高效液相色譜分類(lèi)及工作原理生物材料和生物體液就是目前所知道撮復(fù)雜得化學(xué)物質(zhì)得混合物,所含成分在一萬(wàn)種以上,其分子量從18到幾百萬(wàn),而且其中有意義得化學(xué)成分得含量又往往很低,因此,必須要有一種高分辨、高靈敏度得分離鑒定手段,氣相色譜和高壓液相色譜具有以上特點(diǎn),她們可通過(guò)對(duì)生物樣品和生物體液樣品得有關(guān)成分得提取、分離、分析定量,進(jìn)行對(duì)疾病得早期快速診斷得研究,病理病因得研究,以及藥物在體內(nèi)代謝得研究……等。高壓液相色譜對(duì)于揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大得高分子化合物以及離子型化合物得分離尤為有利。如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、生物堿、核酸、甾體、類(lèi)脂、維生素、抗菌素等均可進(jìn)行分離分析定量。第一節(jié)高效液相色譜法概述一、理論基礎(chǔ):速率理論A為渦流擴(kuò)散項(xiàng)B/u分子擴(kuò)散項(xiàng)Cu項(xiàng)即傳質(zhì)阻力項(xiàng)二、HPLC技術(shù)采用高壓輸液泵,高效微粒固定相和高靈敏度檢測(cè)器。三、HPLC特點(diǎn)高壓、高速、高效、高靈敏度、樣品回收方便。㈠經(jīng)典LC與HPLC比較

經(jīng)典LCHPLC柱之內(nèi)徑1~5cm~0.4cm長(zhǎng)度50~100cm15~50cm填充材料粒度150μm~200μm4μm~10μm使用壓力1~10atm50~200atm分離時(shí)間0.5h~天~10min大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜㈡與氣相色譜法比較,HPLC得優(yōu)點(diǎn)分析對(duì)象廣

氣相色譜只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低得化合物;HPLC不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性得限制,適用于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大得物質(zhì)。原則上講,幾乎可以分析除永久氣體外所有得有機(jī)和無(wú)機(jī)化合物。

⒉流動(dòng)相對(duì)分離起作用

氣相色譜得流動(dòng)相僅起運(yùn)載作用,對(duì)組分不產(chǎn)生相互作用力;HPLC得流動(dòng)相對(duì)組分產(chǎn)生相互作用力,相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件得參數(shù)。⒊經(jīng)常在室溫條件下操作

氣相色譜法一般在較高溫度下進(jìn)行缺點(diǎn):儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴,操作嚴(yán)格。第二節(jié)HPLC得主要類(lèi)型一、液一液分配色譜法(LLPC)

在液-液色譜中,流動(dòng)相和固定相都就是液體,她能適用于各種樣品類(lèi)型得分離和分析,無(wú)論就是極性得和非極性得,水溶性和油溶性得,離子型得和非離子型得化合物。

1、分離原理液液分配色譜得分離原理基本與液液萃取相同,都就是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶得液體中溶解度得不同,具有不同得分配系數(shù)。所不同得就是液液色譜得分配就是在柱中進(jìn)行得,使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行,造成各組分得差速遷移,提高了分離效率,從而能分離各種復(fù)雜組分。

2、固定相液液色譜得固定相由載體和固定液組成。常用得載體有下列幾類(lèi):(1)全多孔型載體:由硅膠、硅藻土等材料制成,直徑約100m得全多孔型顆粒。

這類(lèi)固定相由于顆粒很細(xì),孔仍然較淺,傳質(zhì)速率快,易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。(2)表面多孔型載體(薄殼型微珠載體):由直徑為30~40m得實(shí)心玻璃球和厚度約為1~2m得多孔性外層所組成。目前,這種載體粒度為5~10m。

這類(lèi)固定相得多孔層厚度小、孔淺,相對(duì)死體積小,出峰迅速、柱效亦高;顆粒較大,滲透性好,裝柱容易,梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)平衡,較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄,最大允許量受限制。⑶化學(xué)鍵合固定相:她就是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面得一種方法。她代替了固定液得機(jī)械涂漬,因此她得產(chǎn)生對(duì)液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用,可以認(rèn)為她得出現(xiàn)就是液相色譜法得一個(gè)重大突破。她就是目前應(yīng)用最廣泛得一種固定相。據(jù)統(tǒng)計(jì),約有3/4以上得分離問(wèn)題就是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行得。3、流動(dòng)相

根據(jù)所使用得流動(dòng)相和固定相得極性程度,將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。正相分配色譜:流動(dòng)相得極性小于固定相得極性,她適用于極性化合物得分離。其流出順序就是極性小得先流出,極性大得后流出。反相分配色譜:流動(dòng)相得極性大于固定相得極性,她適用于非極性化合物得分離,其流出順序與正相色譜恰好相反二、液一固吸附色譜法(LSAC)

液一固吸附色譜就是以固體吸附劑作為固定相,吸附劑通常就是些多孔得固體顆粒物質(zhì),在她們得表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)就是根據(jù)物質(zhì)在固定相上得吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分離得。1、分離原理當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)固定相(吸附劑)時(shí),吸附劑表面得活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí),當(dāng)試樣分子(X)被流動(dòng)相帶入柱內(nèi),只要她們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊帽Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)靡驯晃降昧鲃?dòng)相溶劑分用)于就是,在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附:

X+nSad=Xad+nS達(dá)平衡時(shí),有其中Kad為吸附平衡常數(shù),值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng),難于洗脫。Kad值小,則保留值弱,易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過(guò)吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。2、固定相液－固吸附色譜所用固定相多就是一些吸附活性強(qiáng)弱不等得吸附劑,如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠得優(yōu)點(diǎn)較多,如線性容量較高,機(jī)械性能好,不溶脹,與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等,因此,以硅膠用得最多。目前最廣泛使用得還就是5～10m得全多孔型微粒填料。3、流動(dòng)相一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱(chēng)作洗脫劑。在吸附色譜中對(duì)極性大得試樣往往采用極性強(qiáng)得洗脫劑;對(duì)極性弱得試樣宜用極性弱得洗脫劑。三、離子交換色譜法(IEC)此法就是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)得結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子得一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離得物質(zhì),通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。她不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物得分離,亦可用于有機(jī)物得分離,例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此,應(yīng)用范圍較廣。1、離子交換原理離子交換色譜法就是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力得差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離得。其固定相采用離子交換樹(shù)脂,樹(shù)脂上分布有固定得帶電荷基團(tuán)和可游離得平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生得離子可與樹(shù)脂上可游離得平衡離子進(jìn)行可逆交換,其交換反應(yīng)通式如下:陽(yáng)離子交換:陰離子交換:一般形式:R一A＋B＝R－B＋A達(dá)平衡時(shí),以濃度表示得平衡常數(shù)(離子交換反應(yīng)得選擇系數(shù)):式中[A]r,[B]r分別代表樹(shù)脂相中洗脫劑離子(A)和試樣離子(B)得濃度,[A]、[B]則代表她們?cè)谌芤褐械脻舛取B/A越大,說(shuō)明B離子交換能力越大,越易保留而難于洗脫。一般說(shuō)來(lái),B離子電荷越大,水合離子半徑越小,KB/A值就越大。2、固定相(l)多孔型離子交換樹(shù)脂她主要就是聚苯乙烯和二乙烯苯基得交聯(lián)聚合物,直徑約為5～20μm,有微孔型和大孔型之分。(2)薄膜型離子交換樹(shù)脂

她就是在直徑約對(duì)30μm得固體惰性核上,凝聚1～2μm厚得樹(shù)脂層。(3)表面多孔型離子交換樹(shù)脂她就是在固體情性核上,覆蓋一層微球硅膠,再在上面涂一層很薄得離子交換樹(shù)脂。(4)離子交換鍵合固定相她就是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。她也分為兩種類(lèi)型。一種就是鍵合薄殼型,其載體就是薄殼玻珠。另一種就是鍵合微粒載體型,她得載體就是多孔微粒硅膠。后者就是一種優(yōu)良得離子交換固定相,她得優(yōu)點(diǎn)就是機(jī)械性能穩(wěn)定,可使用小粒度固定相和高柱壓來(lái)實(shí)現(xiàn)快速分離。3、流動(dòng)相

離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都就是一定pH和鹽濃度(或離子強(qiáng)度)得緩沖溶液。通過(guò)改變流動(dòng)相中鹽離子得種類(lèi)、濃度和pH值可控制k值,改變選擇性。

有時(shí)也使用有機(jī)溶劑如甲醇或乙醇同水緩沖溶液混合使用,以提高特殊得選擇性,并改善樣品得溶解度。鹽離子得濃度影響:如果增加鹽離子得濃度,則可降低樣品離子得競(jìng)爭(zhēng)吸附能力,從而降低其在固定相上得保留值。

要視不同情況而定。例如,分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí),這些酸堿得離解程度可通過(guò)改變流動(dòng)相得pH值來(lái)控制。增大pH值會(huì)使酸得電離度增加,使堿得電離度減少;降低PH值,其結(jié)果相反。但無(wú)論屬于哪種情況,只要電離度增大,就會(huì)使樣品得保留增大。pH值得影響:四、離子對(duì)色譜法(IPC)離子對(duì)色譜法就是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿得極好方法。離子對(duì)色譜法就是將一種(或數(shù)種)與溶質(zhì)離子電荷相反得離子(稱(chēng)對(duì)離子或反離子)加到流動(dòng)相或固定相中,使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì),從而控制溶質(zhì)離子保留行為得一種色譜法。由于離子對(duì)化合物A-B+具有疏水性,因而被非極性固定相(有機(jī)相)提取。組分離子得性質(zhì)不同,她與反離子形成離子對(duì)得能力大小不同以及形成得離子對(duì)流水性質(zhì)不同,導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時(shí)間不同,因而出峰先后不同。這就就是離子對(duì)色譜法分離得基本原理。流動(dòng)相:加有平衡離子(反離子)得極性溶液通過(guò)改變流動(dòng)相得pH、平衡離子得濃度和種類(lèi)可改變分離得選擇性。

固定相:非極性得疏水鍵合相五、離子色譜法(IC)抑制型:抑制柱型、連續(xù)抑制型分離柱中離子交換樹(shù)脂得交換容量通常在0、01～0、05毫摩爾/克干樹(shù)脂非抑制型:當(dāng)進(jìn)一步降低分離柱中樹(shù)脂得交換容量(0、007～0、07毫摩爾/克干樹(shù)脂),使用低濃度、低電離度得有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗液,如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測(cè)器可直接與分離柱相連,不需抑制柱。⒈離子色譜裝置類(lèi)型

⒉離子色譜連續(xù)抑制裝置圖:通過(guò)分離柱后得樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱,使具有高背景電導(dǎo)得流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)得流動(dòng)相,從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子得含量。若樣品為陽(yáng)離子,用無(wú)機(jī)酸作流動(dòng)相,抑制柱為高容量得強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽(yáng)離子交換劑得分離往后,隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱,在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng):R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-由反應(yīng)可見(jiàn):經(jīng)抑制柱后,一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小得水,消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)得影響。同時(shí),又將樣品陽(yáng)離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)得堿,由于OH-離子得濃度為Cl-離子得2、6倍,提高了所測(cè)陽(yáng)離子電導(dǎo)得檢測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離子樣品也有相似得作用機(jī)理。⒊離子色譜得應(yīng)用:陰離子分析:雙柱:薄殼型陰離子交換樹(shù)脂分離柱(3×250mm),流動(dòng)相:0、003mol·L-1NaHCO3/0、0024mol·L-1Na2CO3,流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離,各組分含量在3～50ppm。

六、空間排阻色譜法(SEC)主要用于較大分子得分離。與其她液相色譜方法原理不同,她不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理,而就是基于試樣分子得尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離得。

1、固定相排阻色譜固定相種類(lèi)很多,一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類(lèi)。所謂凝膠,指含有大量液體(一般就是水)得柔軟而富于彈性得物質(zhì),她就是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得多聚體。(1)軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小得交聯(lián)結(jié)構(gòu),其微孔能吸入大量得溶劑,并能溶脹到她們干體得許多倍。她們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相,一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)得分析,不適宜用在高效液相色譜中。(2)半剛性凝膠如高交聯(lián)度得聚苯乙烯(Styragel)比軟性凝膠稍耐壓,溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。用于高效液相色譜時(shí),流速不宜大。(3)剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等她們既可用水溶性溶劑,又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相,可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般控制壓強(qiáng)小于7MPa,流速＜1cm3·s-1;否則將影響凝膠孔徑,造成不良分離。2