微生物學(xué)試驗(yàn)教程

《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》是配合武漢大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)編的《微生物學(xué)》一書(shū)的實(shí)驗(yàn)教材。第二

版做了較大修改，增添了許多新技術(shù)與方法，實(shí)驗(yàn)由原先的40個(gè)增至63個(gè)，并按類規(guī)納成

15個(gè)部分。每一部分冠以綜合性說(shuō)明，簡(jiǎn)單介紹該部分內(nèi)容及其在微生物學(xué)工作中的作用。

第二版仍著重微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作與技能訓(xùn)練。為方便教學(xué)，每一實(shí)驗(yàn)基本上仍按

照目的要求、基本原理、器材、操作步驟及實(shí)驗(yàn)報(bào)告(包含實(shí)驗(yàn)結(jié)果與思考題)五部分。書(shū)

后附有染色液、培養(yǎng)基、試劑與溶液的配制方法、本書(shū)使用的菌種名稱，微生物學(xué)中常用的

計(jì)量單位及要緊參考書(shū)目。

第二版實(shí)驗(yàn)內(nèi)容較多，各校可根據(jù)具體條件酌情選做。

第一版前言

《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》一書(shū)是根據(jù)1977年10月成都綜合性大學(xué)生物類教材會(huì)議制定的大綱

編寫(xiě)的。在編寫(xiě)過(guò)程中，為配合武漢大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)編的《微生物學(xué)》教材，在內(nèi)容上有所

增加與修改。

本書(shū)共有實(shí)驗(yàn)40個(gè)，內(nèi)容較多，其中包含與《微生物學(xué)》相配合、印證理論與進(jìn)行微

生物實(shí)驗(yàn)所需的基本操作與技能的訓(xùn)練兩大部分。各校可根據(jù)具體條件酌情選做。

本書(shū)為方便教學(xué)，每一實(shí)驗(yàn)基本上都按目的要求、基本原理、器材、操作步驟及結(jié)果與

思考題等五個(gè)部分來(lái)編寫(xiě)的，各實(shí)驗(yàn)所用染料、培養(yǎng)基、溶液與懸液等的配制均列在附錄內(nèi)。

由于編者水平所限，在取材、實(shí)驗(yàn)方法與編排等方面確信有很多缺點(diǎn)與錯(cuò)誤，希望讀者

批判指正。

在編寫(xiě)過(guò)程中承武漢大學(xué)生物系微生物教研室基礎(chǔ)微生物學(xué)教學(xué)小組的大力支持，武漢

大學(xué)生物系陳寶聯(lián)同志繪制插圖，在此一并表示感謝。

范秀容沈萍

第二版前言

《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》第一版自1980年出版以來(lái)已有七八年了，在此期間，通過(guò)多次印刷,

印數(shù)已達(dá)十余萬(wàn)冊(cè)。它在微生物學(xué)的教學(xué)與穩(wěn)固教學(xué)秩序方面起了積極的作用，但是也存在

很多缺點(diǎn)，加上近年來(lái)微生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展迅速，因此我們進(jìn)行了出版第二版的修訂工作。

修訂內(nèi)容與特點(diǎn)如下：

1.將繁多的實(shí)驗(yàn)按類歸納成15個(gè)部分，以求條理清晰，概念分明。每一部分冠以綜合

性說(shuō)明，要緊簡(jiǎn)單介紹該部分的內(nèi)容，闡述其在整個(gè)微生物學(xué)工作中的作用等。再在每一部

分選擇有代表性的重點(diǎn)，列出實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行操作。

2.繼續(xù)著重微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作與技能的訓(xùn)練。

3.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容做如下調(diào)整：

(1)為了加強(qiáng)學(xué)生對(duì)微生物及其應(yīng)用與無(wú)菌概念重要性的認(rèn)識(shí)，與對(duì)實(shí)驗(yàn)工具的質(zhì)量要

求與洗滌方法的熟悉，增加了“微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的器皿”、“環(huán)境中的微生物”與“食

品微生物學(xué)”等部分。

(2)使一些領(lǐng)域的內(nèi)容更加全面，比如在“顯微鏡的結(jié)構(gòu)、性能與使用方法”部分增加

了相差顯微鏡與電子顯微鏡；“微生物的純培養(yǎng)”部分增加了厭氧培養(yǎng)；微生物的遺傳方面

增加了藥物抗性菌的分離與細(xì)菌的接合作用等實(shí)驗(yàn)。

(3)適當(dāng)增加新技術(shù)的介紹，比如生化反應(yīng)中的微量簡(jiǎn)易診檢系統(tǒng)；菌種保藏中的液氮

冷凍保藏法；水的微生物學(xué)檢查中增加了濾膜法等。

(4)此外，在基本操作訓(xùn)練方面集中介紹了動(dòng)物的幾種不一致途徑的注射方法。

(5)由于“環(huán)境中的微生物”包含了空氣中微生物的檢查，故沒(méi)有再單獨(dú)設(shè)實(shí)驗(yàn)，此外

還刪去了“巴斯德效應(yīng)”實(shí)驗(yàn)。

第二版的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容較多，有些內(nèi)容由于實(shí)驗(yàn)條件與學(xué)時(shí)的限制，可作為學(xué)生日后進(jìn)一步

工作的參考。因此各?？筛鶕?jù)具體條件酌情選做。

4.第二版將實(shí)驗(yàn)報(bào)告分為實(shí)驗(yàn)結(jié)果與思考題兩部分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果盡量使用繪圖與表格形

式，并要求在表格內(nèi)用簡(jiǎn)單符號(hào)與數(shù)字填寫(xiě)，以使作業(yè)規(guī)范化，便于學(xué)生記錄與教師批改。

5.增加了部分插圖。

第二版要緊由范秀容、李廣武、沈萍同志編寫(xiě)，彭珍榮同志參加編寫(xiě)了部分實(shí)驗(yàn)。

插圖除沿用第一版由陳寶聯(lián)同志繪制的以外，其余大部分插圖由熊定榮同志繪制，個(gè)別

插圖由劉啟融同志繪制，在此一并致謝。

由于編者的水平有限，本版的缺點(diǎn)與錯(cuò)誤在所難免，尚請(qǐng)各位同仁與讀者提出寶貴意見(jiàn)。

編者

1988.6.

實(shí)驗(yàn)須知

普通微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的目的是：訓(xùn)練學(xué)生掌握微生物學(xué)最基本的操作技能；熟悉微生物

學(xué)的基本知識(shí)；加深懂得課堂講授的某些微生物學(xué)理論。同時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生觀察、

思考、分析問(wèn)題與解決問(wèn)題的能力；實(shí)事求是、嚴(yán)肅認(rèn)確實(shí)科學(xué)態(tài)度與勤儉節(jié)約、愛(ài)護(hù)公物

的良好作風(fēng)。

為了上好微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課，并保證安全，特提出如下注意事項(xiàng)：

1.每次實(shí)驗(yàn)前務(wù)必對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行充分預(yù)習(xí)，以熟悉實(shí)驗(yàn)的目的、原理與方法，做到

心中有數(shù)，思路清晰。

2.認(rèn)真及時(shí)做好實(shí)驗(yàn)記錄，關(guān)于當(dāng)時(shí)不能得到結(jié)果而需要連續(xù)觀察的實(shí)驗(yàn)，則需記下

每次觀察的現(xiàn)象與結(jié)果，以便分析。

3.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保持整潔，勿高聲談話與隨便走動(dòng)，保持室內(nèi)安靜。

4.實(shí)驗(yàn)時(shí)小心認(rèn)真，全部操作應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，萬(wàn)一遇有盛菌試管或者瓶不慎

打破、皮膚破傷或者菌液吸入口中等意外情況發(fā)生時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師，及時(shí)處理，切

勿隱瞞。

5.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，切勿使酒精、乙醛、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險(xiǎn)，應(yīng)先關(guān)掉

火源，再用濕布或者沙土掩蓋滅火。必要時(shí)用滅火機(jī)。

6.使用顯微鏡或者其他貴重儀器時(shí)，要求細(xì)心操作，特別愛(ài)護(hù)。對(duì)消耗材料與藥品等

要力求節(jié)約，用畢后仍放回原處。

7.每次實(shí)驗(yàn)完畢后，務(wù)必把所用儀器抹凈放妥，將實(shí)驗(yàn)室收拾整齊，擦凈桌面，如有

菌液污染桌面或者其他地方時(shí)，可用3%來(lái)蘇爾液或者5%石炭酸液覆蓋其上半小時(shí)后擦去,

如系芽抱桿菌，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)消毒時(shí)間。凡帶菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗滌前須浸

泡在3%來(lái)蘇爾液中進(jìn)行消毒。

8.每次實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行培養(yǎng)的材料，應(yīng)標(biāo)明自己的組別及處理方法，放于教師指定的地點(diǎn)

進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室中的菌種與物品等，未經(jīng)教師許可，不得攜出室外。

9.每次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)以實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度填入報(bào)告表格中，力求簡(jiǎn)明準(zhǔn)確，并連

同思考題及時(shí)匯交教師批閱。

10.離實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)將手洗凈，注意關(guān)閉門窗、燈、火、煤氣等。

I、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的器皿

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所用的玻璃器皿，大多要進(jìn)行消毒、滅菌與用來(lái)培養(yǎng)微生物，因此對(duì)其

質(zhì)量、洗滌與包裝方法均有一定的要求。通常，玻璃器皿的質(zhì)量要求硬質(zhì)玻璃，才能承受高

溫與短暫燒灼而不致破舊；器皿的游離堿含量要少，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的酸堿度；對(duì)玻璃器

皿的形狀與包裝方法的要求，以能防止污染雜菌為準(zhǔn)；洗滌方法不恰當(dāng)也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本節(jié)將對(duì)這幾方面作全面介紹。

一、器皿的種類、要求與應(yīng)用

1.試管（testtube）

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所用玻璃試管,其管壁務(wù)必比化學(xué)實(shí)驗(yàn)室用的厚些,這樣在塞棉花塞時(shí),

管口才不可能破舊。試管的形狀要求沒(méi)有翻口（圖IT,A）,不然，微生物容易從棉塞與

管口的縫隙間進(jìn)入試管（圖IT,B）而造成污染。此外，現(xiàn)在有不用棉塞而用鋁制或者塑

料制的試管帽（圖IT,C）,若用翻口試管也不便于蓋試管帽。有的實(shí)驗(yàn)要求盡量減低蒸

發(fā)試管內(nèi)的水分，則需使用螺口試管（圖IT,D）,蓋以螺口膠木或者塑料帽。

試管的大小可根據(jù)用途的不一致，準(zhǔn)備下列三種型號(hào)。

(1)大試管(約18X180mni)可盛倒培養(yǎng)皿用的培養(yǎng)基；亦可作制備瓊脂斜面用(需

要大量菌體時(shí)用)。

(2)中試管(約13—15X100—150mm)盛液體培養(yǎng)基或者做瓊脂斜面用，亦可用于病

毒等的稀釋與血清學(xué)試驗(yàn)。

(3)小試管(10—12X100mm)通常用于糖發(fā)酵試驗(yàn)或者血清學(xué)試驗(yàn)，與其他需要節(jié)約

材料的試驗(yàn)

2.德漢氏試管(Durhamtube)

觀察細(xì)菌在糖發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)氣情況時(shí)，通常在小試管內(nèi)再套一倒置的小套管(約6

X36mm)(圖1-2),此小套管即為德漢氏試管，又稱發(fā)酵小套管。

3.吸管(又稱移液管，pipette)

(1)玻璃吸管(glasspipette)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室通常要準(zhǔn)備1、5、10ml的刻度玻璃

吸管(圖1-3,A)。與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室所用的不一致，其刻度指示的容量往往包含管尖的液體

體積，亦即使用時(shí)要注意將所吸液體吹盡，故有的時(shí)候稱之“吹出”吸管。市售細(xì)菌學(xué)用吸

管，有的在吸管上端刻有“吹”字。

除有刻度的吸管外，有的時(shí)候需用不計(jì)量的毛細(xì)吸管，又稱滴管(圖1-3,B),來(lái)吸

取動(dòng)物體液與離心上清液與滴加少量抗原、抗體等。

(2)活塞吸管(pistonpipette)要緊用來(lái)吸取微量液體，故又稱微量吸液器或者微

量加樣器。其外形與結(jié)構(gòu)如圖1-4,除塑料外殼外，要緊部件有按鈕、彈簧、活塞與可裝卸

的吸嘴。按動(dòng)按鈕，通過(guò)彈簧使活塞上下活動(dòng)，從而吸進(jìn)與放出液體。其特點(diǎn)是容量固定,

使用時(shí)不用觀察刻度，操作方便、迅速。國(guó)內(nèi)產(chǎn)品通常每個(gè)活塞吸管固定一種容量，分別有

5、10、20、25、50、100、200、500、1000口1等不一致容量。而精制的活塞吸管每個(gè)在一

定的范圍內(nèi)可調(diào)節(jié)幾個(gè)容積，比如在5—25口1的范圍內(nèi)，可調(diào)節(jié)5、10、15、20、25u1

五個(gè)不一致的量，使用時(shí)按需要調(diào)節(jié)，但當(dāng)調(diào)節(jié)固定后，每吸一次，容量仍是固定的。用畢

只需調(diào)換吸嘴或者將吸嘴洗凈，消毒后再行使用。

活塞吸管是國(guó)外70年代后半期才開(kāi)始生產(chǎn)與應(yīng)用的，近年來(lái)國(guó)內(nèi)亦日益廣泛應(yīng)用于免

疫學(xué)與使用同位素等的科學(xué)實(shí)驗(yàn)中。

4.培養(yǎng)皿(petridish)

常用的培養(yǎng)皿(圖1-5),皿底直徑90mm,高15mm。培養(yǎng)皿通常均為玻璃皿蓋，但有

特殊需要時(shí)，可使用陶器皿蓋，因其能汲取水分，使培養(yǎng)基表面干燥，比如測(cè)定抗生素生物

效價(jià)時(shí)，培養(yǎng)皿不能倒置培養(yǎng)，則用陶器皿蓋為好。

在培養(yǎng)皿內(nèi)倒入適量固體培養(yǎng)基制成平板，用于分離、純化、鑒定菌種、微生物計(jì)數(shù)與

測(cè)定抗生素、噬菌體的效價(jià)等。

5.三角燒瓶(Erlenmeyerflask)與燒杯(beaker)

三角燒瓶有100、250、500.1000ml等不一致的大小，常用來(lái)盛無(wú)菌水、培養(yǎng)基與搖瓶

發(fā)酵等。常用的燒杯有50、100、250、500、1000ml等，用來(lái)配制培養(yǎng)基與藥品。

6.注射器(injector)

通常有1、2、5、10、20、50ml等不一致容量的注射器。注射抗原于動(dòng)物體內(nèi)可根據(jù)需

要使用1、2與5ml的；抽取動(dòng)物心臟血或者綿羊靜脈血可使用10、20、50ml的。

微量注射器有10、20、50、100口1等不一致的大小。通常在免疫學(xué)或者紙層析等實(shí)驗(yàn)

中滴加微量樣品時(shí)應(yīng)用。

7.載玻片(slide)與蓋玻片(coverslip)

普通載玻片大小為75X25mm,用于微生物涂片、染色，作形態(tài)觀察等。蓋玻片為18X

18mm。

凹玻片是在一塊厚玻片的當(dāng)中有一圓形凹窩(圖I-6),作懸滴觀察活細(xì)菌與微室培養(yǎng)

用。

8.雙層瓶(doublebottle)

由內(nèi)外兩個(gè)玻璃瓶構(gòu)成(圖I-7),內(nèi)層小錐形瓶盛放香柏油，供油鏡頭觀察微生物時(shí)

使用，外層瓶盛放二甲苯，用以擦凈油鏡頭。

9.滴瓶(dropperbottle)

用來(lái)裝各類染料、生理鹽水等(圖1-8)。

10.接種工具

接種工具有接種環(huán)(inoculatingloop)、接種針(inocula-tingneedle)＞接種鉤

(inoculatinghook)、接種鏟(inocula-tingshovel)、玻璃涂布器(glassspreader)

等(圖1-9)。制造環(huán)、針、鉤、鏟的金屬可用鉗或者鏢，原則是軟硬適度，能經(jīng)受火焰反

復(fù)燒灼，又易冷卻。接種細(xì)菌與酵母菌用接種環(huán)與接種針，其伯絲或者銀絲的直徑以0.5mm

為適當(dāng)，環(huán)的內(nèi)徑約2mm,環(huán)面應(yīng)平整。接種某些不易與培養(yǎng)基分離的放線菌與真菌，有的

時(shí)候用接種鉤或者接種鏟，其絲的直徑要求粗一些，約1mm。用涂布法在瓊脂平板上分離單

個(gè)菌落時(shí)需用玻璃涂布器，是將玻棒彎曲或者將玻棒一端燒紅后壓扁而成。

二、玻璃器皿的清洗方法

清潔的玻璃器皿是實(shí)驗(yàn)得到正確結(jié)果的先決條件，因此，玻璃器皿的清洗是實(shí)驗(yàn)前的一

項(xiàng)重要準(zhǔn)備工作。清洗方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、器皿的種類、所盛放的物品、洗滌劑的類別與沾

污程度等的不一致而是完全不一致的?，F(xiàn)分述如下：

1.新玻璃器皿的洗滌方法

新購(gòu)置的玻璃器皿含游離堿較多，應(yīng)在酸溶液內(nèi)先浸泡數(shù)小時(shí)。酸溶液通常用2%的鹽

酸或者洗滌液(見(jiàn)本小節(jié)“3”)。浸泡后用自來(lái)水沖洗干凈。

2.使用過(guò)的玻璃器皿的洗滌方法

(1)試管、培養(yǎng)皿、三角燒瓶、燒杯等可用瓶刷或者海綿沾上肥皂或者洗衣粉或者去污

粉等洗滌劑刷洗，然后用自來(lái)水充分沖洗干凈。熱的肥皂水去污能力更強(qiáng)，可有效地洗去器

皿上的油污。洗衣粉與去污粉較難沖洗干凈而常在器壁上附有一層微小粒子，故要用水多次

甚至10次以上充分沖洗，或者可用稀鹽酸搖洗一次，再用水沖洗，然后倒置于鐵絲框內(nèi)或

者有空心格子的木架(圖IT0)上，在室內(nèi)晾干。急用時(shí)可盛于框內(nèi)或者搪瓷盤(pán)上，放烘

箱烘干。

玻璃器皿經(jīng)洗滌后，若內(nèi)壁的水是均勻分布成一薄層，表示油垢完全洗凈，若掛有水珠,

則還需用洗滌液浸泡數(shù)小時(shí)，然后再用自來(lái)水充分沖洗。

裝有固體培養(yǎng)基的器皿應(yīng)先將其刮去，然后洗滌。帶菌的器皿在洗滌前先浸在2%煤酚

皂溶液(來(lái)蘇爾)或者0.25%新潔爾滅消毒液內(nèi)24小時(shí)或者煮沸半小時(shí)，再用上法洗滌。

帶病原菌的培養(yǎng)物最好先行高壓蒸汽滅菌，然后將培養(yǎng)物倒去，再進(jìn)行洗滌。

盛放通常培養(yǎng)基用的器皿經(jīng)上法洗滌后，即可使用，若需精確配制化學(xué)藥品，或者做科

研用的精確實(shí)驗(yàn)，要求自來(lái)水沖洗干凈后，再用蒸鐳水淋洗三次，晾干或者烘干后備用。

(2)玻璃吸管吸過(guò)血液、血清、糖溶液或者染料溶液等的玻璃吸管(包含毛細(xì)吸管)，

使用后應(yīng)立即投入盛有自來(lái)水的量筒或者標(biāo)本瓶?jī)?nèi)，免得干燥后難以沖洗干凈。量筒或者標(biāo)

本瓶底部應(yīng)墊以脫脂棉花，否則吸管投入時(shí)容易破舊。待實(shí)驗(yàn)完畢，再集中沖洗。若吸管頂

部塞有棉花，則沖洗前先將吸管尖端與裝在水龍頭上的橡皮管連接，用水將棉花沖出，然后

再裝入吸管自動(dòng)洗滌器內(nèi)沖洗，沒(méi)有吸管自動(dòng)洗滌器的實(shí)驗(yàn)室可用沖出棉花的方法多沖洗片

刻。必要時(shí)再用蒸儲(chǔ)水淋洗。洗凈后，放搪瓷盤(pán)中晾干，若要加速干燥，可放烘箱內(nèi)烘干。

吸過(guò)含有微生物培養(yǎng)物的吸管亦應(yīng)立即投入盛有2%煤酚皂溶液或者0.25%新潔爾滅

消毒液的量筒或者標(biāo)本瓶?jī)?nèi)，24小時(shí)后方可取出沖洗。

吸管的內(nèi)壁假如有油垢，同樣應(yīng)先在洗滌液內(nèi)浸泡數(shù)小時(shí)，然后再行沖洗。

(3)載玻片與蓋玻片用過(guò)的載玻片與蓋玻片如滴有香柏油，要先用皺紋紙擦去或者浸在

二甲苯內(nèi)搖晃幾次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5-10分鐘，用軟布或者脫脂棉花擦試,

立即用自來(lái)水沖洗，然后在稀洗滌液中浸泡0.5—2小時(shí)，自來(lái)水沖去洗滌液，最后用蒸儲(chǔ)

水換洗數(shù)次，待干后浸于95%酒精中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。使用時(shí)在火焰上燒去酒精。用此法洗滌與

儲(chǔ)存的載玻片與蓋玻片清潔透亮，沒(méi)有水珠。

檢查過(guò)活菌的載玻片或者蓋玻片應(yīng)先在2%煤酚皂溶液或者0.25%新潔爾滅溶液中浸

泡24小時(shí)，然后按上法洗滌與儲(chǔ)存。

3.洗滌液的配制與使用

（1）洗滌液的配制洗滌液分濃溶液與稀溶液兩種，配方如下：

濃溶液重銘酸鈉或者重銘酸鉀（工業(yè)用）50g

自來(lái)水150ml

濃硫酸（工業(yè)用）800ml

稀溶液重格酸鈉或者重銘酸鉀（工業(yè)用）50g

自來(lái)水850ml

濃硫酸（工業(yè)用）100ml

配法都是將重格酸鈉或者重銘酸鉀先溶解于自來(lái)水中，可慢慢加溫，使溶解，冷卻后徐

徐加入濃硫酸，邊加邊攪動(dòng)。

配好后的洗滌液應(yīng)是棕紅色或者桔紅色。貯存于有蓋容器內(nèi)。

（2）原理重銘酸鈉或者重銘酸鉀與硫酸作用后形成銘酸（chro-micacid）,酪酸的

氧化能力極強(qiáng)，因而此液具有極強(qiáng)的去污作用。

（3）使用注意事項(xiàng)（a）洗滌液中的硫酸具有強(qiáng)腐蝕作用，玻璃器皿浸泡時(shí)間太長(zhǎng)，

會(huì)使玻璃變質(zhì)，因此切忌到時(shí)不記得將器皿取出沖洗。其次，洗滌液若沾污衣服與皮膚應(yīng)立

即用水洗，再用蘇打水或者氨液洗。假如濺在桌椅上，應(yīng)立即用水洗去或者濕布抹去；（b）

玻璃器皿投入前，應(yīng)盡量干燥，避免洗滌液稀釋；（c）此液的使用僅限于玻璃與瓷質(zhì)器皿,

不適用于金屬與塑料器皿；（d）有大量有機(jī)質(zhì)的器皿應(yīng)先行擦洗，然后再用洗滌液，這是

由于有機(jī)質(zhì)過(guò)多，會(huì)加快洗滌液失效，此外，洗滌液雖為很強(qiáng)的去污劑，但也不是所有的污

跡都可清除；（e）盛洗滌液的容器應(yīng)始終加蓋，以防氧化變質(zhì)；（f）洗滌液可反復(fù)使用，

但當(dāng)其變?yōu)槟G色時(shí)即已失效，不能再用。

三、空玻璃器皿的包裝

1.培養(yǎng)皿的包裝

培養(yǎng)皿常用舊報(bào)紙密密包緊，通常以5—8套培養(yǎng)皿作一包，少于5套工作量太大，多

于8套不易操作。包好后行于熱滅菌。如將培養(yǎng)皿放入銅筒內(nèi)進(jìn)行干熱滅菌，則不必用紙包,

銅筒有一圓筒形的帶蓋外筒，里面放一裝培養(yǎng)皿的帶底框架（圖IT1）,此框架可自圓筒

內(nèi)提出，以便裝取培養(yǎng)皿。

2.吸管的包裝

準(zhǔn)備好干燥的吸管，在距其粗頭頂端約0.5cm處，塞一小段約1.5cm長(zhǎng)的棉花，以免

使用時(shí)將雜菌吹入其中，或者不慎將微生物吸出管外。棉花要塞得松緊恰當(dāng)，過(guò)緊，吹吸液

體太費(fèi)力；過(guò)松，吹氣時(shí)棉花會(huì)下滑。然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報(bào)紙條的近左端,

與報(bào)紙約呈45度角（圖IT2）,并將左端多余的一段紙覆折在吸管上，再將整根吸管卷入

報(bào)紙，右端多余的報(bào)紙打一小結(jié)。如此包好的很多吸管可再用一張大報(bào)紙包好，進(jìn)行干熱滅

菌。

假如有裝吸管的銅筒（圖1-13）,亦可將分別包好的吸管一起

裝入銅筒，進(jìn)行干熱滅菌；若估計(jì)一筒滅菌的吸管可一次用完，亦可不用報(bào)紙包而直接

裝入銅筒滅菌，但要求將吸管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用時(shí)，銅筒臥放在桌上，用

手持粗端拔出。

3.試管與三角燒瓶等的包裝

試管管口與三角燒瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十九），然后在棉花塞與管

口與瓶口的外面用兩層報(bào)紙（不可用油紙）與細(xì)線包扎好，進(jìn)行干熱滅菌。試管塞好棉花塞

后也可一起裝在鐵絲簍中，用大張報(bào)紙將一簍試管口做一次包扎，包紙的目的在于儲(chǔ)存期避

免灰塵侵入。

空的玻璃器皿通常用干熱滅菌，若需濕熱滅菌，則要多用幾層報(bào)紙包扎，外面最好再加

一層牛皮紙。

假如試管是蓋的鋁帽，則不必包紙，可直接干熱滅菌。用塑料帽，則宜濕熱滅菌。

II.環(huán)境中的微生物

由于微生物是肉眼看不見(jiàn)的，因此初學(xué)微生物學(xué)的學(xué)生常不明白外界環(huán)境與所有與外界

接觸的身體各部位均有微生物的存在。實(shí)際上它們廣泛分布于室內(nèi)外的空氣、水與土壤中，

桌、椅與板凳的表面，衣服與身體的皮膚、粘膜（比如鼻腔、口腔、喉頭等的粘膜）等處,

因此，能夠說(shuō)微生物是無(wú)縫不鉆，無(wú)孔不入的。在學(xué)生第一次進(jìn)入微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，建立

起“微生物無(wú)所不在”這一概念是特別重要的，由于這樣才能體會(huì)到無(wú)菌技術(shù)與環(huán)境衛(wèi)生的

必要性，才能防止外界微生物對(duì)培養(yǎng)物的污染，才能防止病原性細(xì)菌或者病毒通過(guò)手或者衣

服進(jìn)入人體而引起傳染。

從周圍環(huán)境與體表各部取樣生長(zhǎng)出來(lái)的微生物，盡管大多數(shù)屬正常菌群，但當(dāng)進(jìn)入破舊

的皮膚或者傳入口內(nèi)或者眼睛等處也會(huì)引起傳染，這一方面是由于通過(guò)培養(yǎng)，微生物的量大;

另一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但當(dāng)條件改變時(shí)也可能致?。ǚQ之條件致

病菌），因此務(wù)必全面閱讀操作步驟與聽(tīng)從指導(dǎo)者的說(shuō)明，特別是用過(guò)的棉簽與工作完畢后

的培養(yǎng)物等均要放在指定的容器內(nèi)，接種環(huán)不僅在用前務(wù)必?zé)茰缇?，而且用后也?yīng)立即燒

灼。這是整個(gè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程與今后進(jìn)行微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)均需注意的。

下面的實(shí)驗(yàn)就是從實(shí)驗(yàn)室空氣、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、門的旋扭（或者把手）與人的頭發(fā)、皮膚、洗

手前后的手指與鼻腔粘膜等處取樣，接種于瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)1—2天后，觀察并比較不

一致來(lái)源的微生物生長(zhǎng)的數(shù)量與類型。

實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與人體表面微生物的檢查

一、目的要求

1.證明實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與體表存在微生物。

2.比較來(lái)自不一致場(chǎng)所與不一致條件下細(xì)菌的數(shù)量與類型。

3.體會(huì)無(wú)菌操作的重要性。

二、基本原理

平板培養(yǎng)基含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)成分，當(dāng)取自不一致來(lái)源的樣品接種于培養(yǎng)基

上，在37c溫度下培養(yǎng)，1一2天內(nèi)每一菌體即能通過(guò)很多次細(xì)胞分裂而進(jìn)行繁殖，形成一

個(gè)可見(jiàn)的細(xì)胞群體的集落，稱之菌落。每一種細(xì)菌所形成的菌落都有它自己的特點(diǎn)，比如菌

落的大小，表面干燥或者濕潤(rùn)、隆起或者扁平、粗糙或者光滑，邊緣整齊或者不整齊，菌落

透明或者半透明或者不透明，顏色與質(zhì)地疏松或者緊密等。因此，可通過(guò)平板培養(yǎng)來(lái)檢查環(huán)

境中細(xì)菌的數(shù)量與類型。

三、器材

肉膏蛋白陳瓊脂平板，無(wú)菌水，滅菌棉簽（裝在試管內(nèi)），接種環(huán)，試管架，酒精燈或

者煤氣燈，記號(hào)筆（或者蠟筆），廢物缸。

四、操作步驟

每組在“實(shí)驗(yàn)室”與“人體”兩大部分中各選擇一個(gè)內(nèi)容做實(shí)驗(yàn)，或者由教師指定分配,

最后結(jié)果供全班討論。

1.寫(xiě)標(biāo)簽

任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在動(dòng)手操作前均需首先將器皿用記號(hào)筆做上記號(hào)，培養(yǎng)皿的記號(hào)通常寫(xiě)

在皿底上。假如寫(xiě)在皿蓋上，同時(shí)觀察兩個(gè)以上培養(yǎng)皿的結(jié)果，打開(kāi)皿蓋時(shí)，容易混淆。用

記號(hào)筆寫(xiě)上班級(jí)、姓名、日期，本次實(shí)驗(yàn)還要寫(xiě)上樣品來(lái)源（如實(shí)驗(yàn)室空氣或者無(wú)菌室空氣

或者頭發(fā)等），字盡量小些，寫(xiě)在皿底的一邊，不要寫(xiě)在當(dāng)中，以免影響觀察結(jié)果。

2.實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌檢查

（1）空氣將一個(gè)肉膏蛋白陳瓊脂平板放在當(dāng)時(shí)做實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋，使瓊脂培

養(yǎng)基表面暴露在空氣中；將另一肉膏蛋白陳瓊脂平板放在無(wú)菌室或者無(wú)人走動(dòng)的其他實(shí)驗(yàn)

室，移去皿蓋。一小時(shí)后蓋上兩個(gè)皿蓋。

（2）實(shí)驗(yàn)臺(tái)與門的旋鈕

（a）用記號(hào)筆在皿底外面中央畫(huà)一直線，再在此線中間處畫(huà)一垂直線，如圖HT。

（b）取棉簽左手拿含有棉簽的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣與小指、無(wú)名指夾持

棉塞（或者試管帽），將其取出（圖n-2,B）,將管口很快地通過(guò)煤氣燈（或者酒精燈）

的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指與食指將棉簽小心地取出（圖n-2,c）o

放回棉塞（或者試管帽）（圖n-2,D）,并將空試管放在試管架上。

（c）弄濕棉簽左手取滅菌水試管，如上法拔出棉塞（或者試管帽）并燒灼管口，將棉

簽插入水中，再提出水面，在管壁上擠壓一下以除去過(guò)多的水分，小心將棉簽取出，燒灼管

口，放回棉塞（或者試管帽），并將滅菌水試管放在試管架上。

（d）取樣將濕棉簽在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面或者門旋鈕上擦拭約2平方厘米的范圍。

（e）接種按圖11-3,A在火焰旁用左手拇指與食指或者中指使平皿開(kāi)啟成一縫。再將

棉簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動(dòng)一下）（圖II-3,B）,立即閉合皿蓋。并按圖H-2,

E與F,將原放棉簽的空試管拔出棉塞（或者試管帽），燒灼管口，插入用過(guò)的棉簽，將試

管放回試管架。

（f）劃線另取接種環(huán)在火焰上滅菌，如圖n-4,先將環(huán)端燒熱（圖n-4,1）,然后

將接種環(huán)提起垂直放在火焰上（圖II-4,2）,以使火焰接觸金屬絲的范圍廣一些，待接種

環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分，再移向環(huán)端，如此很快

地來(lái)回通過(guò)火焰數(shù)次（圖n-4,3）o

左手拿起平板，同樣開(kāi)啟一縫，將滅過(guò)菌并冷卻了的接種環(huán)（可在瓊脂表面邊緣空白處

試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示太燙），通過(guò)瓊脂頂端的接種區(qū)，向下劃線，直到平板的一半

處（圖II-3,C）o注意：接種環(huán)與瓊脂表面的角度要小，移動(dòng)的壓力不能太大，否則會(huì)刺

破瓊脂。

閉合皿蓋，左手將平板向左轉(zhuǎn)動(dòng)至空白處，右手拿的接種環(huán)再在火焰上燒灼，使冷。接

種環(huán)通過(guò)前面劃的線條再在瓊脂的另一半，按圖n-3,D從上向下來(lái)回劃線至1/2處。

燒灼接種環(huán)，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，按圖II-3,E,劃最后1/4,立刻蓋上皿蓋，燒灼接種環(huán)，放

回原處。

整個(gè)劃線操作均要求無(wú)菌操作，即靠近火焰，而且動(dòng)作要快。

3.人體細(xì)菌的檢查

（1）手指（洗手前與洗手后）

（a）分別在兩個(gè)瓊脂平板上標(biāo)明洗手前與洗手后（當(dāng)然，班級(jí)、姓名、日期各項(xiàng)在每

次寫(xiě)標(biāo)簽時(shí)是必不可少的）。

（b）移去皿蓋，將未洗過(guò)的手指在瓊脂平板的表面，輕輕地來(lái)回劃線，蓋上皿蓋。

（c）用肥皂與刷子，用力刷手，在流水中沖洗干凈，干燥后，在另一瓊脂平板表面來(lái)

回移動(dòng)，蓋上皿蓋。

（2）頭發(fā)在掀開(kāi)皿蓋的瓊脂平板的上方，用手將頭發(fā)用力搖動(dòng)數(shù)次，使細(xì)菌降落到瓊

脂平板表面，然后蓋上皿蓋。

（3）咳嗽將去蓋瓊脂平板放在離口約6—8cm處，對(duì)著瓊脂表面用力咳嗽，然后蓋上

皿蓋。

（4）鼻腔

（a）按照實(shí)驗(yàn)臺(tái)檢查法的步驟（b）與（c）,取出棉簽，并將其弄濕。

（b）用濕棉簽在鼻腔內(nèi)滾動(dòng)數(shù)次。

（c）按實(shí)驗(yàn)臺(tái)檢查法的步驟（e）與（f）,接種與劃線，然后蓋上皿蓋。

4.將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底在上，放37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1—2天。

5.結(jié)果記錄方法

（1）菌落計(jì)數(shù)在劃線的平板上，假如菌落很多而重疊，則數(shù)平板最后1/4面積內(nèi)的菌

落數(shù)。不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)1/4面積的菌落數(shù)。

（2）根據(jù)菌落大小、形狀、高度、干濕等特征觀察不一致的菌落類型。但要注意，假

如細(xì)菌數(shù)量太多，會(huì)使很多菌落生長(zhǎng)在一起，或者者限制了菌落生長(zhǎng)而變得很小，因而外觀

不典型，故觀察菌落的特點(diǎn)時(shí)，要選擇分離得很開(kāi)的單個(gè)菌落。

菌落特征描寫(xiě)方法如下：

（a）大小大、中、小、針尖狀。可先將整個(gè)平板上的菌落粗略觀察一下，再?zèng)Q定大、

中、小的標(biāo)準(zhǔn)，或者由教師指出一個(gè)大小范圍。

（b）顏色黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。

（c）干濕情況干燥、濕潤(rùn)、粘稠。

（d）形態(tài)圓形、不規(guī)則等。（e）高度扁平、隆起、凹下。

（f）透明程度透明、半透明、不透明。

（g）邊緣整齊、不整齊。

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1.結(jié)果

（1）將你自己的平板結(jié)果記錄于下表中。

樣品菌落數(shù)菌落特征描寫(xiě)

來(lái)源（近似值）類型大小形態(tài)干濕圖度透明度顏色邊絳

1.1

2

3

4

5

2.1

2

3

4

5

（2）與其他同學(xué)所做的結(jié)果進(jìn)行比較。

2.思考題

（1）比較各類來(lái)源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數(shù)與菌落類型最多？

（2）人多的實(shí)驗(yàn)室與無(wú)菌室（或者無(wú)人走動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室）相比，平板上的菌落數(shù)與菌落

類型有什么區(qū)別？你能解釋一下造成這種區(qū)別的原因嗎？

（3）洗手前后的手指平板，菌落數(shù)有無(wú)區(qū)別？

（4）通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，在防止培養(yǎng)物的污染與防止細(xì)菌的擴(kuò)散方面，你學(xué)到些什么？有

什么體會(huì)？

m.顯微鏡的構(gòu)造、性能與使用方法

由于微生物個(gè)體細(xì)小，因此我們務(wù)必用顯微鏡來(lái)研究它們的個(gè)體形態(tài)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)。熟悉

顯微鏡與掌握顯微鏡的操作技術(shù)是研究微生物不可缺少的手段。

現(xiàn)代顯微鏡通常能夠分為兩大類，一類是光學(xué)顯微鏡，另一類是非光學(xué)顯微鏡。這兩類

顯微鏡又可根據(jù)不一致的情況分成若干類型，現(xiàn)列表如下：

明視野顯微鏡

按照明技術(shù)暗視野顯微鏡

熒光顯微鏡

'相差顯微鏡

可見(jiàn)光顯微鏡按像的形成分干涉相差顯微鏡

,偏光顯微鏡

光學(xué)顯微鏡

顯.倒置顯微鏡

微按鏡體結(jié)構(gòu)分實(shí)體顯微鏡

鏡比較顯微鏡

.紫外光顯微鏡

不可見(jiàn)光顯微鏡紅外光顯微鏡

姍線顯微鏡

透射電子顯微鏡

電子顯微鏡

非光學(xué)顯微鏡掃描電子顯微鏡

超聲波顯微鏡

本部分包含普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡與電子顯微鏡四個(gè)實(shí)驗(yàn)。目的

在于使同學(xué)們通過(guò)這四個(gè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)兩種類型的顯微鏡有較全面的熟悉，并重點(diǎn)掌握明視野普

通光學(xué)顯微鏡的使用。關(guān)于電子顯微鏡則著重熟悉其工作原理，并要求掌握制作電子顯微鏡

標(biāo)本的基本技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)二普通光學(xué)顯微鏡

一、目的要求

1.熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功能。2.學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理與使用方法。

二、顯微鏡的基本構(gòu)造

顯微鏡由機(jī)械裝置與光學(xué)系統(tǒng)兩大部分構(gòu)成(圖IIIT)。

1.機(jī)械裝置

鏡座(base)與鏡臂(arm)鏡座位于顯微鏡底部，呈馬蹄形，它支持全鏡。鏡臂有固

定式與活動(dòng)式兩種，活動(dòng)式的鏡臂可改變角度。鏡臂支持鏡筒。

鏡筒(bodytube)是由金屬制成的圓筒，上接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器。鏡筒有單筒與雙筒

兩種，單筒又可分為直立式與后傾式兩種。而雙筒則都是傾斜式的，傾斜式鏡筒傾斜45°。

雙筒中的一個(gè)目鏡有屈光度調(diào)節(jié)裝置，以備在兩眼視力不一致的情況下調(diào)節(jié)使用。

轉(zhuǎn)換器(nosepiece)為兩個(gè)金屬碟所合成的一個(gè)轉(zhuǎn)盤(pán)，其上裝3—4個(gè)物鏡，可使每

個(gè)物鏡通過(guò)鏡筒與目鏡構(gòu)成一個(gè)放大系統(tǒng)。

載物臺(tái)(stage)又稱鏡臺(tái)，為方形或者圓形的盤(pán)，用以載放被檢物體，中心有一個(gè)通

光孔。在載物臺(tái)上有的裝有兩個(gè)金屬壓夾稱標(biāo)本夾，用以固定標(biāo)本；有的裝有標(biāo)本推動(dòng)器,

將標(biāo)本固定后，能向前后左右推動(dòng)。有的推動(dòng)器上還有刻度，能確定標(biāo)本的位置，便于找到

變換的視野。

調(diào)焦裝置是調(diào)節(jié)物鏡與標(biāo)本間距離的機(jī)件，有粗動(dòng)螺旋(coarseadjustment)即粗調(diào)

節(jié)器與微動(dòng)螺旋(fineadjustment)即細(xì)調(diào)節(jié)器，利用它們使鏡筒或者鏡臺(tái)上下移動(dòng)，當(dāng)

物體在物鏡與目鏡焦點(diǎn)上時(shí)，則得到清晰的圖像。

2.光學(xué)系統(tǒng)

物鏡(objective)物鏡安裝在鏡筒下端的轉(zhuǎn)換器上，因接近被觀察的物體，故又稱接

物鏡。其作用是將物體作第一次放大，是決定成像質(zhì)量與分辨能力的重要部件。物鏡上通常

標(biāo)有數(shù)值孔徑、放大倍數(shù)、鏡筒長(zhǎng)度、焦距等要緊參數(shù)。如：NA0.30；10X；160/0.17；

16mm。其中"NA0.30”表示數(shù)值孔徑(numericalaperture,簡(jiǎn)寫(xiě)為NA),"10X"表示

放大倍數(shù)，“160/0.17”分別表示鏡筒長(zhǎng)度與所需蓋玻片厚度(mm),16mm表示焦距。

目鏡(ocularlens)裝于鏡筒上端，由兩塊透鏡構(gòu)成。鏡把物鏡造成的像再次放大,

不增加分辨力，上面通常標(biāo)有7X、10X、15X等放大倍數(shù)，可根據(jù)需要選用。通?？砂磁c

物鏡放大倍數(shù)的乘積為物鏡數(shù)值孔徑的500—700倍，最大也不能超過(guò)1000倍的選擇。目鏡

的放大倍數(shù)過(guò)大，反而影響觀察效果。

聚光器(condenser)光源射出的光線通過(guò)聚光器匯聚成光錐照射標(biāo)本，增強(qiáng)照明度與

造成適宜的光錐角度，提高物鏡的分辨力。聚光器由聚光鏡與虹彩光圈(irisdiaphragm)

構(gòu)成，聚光鏡由透鏡構(gòu)成，其數(shù)值孔徑可大于1,當(dāng)使用大于1的聚光鏡時(shí)，需在聚光鏡與

載玻片之間加香柏油，否則只能達(dá)到1.0。虹彩光圈由簿金屬片構(gòu)成，中心形成圓孔，推

動(dòng)把手可隨意調(diào)整透進(jìn)光的強(qiáng)弱。調(diào)節(jié)聚光鏡的高度與虹彩光圈的大小，可得到適當(dāng)?shù)墓庹?/p>

與清晰的圖像。

光源(lightsource)較新式的顯微鏡其光源通常是安裝在顯微鏡的鏡座內(nèi)，通過(guò)按鈕

開(kāi)關(guān)來(lái)操縱；老式的顯微鏡大多是使用附著在鏡臂上的反光鏡，反光鏡是一個(gè)兩面鏡子，一

面是平面，另一面是凹面。在使用低倍與高倍鏡觀察時(shí)，用平面反光鏡；使用油鏡或者光線

弱時(shí)可用凹面反光鏡。

濾光片(filter)可見(jiàn)光是各類顏色的光構(gòu)成的，不一致顏色的光線波長(zhǎng)不一致。如只

需某一波長(zhǎng)的光線時(shí)，就要用濾光片。選用適當(dāng)?shù)臑V光片，能夠提高分辨力，增加影像的反

差與清晰度。濾光片有紫、青、藍(lán)、綠、黃、橙、紅等各類顏色的，分別透過(guò)不一致波長(zhǎng)的

可見(jiàn)光，可根據(jù)標(biāo)本本身的顏色，在聚光器下加相應(yīng)的濾光片。

3.成像原理

普通光學(xué)顯微鏡的成像原理如圖山-2所示。

三、油鏡物鏡的基本原理

微生物學(xué)研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡(16mm,10X)、高倍物鏡(4mm,40

-45X)與油鏡(1.8mm,95—100X)三種。油鏡通常標(biāo)有黑圈或者紅圈，也有的以“01

(oilimmer-sion)字樣表示，它是三者中放大倍數(shù)最大的。根據(jù)使用不一致放大倍數(shù)的目

鏡，可使被檢物體放大1000—2000多倍。從圖III-3中可看出油鏡的焦距與工作距離(標(biāo)

本在焦點(diǎn)上看得最清晰時(shí)，物鏡與樣品之間的距離)最短，光圈則開(kāi)得最大，因此，在使用

油鏡觀察時(shí)，鏡頭離標(biāo)本十分近，需特別小心。

使用時(shí)，油鏡與其他物鏡的不一致是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油

質(zhì)，稱之油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=l.52,與玻璃相同。當(dāng)光線

通過(guò)載玻片后，可直接通過(guò)香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。假如玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空

氣，則稱之干燥系，當(dāng)光線通過(guò)玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少,

這樣就減低了視野的照明度(圖III-4)。

利用油鏡不但能增加照明度，更要緊的是能增加數(shù)值孔徑，由于顯微鏡的放大效能是由

其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度(稱之鏡口角)的一半

正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：

NA=n,sina

式中NA=數(shù)值孔徑；

n=介質(zhì)折射率；

a=最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的半數(shù)。

因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大(圖HI-5),該角度的大小決

定于物鏡的直徑與焦距。同時(shí)，a的理論限度為90°,sin90°=1,故以空氣為介質(zhì)時(shí)(n=l),

數(shù)值孔徑不能超過(guò)1,如以香柏油為介質(zhì)時(shí)，則n增大，其數(shù)值孔徑也隨之增大。如光線入

射角為120。，其半數(shù)的正弦為sin60°=0.87,則:

以空氣為介質(zhì)時(shí)：

NA=1XO.87=0.87

以水為介質(zhì)時(shí)：

NA=1.33X0.87=1.15

以香柏油為介質(zhì)時(shí)：

NA=1.52X0.87=1.32

顯微鏡的分辨力是指顯微鏡能夠辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力。它與物鏡的數(shù)值孔徑成

正比，與光波長(zhǎng)度成反比。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長(zhǎng)越短，則顯微鏡的分辨力

愈大，被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)也愈能明晰地區(qū)別出來(lái)。因此，一個(gè)高的分辨力意味著一個(gè)小的

可分辨距離，這兩個(gè)因素是成反比關(guān)系的，通常有人把分辨力說(shuō)成是多少微米或者納米，這

實(shí)際上是把分辨力與最小分辨距離混淆起來(lái)了。顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小距離來(lái)表

示的。

能辨別兩點(diǎn)之間最小距離=—

式中入=光波波長(zhǎng)。

我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L(zhǎng)度為0.55nm,假如數(shù)值孔徑為0.65的高倍物鏡，

它能辨別兩點(diǎn)之間的距離為0.42口m。而在0.42um下列的兩點(diǎn)之間的距離就分辨不出，

即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用數(shù)值孔徑更

大的物鏡，增加其分辨力才行。比如用數(shù)值孔徑為1.25的油鏡時(shí)，能辨別兩點(diǎn)之間的

最小距離=點(diǎn)7=0.22|^。

因此，我們能夠看出，假如使用放大率為40倍的高倍物鏡(NA=0.65),與放大率為

24倍的目鏡，盡管總放大率為960倍，但其分辨的最小距離只有0.42um。假如使用放大

率為90倍的油鏡(NA=1.25),與放大率為9倍的目鏡，盡管總的放大率為810倍，但卻

能分辨出0.2211m間的距離。

四、器材

顯微鏡，顯微鏡燈，香柏油，二甲苯；

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)染色玻片標(biāo)本，

枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)染色玻片標(biāo)本。

五、操作步驟

1.觀察前的準(zhǔn)備

(1)置顯微鏡于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約3—4cm。鏡檢者姿勢(shì)要端正，

通常用左眼觀察，右眼便于繪圖或者記錄，兩眼務(wù)必同時(shí)睜開(kāi)，以減少疲勞，亦可練習(xí)左右

眼均能觀察。

(2)調(diào)節(jié)光源，對(duì)光時(shí)應(yīng)避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置

與鏡頭，并刺激眼睛。如陰暗天氣，可用日光燈或者顯微鏡燈照明。

調(diào)節(jié)光源時(shí)，先將光圈完全開(kāi)放，升高聚光鏡至與載物臺(tái)同樣高，否則使用油鏡時(shí)光線

較暗。然后轉(zhuǎn)下低倍鏡觀察光源強(qiáng)弱，調(diào)節(jié)反光鏡，光線較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡；光線

較弱的天然光源或者人工光源宜用凹面鏡。在對(duì)光時(shí)，要使全視野內(nèi)為均勻的明亮度。凡檢

查染色標(biāo)本時(shí)，光線應(yīng)強(qiáng)；檢查未染色標(biāo)本時(shí)，光線不宜太強(qiáng)?？赏ㄟ^(guò)擴(kuò)大或者縮小光圈、

升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)節(jié)光線。

2.低倍鏡觀察

檢查的標(biāo)本需先用低倍鏡觀察，由于低倍鏡視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)與確定檢查的位置。

將金黃色葡萄球菌染色標(biāo)本置鏡臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使觀察對(duì)象處在物

鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使物鏡降至距標(biāo)本約0.5cm處，由目鏡觀察，如今可適當(dāng)?shù)乜s

小光圈，否則視野中只見(jiàn)光亮一片，難見(jiàn)到目的物，同時(shí)用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，直至物

像出現(xiàn)后再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清晰時(shí)為止，然后移動(dòng)標(biāo)本，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到

合適的目的物，并將其移至視野中心，準(zhǔn)備用高倍鏡觀察。

3高倍鏡觀察

將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然

后由目鏡觀察，并認(rèn)真調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜，同時(shí)用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒至物

像出現(xiàn)后，再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至物像清晰為止，找到最適宜觀察的部位后，將此部位移至視

野中心，準(zhǔn)備用油鏡觀察。

4.油鏡觀察

（1）用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2cm,將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。

（2）在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。

（3）從側(cè)面凝視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎

與標(biāo)本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不可用力過(guò)猛，否則不僅壓碎玻片，也會(huì)損壞

鏡頭。

'°（4）從接目鏡內(nèi)觀察，進(jìn)一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升,

直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如油鏡已離開(kāi)油面而仍未見(jiàn)物像，務(wù)必

再?gòu)膫?cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。

（5）用同樣的方法觀察枯草芽抱桿菌染色標(biāo)本。

（6）觀察完畢，上旋鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯

（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌

用手或者其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。（7）將各部分還

原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。同時(shí)把聚光鏡降下，以免接物鏡

與聚光鏡發(fā)生碰撞危險(xiǎn)。

六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1.結(jié)果

分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡與油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌及枯草芽抱桿菌的狀

態(tài)，包含在三種情況下視野中的變化，同時(shí)注明物鏡放大倍數(shù)與總放大率。

2.思考題

（1）在使用高倍鏡與油鏡進(jìn)行調(diào)焦時(shí)，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？

（2）用油鏡觀察時(shí)，為什么要在載玻片上滴加香柏油？

（3）在明視野顯微鏡下，觀察細(xì)菌形態(tài)時(shí)，你認(rèn)為用染色標(biāo)本好，還是用未染色的活

標(biāo)本好，為什么？

實(shí)驗(yàn)三暗視野光學(xué)顯微鏡

一、目的要求

1.熟悉暗視野顯微鏡的基本原理及用途。

2.學(xué)習(xí)并掌握使用暗視野顯微鏡觀察微生物樣品的基本技術(shù)。

二、基本原理

生活的細(xì)菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的，不易看清。暗視野顯微鏡的原理與來(lái)自縫

隙的一束強(qiáng)光通過(guò)暗室時(shí)，可清晰地看到其中細(xì)微灰塵的現(xiàn)象是一樣的，即給樣品照明的光

不直接穿過(guò)物鏡，而是由樣品上反射或者折射的光進(jìn)入物鏡，那么，在漆黑的視野中，由于

反差增大了，使樣品能夠看得更清晰。因用暗視野法能夠在黑暗的視野中看到光亮的菌體,

故在觀察生活細(xì)菌及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)經(jīng)常使用此法。

暗視野顯微鏡的構(gòu)造要緊是使用一種特殊的聚光器,在聚光器的下方中央為圓形黑盤(pán)所

遮，光僅由周緣進(jìn)入，使光會(huì)聚于載玻片上，并斜照物體，物體經(jīng)斜射照明后，發(fā)出反射光

可進(jìn)入物鏡，這樣，造成顯微鏡視野黑暗，而其中的物體明亮。如無(wú)暗視野顯微鏡時(shí)，只需

將明視野顯微鏡上的聚光器取下，換上暗視野聚光器即可；也可在明視野顯微鏡聚光器下面

的濾光鏡支架上放一片星形擋板（stardiaphragm）（圖III-6）構(gòu)成暗視野，這種方法適用

于低倍鏡觀察。

在暗視野中，由于有些活細(xì)胞其外表比死細(xì)胞明亮，因此暗視野也被用來(lái)區(qū)分死、活細(xì)

胞，此技術(shù)現(xiàn)已被用于各類酵母細(xì)胞的死、活鑒別。止匕外，暗視野顯微鏡關(guān)于觀察嬌弱的微

生物，如梅毒密螺旋體（Treponemapallidum）特別有用。

三、器材

釀酒酵母（Saccharomy-cescerevisiae）；

暗視野顯微鏡，載玻片，蓋玻片，無(wú)菌水。

四、操作步驟

1.選厚薄在L0—1.2mm的干凈載玻片一塊，滴上釀酒酵母懸液，加蓋玻片（注意切

勿有氣泡存在）。

2.將聚光鏡光圈調(diào)至1.4。

3.光源的光圈孔調(diào)至最大。

4.在聚光器上放一大滴香柏油，將標(biāo)本置載物臺(tái)上，旋上聚光器使油與載玻片接觸（不

能有氣泡發(fā)生）。

5.用低倍物鏡及7X目鏡進(jìn)行配光對(duì)準(zhǔn)物體。調(diào)節(jié)聚光器的高度，首先在載玻片上出

現(xiàn)一個(gè)中間有一黑點(diǎn)的光圈，最后為一光亮的光點(diǎn)（圖III-7）,光點(diǎn)愈小愈好，由此點(diǎn)將聚

光器上下移動(dòng)時(shí)均使光點(diǎn)增大。

6.換上所需目鏡與高倍鏡，緩慢上升物鏡進(jìn)行調(diào)焦，至視野中心出現(xiàn)發(fā)光的樣品。

7.在蓋玻片上滴一滴香柏油，并將油鏡轉(zhuǎn)至應(yīng)在位置調(diào)節(jié)配光，進(jìn)行觀察。

五、注意事項(xiàng)

1.進(jìn)行暗視野觀察時(shí)，聚光鏡與載玻片之間滴加的香柏油要充滿，否則照明光線于聚

光鏡上面進(jìn)行全面反射，達(dá)不到被檢物體，從而不能得到暗視野照明。

2.在進(jìn)行暗視野觀察標(biāo)本前，一定要進(jìn)行聚光鏡的中心調(diào)節(jié)與調(diào)焦，使焦點(diǎn)與被檢物

體一致。

3.由于暗視野聚光鏡的數(shù)值孔徑都較大（NA=1.2-1.4）,焦點(diǎn)較淺，因此，過(guò)厚

被檢物體無(wú)法調(diào)在聚光鏡焦點(diǎn)處，通常載玻片厚度為1.0mm左右，蓋玻片厚度宜在0.161nm

下列，同時(shí)載玻片、蓋玻片應(yīng)很清潔，無(wú)油脂及劃痕，否則都會(huì)嚴(yán)重地?cái)_亂最終的像。

六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

思考題

（1）觀察活細(xì)胞的個(gè)體形態(tài)，你認(rèn)為用顯微鏡的明視野好？還是暗視野好？為什么？

（2）你所觀察到的釀酒酵母，在暗視野中能否區(qū)分死、活細(xì)胞？

（3）暗視野觀察時(shí)，所用的載玻片、蓋玻片有何要求？為什么？

實(shí)驗(yàn)四相差顯微鏡

一、目的要求

1.熟悉相差顯微鏡的基本原理與用途。

2.學(xué)習(xí)掌握相差顯微鏡的操作技術(shù)。

二、基本原理

暗視野顯微鏡能夠看到活細(xì)胞的外部形態(tài)，但是看不清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡不僅能觀

察活細(xì)胞的形態(tài)，而且還能看到細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)與細(xì)胞分裂的連續(xù)過(guò)程。

光線通過(guò)透明物體如活細(xì)菌細(xì)胞后，由于受透明物體中密度與折射率不一致的物質(zhì)的影

響，部分光線變成了繞射光，光波的相位發(fā)生變化，而這種相位差不表現(xiàn)為明暗與顏色上的

差異，不能在顯微鏡視野中觀察到。相差顯微鏡就是將通過(guò)透明物體的直射光延遲或者提早，

并與繞射光產(chǎn)生干涉，使相位差變?yōu)檎穹?。假如產(chǎn)生的干涉為相長(zhǎng)干涉（圖IH-8,R組光

線），則振幅的同相量相加而變大，我們便看到較亮的部分；假如所產(chǎn)生的干涉為相消干涉

時(shí)（如圖IH-8,S組光線），則振幅異相量相消而變小，這部分就變得較暗。這樣，變相位

差為振幅差的結(jié)果，使原先透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對(duì)比度增加，能更清晰地觀

察活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。

相差顯微鏡成像原理與裝置如圖III-9所示。

在普通光學(xué)顯微鏡上增加下列四種附件就成為相差顯微鏡：

（1）環(huán)狀光闌

相差顯微鏡的聚光鏡光闌是環(huán)狀光闌。照明光線只能從環(huán)狀的透明區(qū)進(jìn)入聚光鏡再斜射

到標(biāo)本上（斜射角度遠(yuǎn)小于暗視野聚光鏡）。大小不一致的環(huán)狀光闌成一轉(zhuǎn)盤(pán)（圖m-10,A）,

安裝于聚光鏡下面，更換放大率不一致的物鏡時(shí)，要同時(shí)更換與其相應(yīng)的光闌。

（2）相差物鏡（鏡頭上標(biāo)有PC或者PH字樣）

物鏡的后焦平面上裝有相板，這是相差顯微鏡的要緊裝置。相板上與環(huán)狀光闌相對(duì)應(yīng)的

環(huán)狀部分大多數(shù)是涂的汲取膜與推遲相位膜，其他部分完全透明。從標(biāo)本上射過(guò)來(lái)的光線,

繞射光部分穿過(guò)透明區(qū)；直射光則穿過(guò)相板的環(huán)狀部分，光強(qiáng)度減弱，相位也適當(dāng)改變。通

常所用的相板推遲相位1/4,汲取80%的直射光，這樣，就使直射光與繞射光的強(qiáng)度接近,

而相位差則增大或者減少。由于透明標(biāo)本內(nèi)部構(gòu)造的折射率不一致，產(chǎn)生繞射光的相位就會(huì)

有不一致程度的推遲，繞射光與直射光的干涉作用將相位差變成振幅差。

（3）綠色濾光片

為了獲得良好的相差，最好用單色光線照明，通常選用綠色光線。

（4）合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡

為使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線上，務(wù)必拔出目鏡，裝上特別的低倍望

遠(yuǎn)鏡（圖IIITO,B）,使相板的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的明環(huán)合軸（圖IIIT1）。

三、器材

相差顯微鏡，1.0mm下列載玻片，0.16-0.17mm下列蓋玻片；釀酒酵母水浸片，枯草

芽抱桿菌水浸片。

四、操作步驟

1.將釀酒酵母水浸片置載物臺(tái)上，夾好。

2.轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器下面的環(huán)狀光闌轉(zhuǎn)盤(pán)至“0”，并將光圈開(kāi)到最大。

3.通過(guò)普通目鏡與低倍相差物鏡（如10義）調(diào)節(jié)焦距，看清標(biāo)本。

4.轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使油鏡相差物鏡（90X）對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)環(huán)狀光闌轉(zhuǎn)盤(pán)至40,使

與所用的物鏡相符。

5.用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)焦距，使物像清晰。

6.取下目鏡，換上合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，轉(zhuǎn)動(dòng)望遠(yuǎn)鏡使聚光鏡中的亮環(huán)與物鏡中的暗環(huán)看

清晰。

7.轉(zhuǎn)動(dòng)聚光鏡左右二側(cè)的調(diào)節(jié)桿，使兩環(huán)重合。

8.取下望遠(yuǎn)鏡換上目鏡進(jìn)行觀察，每更換標(biāo)本或者改變不一致倍數(shù)的相差物鏡時(shí)，都

務(wù)必依上法重新合軸調(diào)節(jié)。

9.換上枯草芽抱桿菌的水浸片進(jìn)行觀察（務(wù)必先進(jìn)行合軸調(diào)節(jié)）。

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1.結(jié)果

繪出你用相差顯微鏡所觀察到的釀酒酵母與枯草芽泡桿菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.思考題

為什么說(shuō)相差顯微鏡適于觀察活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)？

實(shí)驗(yàn)五電子顯微鏡

一、目的要求

1.熟悉電子顯微鏡的工作原理。

2.學(xué)習(xí)并掌握制備電鏡標(biāo)本的方法。

二、基本原理

1.電子顯微鏡的分辨力與放大率

電子顯微鏡是利用電子流代替光學(xué)顯微鏡的光束使物體放大成像而由此得名的。發(fā)射電

子流的電子源部分稱之電子槍，電子槍由發(fā)射電子的“V”形鴇絲及陽(yáng)極板構(gòu)成，在高真空

中，鴿絲被加熱到白