，作者認為如果(rúguǒ)生產(chǎn)過程中，使用的催產(chǎn)素量不多，輸入的溶液又含有電解質，也即如上述研究中的給藥方式，則新生兒高膽紅血癥與應用催產(chǎn)素無關。共一百五十三頁根據(jù)(gēnjù)設計原則提出的四種設計模式T與N四種(sìzhǒnɡ)不同關系的臨床設計方案﹡T1+N1e1+n1

﹡T2+N2e2+N2

﹡(正確)共一百五十三頁②T與N四種不同(bùtónɡ)關系的臨床設計方案﹡T1+N1e1+n1﹡T2+N2e2+N2﹡(正確)共一百五十三頁③T與N四種不同(bùtónɡ)關系的臨床設計方案﹡T1+N1e1+n1﹡T2+N2e2+N2

共一百五十三頁④T與N四種(sìzhǒnɡ)不同關系的臨床設計方案﹡T1+N1e1+n1

﹡T2+N2e2+N2

共一百五十三頁(二)對照、隨機、重復原則對照：是研究工作成敗之關鍵；對照組、試驗組必須保持均衡(jūnhéng)一致！可比性；是控制各種混雜因素的基本手段；正確的對照組可以平衡非處理因素對結果（e）的影響，使處理因素（T）的效應（e）充分表現(xiàn)出來，即T→e。共一百五十三頁隨機(suíjī)采用隨機化原則來分組、干預，是使各組間非處理因素均衡一致的主要方法，也是實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理的基礎；可以(kěyǐ)減少各種主、客觀因素造成的偏倚，減少系統(tǒng)誤差，從而提高實驗的準確性（即效度）；也是防止各種混雜因素的重要手段之一；隨機不等于隨意。共一百五十三頁重復(chóngfù)按對照組和試驗組都必須要保證一定的樣本含量，以控制隨機誤差，從而提高實驗(shíyàn)的精確度（即信度）。

?

（標準差）?x

(標準誤)=

N（樣本量）共一百五十三頁三、臨床(línchuánɡ)科研設計的三要素

臨床科研一般(yībān)是觀察或闡明某個或某些研究因素作用于研究對象而產(chǎn)生的效應或影響。因此，它的主要組成必然是:

研究因素研究對象三大要素

研究效應/影響共一百五十三頁（一）研究(yánjiū)因素根據(jù)研究目的而施加于研究對象并能產(chǎn)生效果的因素為研究因素/處理(chǔlǐ)因素。反之，與研究目的無關的其他因素都叫非處理(chǔlǐ)因素（如個體特征，環(huán)境特征，氣候特征等）。共一百五十三頁

1.研究因素的內(nèi)容：

(1)外界強加于研究因素的，如生物因素、理化因素、營養(yǎng)、藥物。

(2)研究因素本身就具有的某些特征，如性別、年齡、體重。

(3)研究對象體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生的有害因素，如遺傳、代謝、心理。

(4)醫(yī)生給予的干預因素。

2.研究因素的構成：單因素、多因素及不同水平

3.研究因素的強度(qiángdù)

4.研究因素的實施方法共一百五十三頁(二)研究(yánjiū)對象研究對象：是指研究因素作用的客體。選擇研究對象是一個十分重要的問題（1）正常人，在研究某項正常人指標或評價預防措施的效果時常用（2）病人

1.確定診斷標準，盡量采用客觀指標。如病理學、微生物學、免預學、X線、心電圖、內(nèi)窺鏡、斷層掃描等

2.多次核實(héshí)診斷

3.規(guī)定對象的納入和排除標準

4.確定對象的數(shù)量、分組的方法

5.對象的代表性

6.注意對象的病情，堅持采用輕癥患者的標準

7.用志愿者要慎重共一百五十三頁例1：“血管內(nèi)皮功能障礙對胰島細胞分泌(fēnmì)功能的影響”……研究對象:

納入條件年齡(niánlíng)：35－55歲無高血壓和糖尿病史無心、肝、腎及其他疾病

排除條件高血糖

II型糖尿病史糖耐量減低/空腹血糖正常

肥胖：按WHO1998年診斷標準：體重指數(shù)（BMI）正常<25BMI<超重/肥胖糖尿?。喊碬HO1990年II型糖尿病診斷標準。例2：經(jīng)常吸煙——平均至少1支/日，持續(xù)>1年偶然吸煙——平均<1支/日，持續(xù)>1年戒煙——停止吸煙>

1年共一百五十三頁(三)效應和觀察(guānchá)指標效應：是指研究因素作用于研究對象產(chǎn)生的結果，及觀察結果的指標。1選擇指標的條件

(1)指標的關聯(lián)性

(2)指標的客觀性，如隨機(suíjī)分組、采用多人盲法讀X片等

(3)指標的準確性（accuracy）、精確性（precision）即重復性

(4)指標的靈敏性（sensitivity）

(5)指標的特異性（specificity）

(6)指標數(shù)量適宜，主要采用能反映效應本質的指標

(7)明確各項指標觀察的統(tǒng)一要求，如觀察方法、時間、間隔、次數(shù)、期限、記錄方法等共一百五十三頁四、臨床(línchuánɡ)科研設計模式（一）臨床科研種類(zhǒnglèi)

1.觀察性研究（observationalstudies)2.試驗性研究(experimentalstudies)，即臨床試驗（clinicaltrials)。

3.多學科多中心研究（multiple-centerstudies）共一百五十三頁(二)臨床科研方法(fāngfǎ)匯總（1）觀察性研究設計病例報告描述性研究病例分析（臨床研究初級階段）經(jīng)驗總結觀察性研橫斷面研究究設計病例對照研究分析性研究（臨床研究深入階段(jiēduàn)）

隊列研究共一百五十三頁

病例(bìnglì)與對照不匹配成組匹配病例對照研究病例與對照匹配配對研究套式病例對照研究前瞻性

歷史性雙向性隊列(duìliè)研究共一百五十三頁

過去現(xiàn)在(xiànzài)將來收集隊列(duìliè)隨訪

收集隊列隨訪

回顧性前瞻性

雙向性隊列研究

共一百五十三頁（2）試驗性研究(yánjiū)設計

臨床研究的試驗性研究即臨床試驗，實際上可以把它看成是一種特殊類型的隊列研究。所不同的是研究者可以設計對照組和治療(zhìliáo)組并隨機化分組。

依據(jù)設計對照組的方法不同，臨床試驗設計方案可分為六種共一百五十三頁①隨機對照實驗(shíyàn)（RCT）

符合標準的研究對象研究對象隨機分組（合格對象）

有效試驗(shìyàn)組(實驗措施）無效有效對照組(對照措施）無效

共一百五十三頁②隨機對照雙盲試驗(shìyàn)（RCBT）

共一百五十三頁③交叉(jiāochā)試驗（COD）

試驗組實驗有效 （A組）措施無效研究合格隨機對象(duìxiàng)對象(duìxiàng)分組對照組對照有效（B組）措施無效

對照組對照有效（A組）措施無效 試驗組試驗有效（B組）措施無效洗脫期

共一百五十三頁④自身前后(qiánhòu)對照試驗

有效研究(yánjiū)合格試驗對象對象措施無效有效對照措施無效洗脫期共一百五十三頁⑤非隨機同期(tóngqī)對照試驗

（NRCCS）和歷史對照試驗

這兩個試驗的共同點是：對照組并非由隨機化方法決定，而是依據(jù)不同的地點、不同的時間來選擇。前者是指在不同醫(yī)院間選擇，后者是指不同時期的前后對照。這些對照組的選擇常存在(cúnzài)選擇性偏倚，兩組間的基線狀況往往不一致，從而影響結果的正確性，所以應用受到限制。共一百五十三頁⑥序貫試驗(shìyàn)不事先確定樣本含量；一個試驗一對受試者參加；實驗結束(jiéshù)立即進行結果分析；待可下結論時立即停止試驗。共一百五十三頁具體分析步驟如下：試驗前制定以下試驗標準：①有效標準SF/FS=r1=2時為有效，試驗藥可以接受（應用）②無效(wúxiào)標準SF/FS=r0=1時為無效，試驗藥不能接受③試驗結果的假陽性率ɑ和假陰性率β不應>5%，即ɑ=0.05，β=0.05共一百五十三頁表1冠心寧與某對照藥對心絞痛療效(liáoxiào)的結果病歷號試驗藥對照藥結果病歷號試驗藥對照藥結果1優(yōu)差SF9優(yōu)差SF2優(yōu)差SF10優(yōu)差SF3差優(yōu)FS11優(yōu)差SF4優(yōu)差SF12優(yōu)差SF5優(yōu)差SF13優(yōu)差SF6優(yōu)差SF14優(yōu)差SF7差優(yōu)FS15優(yōu)差SF8優(yōu)差SF共一百五十三頁繪制序貫試驗邊界圖：根據(jù)試驗標準①②③可在方格坐標紙上繪出序貫試驗邊界圖?？v坐標Y為SF數(shù)，橫坐標為n=SF+FS數(shù)。接受界限(jièxiàn)（上限）U：y=a+b×n拒絕界限（下限）U：y=-a+b×n共一百五十三頁共一百五十三頁（三）多學科或多中心(zhōngxīn)協(xié)作研究1.多學科研究是提高研究水平的有效方法，也是現(xiàn)代研究發(fā)展方向。2.多中心研究是指在不同地區(qū)、不同單位，同時開展某一項研究，以提高研究結果的論證強度。

注意：上述兩種研究方式必須事先要嚴格統(tǒng)一研究的各項規(guī)定、方法、指標、要求、時間(shíjiān)等，否則，將失去意義。共一百五十三頁

南方醫(yī)科大學研究生開題(kāití)論證報告書共一百五十三頁

學科專業(yè)：研究方向：課題名稱：課題來源：研究生姓名：導師姓名職務：研究時間：論證日期：

共一百五十三頁一、課題名稱（包括分題）二、選題依據(jù)（國內(nèi)外研究概況、水平和發(fā)

展趨勢(qūshì)，開展此課題研究的設想、特色或創(chuàng)新之處，主要參考文獻目錄和出處。

三、研究目的意義共一百五十三頁四、研究內(nèi)容(nèiróng)指標、技術路線及擬采取的研究方法（論述方法學的先進性、可能性及可靠性）五、主要技術關鍵及解決途徑（包括協(xié)作要求）六、研究進度及預期達到的指標共一百五十三頁七、課題研究(yánjiū)的支撐條件（具備的研究(yánjiū)條件、估算該題的工作量及所需經(jīng)費）八、參加論證人員（姓名、職務、工作單位）九、專家論證意見（對該課題的科學性、先進性及可行性進行評價，提出“同意開題或不同意開題”的結論性意見）共一百五十三頁國家(guójiā)自然基金申請書共一百五十三頁T2DM易感基因PPARGC1分子(fēnzǐ)機制及遺傳與環(huán)境交互作用的研究共一百五十三頁報告(bàogào)正文（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）1、項目的立項依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析，需結合科學研究發(fā)展趨勢來論述科學意義；或結合國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中迫切需要解決的關鍵問題來論述其應用前景。附主要參考文獻目錄）

研究意義

T2DM是一種由遺傳因素與環(huán)境因素聯(lián)合作用而導致機體以慢性高血糖為特征的一類增齡性、內(nèi)分泌、代謝異常綜合癥，為胰島素分泌不足或胰島素抵抗或兩者兼有所致。是最常見的一類慢性代謝性疾病(jíbìng)，嚴重威脅現(xiàn)代人類的生活質量，據(jù)WHO資料統(tǒng)計T2DM患者共一百五十三頁

近5000萬人，高居世界第二位，僅次于美國。按此計算，我國因T2DM所造成的直接經(jīng)濟損失和醫(yī)療負擔十分驚人。以上提示其對我國人民健康影響日趨嚴重。因此，預防和控制糖尿病已乘務當今預防醫(yī)學領域重要課題。然而迄今為止，糖尿病的確病因尚未充分闡明，其遺傳病因學十分復雜。為此開展我國的T2DM發(fā)生的分子機制，尋找致病易感基因。將為進一步開展功能基因研究，從基因角度及闡明2型糖尿病的發(fā)病機制和2型糖尿病的分子診斷，為基因預測提供科學依據(jù)和理論基礎；從遺傳與環(huán)境的交互作用(zuòyòng)的關系出發(fā)，探索其致病因素作用(zuòyòng)；無疑對闡明其病因及其發(fā)病機理，以至有效預防、控制、干預和治療糖尿病的發(fā)生發(fā)展都具有重要的意義。共一百五十三頁學術價值：

近年，隨著分子生物學理論及技術的發(fā)展，尤其是人類基因組計劃研究迅速進展和突破、基因定位技術經(jīng)驗的積累及統(tǒng)計分析方法的進步，使得2型糖尿病的分子遺傳學研究有了長足進展。闡明參與2型糖尿病的易感基因種類、特征及機制是2型糖尿病分子遺傳學研究的目標之一。目前比較常用的是采用候選基因的功能區(qū)或非功能區(qū)多態(tài)標記進行群體關聯(lián)分析，或是采用隨機DNA位點或候選基因的高雜合度非功能區(qū)多態(tài)標記進行家系分析。2型糖尿病受到遺傳基因與環(huán)境條件的雙重調(diào)控(diàokònɡ)。不同遺傳背景的人群糖尿病易感性的主效基因可能有較大的差異。以往在不同群體進行易感基因的關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，同一易感基因在不同群體中作用具有差異性。所以對于在其他人群所發(fā)現(xiàn)的易感共一百五十三頁

基因，在中國北方人中重新評價就顯得非常必要，探討易感基因的分子機制在T2DM發(fā)病中的作用及其影響更有其特定的價值。研究遺傳與環(huán)境因素的交互作用，可以進一步探討其致病的作用因素，為尋找(xúnzhǎo)致病線索提供依據(jù)。共一百五十三頁國內(nèi)外研究(yánjiū)現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析

國內(nèi)外研究證實人們采取基因組掃描、連鎖(liánsuǒ)分析和遺傳關聯(lián)的研究策略，篩查研究出的T2DM候選基因大約有500多個，其中有一些多態(tài)性可能與糖尿病的發(fā)生有關。我國對T2DM已進行近20個候選基因研究，發(fā)現(xiàn)至少10多個基因與T2DM有關聯(lián)。從國內(nèi)外已發(fā)表的T2DM連鎖位點分布可看出：與T2DM可能連鎖的染色體位點分布非常廣泛。只找到位點，絕大多數(shù)位點尚未找到與T2DM相關的具體基因。位點不同人群、種族和國家重復性差。由此可見尋找中國人T2DM易感基因并探討其分子機制尤為重要。由于遺傳異質性的存在，不同群體中分子遺傳學的研究結果很難得到重復。肝細胞中特異表達的過氧化物酶體共一百五十三頁增殖物的激活受體γ輔激活因子1（PPARGC1），在T2DM胰島素抵抗（IR）發(fā)生機制中起關鍵作用，作為轉錄輔激活因子，由于其參與糖代謝、脂代謝、線粒體能量代謝的調(diào)節(jié)，與T2DM的病理機制十分吻合。在T2DM患者中，其表達量的異常改變具有特征性的病理學意義，從分子生理角度上提示其是研究T2DM的機制和應用治療的極好的切入靶點，被密切關注。為闡明PPARGC1在中國北方人群中與T2DM的風險貢獻，本研究采用基因組遺傳學研究方法對PPARGC1與T2DM分子遺傳機制進行初步探索。由于基因組DNA序列在出生后幾乎(jīhū)不改變，使得闡明的DNA突變可以通過人群資料的分析說明其與疾病的關系。絕大多數(shù)T2DM為散發(fā)型，對于復雜的多基因疾病，從散發(fā)群體樣本出發(fā)，通過T2DM遺傳學研究中使用最廣泛的“病例-對照”研究尋找中國北方漢族人群中T2DM的易感基因成為可行性措施。共一百五十三頁

近年來，PPARGC1中基因突變與T2DM的關系，在丹麥、日本、法國高加索人群、Pima印度安人、英國、奧地利、德國和荷蘭人群中進行了研究。雖然由于遺傳背景的差異(chāyì)，不同群體中得到的結果不完全一致，但多群體中PPARGC1與T2DM的發(fā)生整體上存在關聯(lián)，丹麥人群中使用聚合酶鏈反應-單鏈擴增多態(tài)性（PCR-SSCP）方法結合測序驗證，發(fā)現(xiàn)了七個突變位點：Ser74Leu，IVS2+52C>A，Asp475Asp，Gly482Ser，Thr528Thr，Thr612Met。其中Gly482Ser與T2DM有關聯(lián)。（EkJ,AndersonGetal,2001）日本人群中，通過PPARGC1基因掃描SNP后發(fā)現(xiàn)三個多態(tài)性位點：IVS4-11T>C，Thr394Thr和Gly482Ser。Gly482Ser與T2DM有關聯(lián)以及The394Thr-Gly482Ser單體型與T2DM有關聯(lián)。（HaraK,TobeK,OkadaTetal,2002）,在Pima印度安人群中也證明了Gly482Ser突變與T2DM存在關聯(lián)。共一百五十三頁繼丹麥、日本及Pima印度安人后，本研究對此基因與中國北方人群的T2DM發(fā)病關系也進行初步探索，并發(fā)現(xiàn)PPARGC1的Gly482Ser突變能顯著增加中國北方人群的T2DM發(fā)病風險，在男性中此趨勢更為顯著。由于此基因全面系統(tǒng)研究較少，基于前期遺傳學工作基礎，確證研究包括其突變基因對功能的影響和連接啟動子調(diào)控區(qū)序列變異對表達的影響，從兩個(liǎnɡɡè)方面探討PPARGC1與T2DM中胰島素抵抗關系的研究仍為空白。T2DM既受遺傳因素的影響同時受環(huán)境因素的制約，傳統(tǒng)研究交互作用應用的方法是病例對照研究，但應用病例對照研究進行基因—環(huán)境交合作用的研究需要很大的樣本量，同時一些潛在的因素可能會對研究結果有較大的影響。

近幾年來，研究者提出，可以用其他的研究方法進行基因—環(huán)境交互作用的研究，例如無對照病例研究共一百五十三頁（case-only）,病例—親本研究（case-parentalstudy）等。它對于交合效應的估計要比傳統(tǒng)病例對照(duìzhào)研究更精確，而且將有更大的把握度檢驗交互作用的存在。同時，采用無對照(duìzhào)病例研究探索基因與環(huán)境交互作用，可以使研究的樣本量也成本顯著降低，另外，可以避免由于采用對照(duìzhào)可能引入的各種偏倚。無對照(duìzhào)病例研究也存在其自身的不足，首先，無對照(duìzhào)病例研究是基于交互作用的RR乘法模型的，它只能對交互作用是否偏離RR值乘法模型進行檢驗。其次，無對照病例研究假設遺傳與環(huán)境之間相互獨立，研究者也常常將這種假設作為默認前提。但在有些情況下，這個假設不能成立。另外，從其統(tǒng)計分析的過程可以看出，無對照病例研究只能檢驗基因與環(huán)境交互作用是否存在，并估計其交互效應的大小。因為沒有對照，無法估計遺傳和環(huán)境因素的主效應。共一百五十三頁遺傳因素在2型糖尿?。═2DM）的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。T2DM是一種多基因病，其遺傳模式有主效基因、微效基因和單基因等模式。尋找T2DM易感基因的策略主要有基因組掃描、連鎖(liánsuǒ)分析和遺傳關聯(lián)研究。近年來，應用這些遺傳學分析方法人們發(fā)現(xiàn)了一些與T2DM易感性關聯(lián)的染色體區(qū)域和基因，并取得了長足的進展，但對于臨床實踐的要求仍然是杯水車薪，我們相信隨著分子遺傳學技術的發(fā)展和人類基因組計劃的完成，人們必將找出更多的與T2DM密切關聯(lián)的易感基因，為解釋和闡明T2DM的遺傳病理機制提供新的線索，指導糖尿病的預防和治療。雖然遺傳流行病學的證據(jù)提示2型糖尿病的發(fā)生具有較強的遺傳基礎，但因在最近10～20年內(nèi)人類的遺傳背景不會出現(xiàn)非常大的變化，糖尿病患病率的顯著增高只能用環(huán)境因素的變化來。目前，世界各國2型糖尿病患病共一百五十三頁率明顯增高的主要因素為生活方式的變化（如熱量攝入增加和體力活動減少）所導致的超重和肥胖；在病因學上，生活方式的改變對糖尿病患病率的影響可歸結為環(huán)境因素的影響

在T2DM實際研究中，人們(rénmen)采用不同的基因與環(huán)境交互作用分析方法進行研究。例如：病例對照研究，主要采用多因素Logistic回歸的統(tǒng)計學方法、單純病例研究、不完全病例對照研究、叉生分析法等。目前在實際研究中還存在一些問題，例如：基因易感性檢測的替代方法還存在一定的局限性；還需要進一步加大估計交互作用的樣本量。但是隨著分子遺傳學技術的不斷發(fā)展，基因與環(huán)境的交互作用必將成為研究T2DM的好方法。群體遺傳學統(tǒng)計分析方法，計算相應遺傳信息量；進行多因素群體遺傳學研究，了解T2DM基因與傳遞模式及在家族中遺傳傳遞規(guī)律。以候選基因為標記，與傳遞模式及在家族中遺傳傳遞規(guī)律。以候選基因為標記，共一百五十三頁2、項目研究內(nèi)容、研究目標以及擬解決(jiějué)的關鍵科學問題（此部分內(nèi)容為重點闡述）

項目的研究內(nèi)容：

2型糖尿?。═2DM）發(fā)病率居世界第三位，屬多基因復雜性疾病，其發(fā)病機理受環(huán)境因素與遺傳因素的綜合作用且具有高度異質性。為開展T2DM發(fā)病的分子機制研究，分離鑒定相關致病易感基因，進行T2DM遺傳家系現(xiàn)場流行病學調(diào)查(diàochá)工作。在中國北方地區(qū)收集200個T2DM和IGT遺傳家系、散發(fā)T2DM和IGT500人和健康500人份的血樣和環(huán)境因素資料。進行家系遺傳和表型信息收集及血生化指標測定工作，運用擬對有關聯(lián)的編碼基因標記按染色體分型，采用基因組改良掃描方法進行實驗室分型。對無關聯(lián)編碼基因標記，選用相應數(shù)量的微衛(wèi)星進行特定染色體掃描，尋找疾病候選位點。共一百五十三頁

同時利用PCR—RFLP分子生物學技術的實驗方法驗證已存在候選陽性基因PPARGC1的多態(tài)性。通過SAGE3.0等軟件對基因分型結果做兩點或多點的連鎖、連鎖不平衡分析及家系內(nèi)基因傳遞與分離的TDT分析，以便確定染色體不同位點與疾病(jíbìng)的相關性。為闡明T2DM病因及發(fā)病機理，指導臨床預防和治療提供重要依據(jù)。共一百五十三頁1、完成T2DM家系血樣、家系遺傳和表型信息的收集以及血生化指標測定工作。2、證實易感基因突變的臨床意義的分子研究；case-control確定易感基因與疾病相關關系和風險數(shù)值；3、闡明2型糖尿病易感基因PPARGC1的分子機制及其對T2DM的影響；4、通過Logist回歸及神經(jīng)網(wǎng)絡模型及叉生分析進行危險因素的遺傳與環(huán)境的交互作用分析，根據(jù)數(shù)據(jù)具體情況采用(cǎiyòng)相對應的分析方法；研究(yánjiū)目標：共一百五十三頁5、通過群體關聯(lián)分析和家系傳遞分析進行人群與T2DM遺傳易感性的研究；6、同時在家系研究方面進行有益的探索，從分子(fēnzǐ)角度闡明2型糖尿病的發(fā)病機理，為2型糖尿病的基因預測提供科學依據(jù)。廣泛應用于糖尿病的預防與治療，在條件允許的情況下應用于臨床診斷。共一百五十三頁

擬解決(jiějué)的關鍵科學問題：1.進行本課題工作所面臨的最主要的問題，就是采用什么樣的策略進行易感基因篩查工作，國內(nèi)外此領域的研究者經(jīng)過多年經(jīng)驗，目前認為，對于多基因復雜性疾病，其最主要的易感基因研究策略不能單純效仿單基因疾病或單表型形狀決定基因的尋找模式。

2.T2DM發(fā)病過程中，每個基因參與發(fā)病程度不等，大多數(shù)基因以微效基因模式參與其中，每個基因只是賦予個體某種程度的易感性，就每個易感基因而言均非發(fā)病所必須；而且，個基因可能通過各自不同的途徑或發(fā)揮不同作用參與發(fā)病過程；最后，各基因致病效應之累積結合環(huán)境因子的作用構成個體的T2DM的易感性。共一百五十三頁3.由于其主要以散發(fā)的形式在群體(qúntǐ)中流行，并且本質的病因學起源各異，因此，基于經(jīng)典家系資料樣本利用分子標記進行連鎖分析定位克隆的策略是不夠妥當?shù)?。另外，由于大多?shù)T2DM的發(fā)病年齡集中在中青年以后，并且有增齡性的發(fā)生趨勢，由于人類的整體壽命的上限限制，多代患者間同時存在T2DM發(fā)生的幾率很低。因此，從風險等位基因在多代間的傳遞規(guī)律上分析基因的T2DM易感性，也是受到限制的，一般情況不只能進行到2代間分子標記的傳遞研究。4.“病例—對照”研究是預防醫(yī)學領域中流行病學的經(jīng)典研究策略，不同于經(jīng)典遺傳學的理論，它研究的是在現(xiàn)實群體中，某種疾病相關的環(huán)境因素或遺傳性內(nèi)因的暴露和該疾病的人群分布狀態(tài)，通過該策略，最終擬解決的問題，是該人群不同程度下暴露的環(huán)境因素或遺傳性內(nèi)因與疾病的關系，并且希望得到的是適合于指導本人群中絕大多數(shù)人進行疾病預防和早期干預的信息。共一百五十三頁5.對于人群中現(xiàn)實存在的復雜多基因疾病的易感基因篩查，由于該疾病的特點，決定了預防醫(yī)學學科和生物學學科的相互滲透(shèntòu)和結合。應運而生地，基于隨機群體中收集的T2DM患者和正常NGT對照人群資料進行“病例—對照”研究，是現(xiàn)代國際上尋找人群中的T2DM分子病因學因素的主流策略。同時考慮遺傳與環(huán)境交互作用的影響。6.目前研究認為，除了T2DM中的主效基因模式類型外，研究其易感基因時采用相關分析比連鎖分析更有效，但由于連鎖不平衡僅存在于染色體上極窄的區(qū)域內(nèi)（在混合人群中，連鎖不平衡的范圍僅為2.5-10kb），因此要想通過基于連鎖不平衡的相關分析進行基因組掃描，遺傳標志的密度需要在5-20kb才能保證所有的易感基因均被檢測到，這要求分布于整個基因組的極高密度的遺傳標志，目前所認識的遺傳標志中，只有單核苷酸多態(tài)性（SNP）符合這一要求。共一百五十三頁7.由于相關分析所需的樣本量較大，因而整個掃描工作的工作量將會非常巨大，這就要求遺傳標志的檢測功能自動化進行，SNP的檢測手段正是朝著這一方向發(fā)展，因而極有可能成為未來研究糖尿病等多基因疾病相關基因的重要工具。8.SNP作為有效的研究工具，是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。在人群中的發(fā)生頻率大于1%。SNPs包含(bāohán)了基因組已知多態(tài)性的80%-90%是最常見的遺傳變異類型。遺傳的選擇壓力導致SNP在單個基因及整個基因組中的分布是不均勻的，在基因編碼區(qū)大約有200,000個SNPs，稱cSNPs，與蛋白質功能有關，在非編碼區(qū)的SNPs稱ucSNPs。非編碼區(qū)的SNP比編碼區(qū)的SNP多。共一百五十三頁擬采取(cǎiqǔ)的研究方案：

1、本研究考慮到T2DM屬于多基因復雜性疾病，并且以散發(fā)為主的特征，以散發(fā)群體篩查為主導，小家系進行垂直驗證為輔助參考，進行T2DM易感基因的關聯(lián)篩查和驗證工作。T2DM以候選基因為標記，采用基因組改良(gǎiliáng)掃描方法進行實驗室分型。2、擬對有關聯(lián)編碼基因標記按染色體分型，可通過PCR-RFLP方法電泳定型在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳定型、銀染、酶切，確定基因型。對無關聯(lián)編碼基因標記，選用相應數(shù)量的微衛(wèi)星進行特定染色體的掃描，來尋找疾病候選位點?；蚍中徒Y果通過遺傳學統(tǒng)計軟件SAGE3.0、Genehunter2.0、Allegro等軟件作兩點或多點的連鎖和連鎖不平衡分析和家系內(nèi)基因傳遞和分離的TDT分析，以便確定染色體不同位點與疾病的相關性，并通過LOD分數(shù)高低定位某些排序有高概率的位點基因共一百五十三頁3、按DM的病因學，除需要精細定位，還需要有可靠的群體case-control驗證。所有擬定的候選易感基因，需要進行良好匹配，有足夠數(shù)量的case-control驗證和比較，進行Hardy-Weinberg平衡檢測檢查有否人群代表性。有良好的實驗室質控，以保證實驗穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。采用傳統(tǒng)的連鎖和連鎖不平衡分析方法進行遺傳學統(tǒng)計分析。有完整父母信息的可用TDT方法進行分離分析傳遞不平衡檢測。4、采用Logist回歸及神經(jīng)網(wǎng)絡模型及叉生分析進行危險因素(yīnsù)的遺傳與環(huán)境的交互作用分析。根據(jù)數(shù)據(jù)具體情況采用相對應的分析方法。共一百五十三頁研究方法1、本研究中涉及的尋找疾病易感基因的策略人類基因組計劃完成后，基因組DNA序列明確將簡化識別疾病易感基因的步驟。候選克隆技術正成為復雜形狀(xíngzhuàn)基因克隆的一種快捷高效的策略。目前研究糖尿病相關基因常用的技術是基因組掃描和連鎖分析，連鎖分析適用于分析基因型與表型有較密切關系，且疾病表型較單一的致病基因，而對于以多個微效基因為特征的T2DM易感基因的定位克隆不太適用。一般認為：研究T2DM等多遺傳因素及環(huán)境因素參與的復雜性疾病時，采用基因群體的基因組SNP“case-control”關聯(lián)分析，特別是基于連鎖不平衡（linkagedisequilibrium,LD）的關聯(lián)分析比連鎖分析更有效。關聯(lián)分析是基于群體中無親緣關系的病例組和表現(xiàn)型正常的對照組在某個遺傳標記位點上會出現(xiàn)不同的頻率而設計的。通過兩者頻率的不同，就能推測所研究的共一百五十三頁

遺傳標記和某個遺傳病易感位點之間是否存在因果關系或連鎖不平衡。

此領域內(nèi)目前被更多數(shù)人接受的理論基礎(jīchǔ)為“常見疾病—-常見變異”假說（commondisease,commonvariant,CDCV），該假說認為，T2DM等常見疾病的患病風險，主要由基因組常見變異積累造成，而非依賴于罕見的稀有基因組變異，后者在單基因疾病多多基因疾病中的主效基因模式中占主要地位。

常見疾病多由一種以上基因異常及致病環(huán)境因子呈正性或負性相互作用而引起。每個微效基因只賦予個體某種程度的易感性，就每個易感基因而言均非發(fā)病所必需。因此，單純依靠連鎖分析的方法進行復雜性疾病易感基因的尋找和定位時，基于CDCV的理論假設其檢驗的效能相對偏低，其最終很難在群體中得到相對一致的結果。共一百五十三頁

1）連鎖不平衡和單體型分析

連鎖不平衡是指相鄰基因座位上等位基因的非隨機相關，也就是指：當不同位點的等位基因以單體型組合形式出現(xiàn)的幾率高于隨機分布而同時出現(xiàn)的幾率時，那么稱這兩個位點處于連鎖不平衡狀態(tài)。用公式描述和衡量LD如下：假設相鄰基因座位1和2，座位1的等位基因為M，m，其頻率分別為PM，Pm；座位2的等位基因為N，n，其頻率分別為PN，Pn；等位基因M和N在同一染色體上同時出現(xiàn)的理論頻率為PM×PN，而實際出現(xiàn)的頻率為PMN，那么，連鎖不平衡的D值為PMN-PM×PN。LD的存在，可以歸因為兩種因素：一是由突變產(chǎn)生的多態(tài)性而形成，之后由于重組的發(fā)生，兩位點間的LD程度逐漸減低；另一種是由于分子標記物理距離(jùlí)的靠近，由于發(fā)生重組的概率降低，而呈現(xiàn)出高LD的共一百五十三頁

表現(xiàn)。但值得注意的是，靠得很近的分子標記間并非總呈現(xiàn)出強的LD，相反，也有數(shù)據(jù)顯示，對于距離較遠的分子標記間也存在LD的狀態(tài)。此外，一部分LD也可能由于遺傳漂變和群體混雜而產(chǎn)生。LD的度量有多種不同的方法，大多數(shù)都應用于雙等位基因的配對檢驗。目前常用的兩種配對檢驗方法為連鎖不平衡系數(shù)（coefficientoflinkagediseruiligrium，D′）和r2。它們的取值范圍都是從0（連鎖平衡）到1（完全連鎖不平衡）。

分子標記間LD存在，是繼續(xù)進行標記間單體型塊（haplotypeblock）構建的前提條件。同一條染色體上的單體型結構，可被劃分為一系列彼此分離的單體型塊，其大小為3-92kb左右。這些單體型塊被重組熱點所分割，其內(nèi)部重組率很低，處于高LD的狀態(tài)。

基于此理論基礎，如果單體型塊的結構在基因組中普遍存在，那么基于群體的“病例-對照(duìzhào)”關聯(lián)研究所共一百五十三頁

需要的SNP數(shù)量將大為縮小，并且還能在后續(xù)的分析中，體現(xiàn)功能性等位基因效應的相互疊加，無論是作為非功能的分子標志，還是作為有功能的等位基因的組合，其都具有更可持續(xù)推廣的應用效力而被作為目前最常見的工具而得到廣泛應用。

定義單體型塊的方法很多，目前大多數(shù)學者更傾向于利用配對的連鎖不平衡系數(shù)D′以確定重組熱點，因為測量重組似乎更符合單體型塊的本質，并且，利用配對連鎖不平衡系數(shù)D′更合適于雙等位基因。2）連鎖不平衡、傳遞不平衡（transmissiondisequilibriumtest，TDT）和關聯(lián)研究

將連鎖不平衡應用于大規(guī)模的關聯(lián)研究或針對特定染色體區(qū)段(qūduàn)，甚至針對單基因的進行系統(tǒng)性SNP掃描分析，可用尋找和定位復雜性疾病的致病基因。連鎖不平共一百五十三頁衡狀態(tài)的存在，既可能提示繼續(xù)進行單倍體塊分析的可能性，本身也預示可能起基因組區(qū)域附近存在功能性的突變位點。連鎖不平衡分析和關聯(lián)分析的結果是互通的。

傳遞不平衡檢驗是基于家系樣本的另一種形式的關聯(lián)研究。由于在群體關聯(lián)研究的實驗設計中，各環(huán)節(jié)都有可能影響數(shù)據(jù)分析的準確性，特別是研究群體的選擇最為重要?；谏l(fā)群體的關聯(lián)研究雖然有上述提到的策略優(yōu)勢，但是先證者效應、種族差異以及群體性別、年齡結構的差異，都可能出現(xiàn)所謂的“群體分層”，從而導致某基因位點與疾病存在相關的假陽性結果。傳遞不平衡不依賴于有群體分層可能的散發(fā)人群，而在相對背景一致的家系中進行研究。選擇一個受累家庭內(nèi)對照組。發(fā)現(xiàn)可以關聯(lián)時，運用TDT需要測定患者及其父母標記物基因型。它是基于尋找假定(jiǎdìng)的致疾病等位基因由雜合子父母傳遞給患病子女的不平衡傳遞性，而推測致病共一百五十三頁基因是否存在的方法?？梢越Y合散發(fā)群體的研究結果進行回顧性傳遞規(guī)律驗證研究。

在關聯(lián)研究中，如果某一因素可增加某疾病的發(fā)生風險，而該因素在疾病人群中的頻率高于正常人群，可認為該因素與疾病相關聯(lián)。關聯(lián)研究中，主要關注基于LD的間接關聯(lián)分析，其基本原理為：如果某致病基因座與遺傳標記（多態(tài)性的等位基因）存在強的LD關系，那么可以通過比較遺傳標記在患者于正常個體(gètǐ)間差異，最終得到該致病基因座在疾病發(fā)生中相對危險度。

3)2型糖尿病的多為點單倍體遺傳分析

單倍體型是傾向于共同遺傳的一組緊密連鎖的等位基因，可用于精細定位人類疾病基因。我們所有的染色體共一百五十三頁

均成對出現(xiàn)，一對染色體中每條分別來自父母一方，上面的基因及其排列順序雖一致，但其序列并不相同。例如，每1000個核苷酸就存在一個單核苷酸多態(tài)性，因而區(qū)分來源于父母親的變異體是可能的，稱為父源或母源的等位基因。對父源或母源等位基因的區(qū)分使人類的疾病基因得以通過連鎖分析定位到染色體某一位置上。在產(chǎn)生精子和卵子的生殖細胞中，父母源染色體配對并交換部分DNA片段，發(fā)生重組過程。重組之后，染色體稱為福怒雙親等位基因的混合體。重組更多的發(fā)生在距離較遠的DNA序列之間，因此，通過衡量疾病基因與已知位置序列之間的重組頻率可以(kěyǐ)定位疾病基因。重組的另一結果是同一染色體上某些區(qū)段的序列傾向于共同遺傳，共一百五十三頁稱為連鎖不平衡的現(xiàn)象。這樣一組極少被重組打破的等位基因，構成單倍體型，在人類基因組中，單倍體型大小約為60000bp左右，可能包含的SNP位點約60個。單倍體型可被用于精細定位疾病等位基因，一個導致遺傳疾病的新突破總是發(fā)生在一個群體已有的單倍體型之內(nèi)，經(jīng)過幾代傳遞，重組事件可能發(fā)生在此單倍體型之內(nèi)，但疾病等位基因仍然與最近的SNP組合在一起(yīqǐ)遺傳，如果此單倍體型可以在一組病人中鑒定，在單倍體型內(nèi)分型等位基因便可以使一個保守區(qū)域得以鑒定，此保守區(qū)域與致病基因指向同一染色體區(qū)段。由于SNP標記具有非常準確的定位致病基因的潛力，因而科學家有興趣構建整個人類基因組單倍體圖譜。

共一百五十三頁單倍體型分析對復雜遺傳病的易感基因連鎖分析具有重要作用，已成為不可缺少的通過連鎖分析精確定位致病基因的方法，在2型糖尿病等復雜遺傳疾病的易感基因精細定位方面得到廣發(fā)應用。

2研究候選突變位點在家系中的垂直傳遞規(guī)律方法：使用的樣本為采集T2DM病例對照樣本的同時，同時收集的部分T2DM先證者的家系資料。家系入選的標準如下：1）入選的家系每個家系成員3人以上，包含1名T2DM的先證者在內(nèi)至少有2個以上診斷明確的T2DM患者，如先證者與其一個同胞為T2DM患者，即為符合入選標準的家系。2）入選家系收集的信息和標本(biāoběn)包含兩代人以上，如先證者及其配偶與子女或先證者及其父母。家系結構類型如圖1-1所示。電話約請先證者及其父、母、患者和未患者的同胞等其它家系成員，所有受試者均簽署知情同意書。于共一百五十三頁空腹12小時后，次日早晨進行口服75克葡萄糖耐量試驗（OGTT）分別測定0、30、60、120及180分鐘血糖、胰島素、空腹血糖。T2DM診斷標準依據(jù)WHO1999年標準。3）共采集120個家系，先證者為候選突變Gly482Ser的突變雜合子的家系被二篩挑選出來，進行后續(xù)的家系傳遞研究，確定最終納入的核心(héxīn)小家系。共一百五十三頁臨床(línchuánɡ)信息和血生化指標測定

依據(jù)1999年WHO糖尿病專家委員會制訂的糖尿病診斷及分型標準：1）有糖尿病癥狀，并且任意血糖≧11.1mmol/l。2）空腹血糖≧7.0mmol/l。3）糖耐量試驗餐后2小時血糖≧11.1mmol/l。OGTT按世界衛(wèi)生組織要求進行。符合上述標準之一的患者(huànzhě)，在另一天重復上述檢查，若仍符合三條標準之一，即診斷為糖尿病。糖耐量試驗服糖后2小時血糖≧7.8mmol/l，但又低于11.1mmol/l診斷為糖耐量減低?？崭寡歉哂诨虻扔?.1mmol/l，但又低于7.0mmol/l診斷為空腹葡萄糖受損。共一百五十三頁技術(jìshù)路線

考慮到T2DM屬于多基因復雜性疾病，并且以散發(fā)為主，所以，T2DM的易感基因的尋找不適合使用家系資料(zīliào)的連鎖分析。此外，T2DM的發(fā)病有增齡性變化的特征，所以從家系入手進行傳遞不平衡檢驗也不能作為首選研究策略。本研究采用四步法進行T2DM易感基因的關聯(lián)篩查和驗證工作，以散發(fā)群體篩查為主導，小家系進行垂直驗證為輔助參考，主要技術路線設計如下圖：共一百五十三頁T2DM診斷，樣本采集，流行病學(liúxínɡbìnɡxué)調(diào)查基因組DNA提取、生化指標(zhǐbiāo)測定小樣本直接掃描PPARGC1編碼區(qū)和啟動子區(qū)SNP，進行預篩查，根據(jù)MAF、雜合度等信息，選擇進入后續(xù)研究。小群體等位基因分型，進行單基因遺傳學分析，根據(jù)HWE、分布顯著性、OnewayANOVA、LD及Logistic去除混雜后，選擇SNP進入后續(xù)研究第一步第二步共一百五十三頁陽性SNP利用(lìyòng)核心小家系驗證，通過傳導不平衡檢驗和同胞對檢驗分析去除人群分層后陽性突變位點在家系中的傳遞規(guī)律傳遞與環(huán)境因素的交互作用分析，尋找發(fā)病原因的證據(jù)：探索(tànsuǒ)PPARGC1的分子機制T2DM大群體中等位基因分型，進行多因素分析，根據(jù)HWE檢驗、分布顯著性、LD及單體型構建，分析基因互作效應，比較基因型間臨床指標差異第三步第四步共一百五十三頁可行性分析(fēnxī)：

目前已完成北方125個家系及散發(fā)病例320名和正常對照320名的調(diào)查工作，獲取到血樣、提取出DNA，完成了生化指標的檢測工作同時，進行了環(huán)境、遺傳因素的調(diào)查也數(shù)據(jù)初步分析。驗證了2個PPARGC1易感基因與T2DM關聯(lián)的多態(tài)性位點，同時做了家系傳遞(chuándì)分析及基因間交互作用的分析。正在補充完善家系資料及資料搜集工作。方法成熟、技術路線可行。前期的國家自然科學基金項目的進行為本研究積累一定的工作基礎。采樣過程中我們注意了醫(yī)學倫理問題：在目前的醫(yī)學工作中面臨諸多嚴峻的倫理問題，如遺傳信息的隱私權問題、基因組圖譜的信息使用與人的社會權利、基因組研究成果應用的不可預測性等。我們已經(jīng)注意到這一問題，并提請哈爾濱科大學醫(yī)學理論委員會共一百五十三頁論證，最終獲得批準(pīzhǔn)通過。因此我們在項目申請的過程中，已經(jīng)著手準備妥善解決此問題，如果基金申請順利通過，我們有能力解決好次問題。并將嚴格實行知情同意制度，每位患者均簽署知情同意書，并與患者保持密切聯(lián)系，及時將研究成果向患者反饋，維護患者的權益。共一百五十三頁

本項目(xiàngmù)的特色與創(chuàng)新之處：

分子生物學與社會醫(yī)學研究方法相結合，遵循現(xiàn)代(xiàndài)社會醫(yī)學研究模式為本項目特色

近年，隨著分子生物學理論及技術的發(fā)展，尤其是人類基因組計劃研究迅速進展和突破、基因定位技術經(jīng)驗的積累及統(tǒng)計分析方法的進步，使得2型糖尿病的分子遺傳學研究有了長足進展。闡明參與2型糖尿病的易感基因種類、特性及機制是2型糖尿病分子遺傳學研究的目標之一。目前比較常用的是采用候選基因的功能區(qū)或非功能區(qū)多態(tài)標記進行。本項目將從預防醫(yī)學、基礎醫(yī)學、社會醫(yī)學研究三個層次對北方地區(qū)T2DM的流行現(xiàn)狀、致病的遺傳、環(huán)境、社會因素的交互作用研究。進而為使得T2DM的預防治療遵循現(xiàn)代社會醫(yī)學模式奠定基礎。共一百五十三頁

群體關聯(lián)分析，或是采用隨機DNA位點或候選基因的高雜合度非功能區(qū)多態(tài)標記進行家系分析。2型糖尿病受到遺傳基因與環(huán)境條件的雙重調(diào)控。不同遺傳背景的人群糖尿病易感性的主效基因可能有較大的差異。以往在不同群體進行易感基因的關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，同以易感基因在不同群體中作用(zuòyòng)具有差異性。所以對于在其他人群所發(fā)現(xiàn)的易感基因，在