第二節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)

【學(xué)習(xí)目標(biāo)】

1.根據(jù)DNA復(fù)制的原理及過程，理解PCR技術(shù)的原理及過程。

2.掌握PCR技術(shù)的基本操作。

【學(xué)習(xí)重、難點】

重點

1.嘗試PCR（DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本操作。

2.理解PCR的原理，討論P(yáng)CR技術(shù)的應(yīng)用。

難點

1.嘗試PCR（DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本操作。

2.體驗PCR這一常規(guī)分子生物學(xué)實驗方法。

【學(xué)習(xí)要點梳理】

一、PCR體外擴(kuò)增DNA與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較

體內(nèi)復(fù)制PCR反應(yīng)

在解旋酶的作用下，細(xì)胞提供加熱至94℃左右，雙鏈全部解

解旋

不同能量，部分解開開，不需解旋酶

點

可以是RNA或單鏈DNA分子片

引物小段RNA

段

分別從兩條鏈的引物端開始，都

不同合成在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合

是連續(xù)合成，控制溫度在72℃

點子鏈成，另一條鏈不連續(xù)合成

左右

特點邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制體外迅速擴(kuò)增

DNA

需要TaqDNA

聚合需要

聚合酶

酶

循環(huán)

受生物體自身控制30多次

次數(shù)

不同

點溫度體內(nèi)溫和條件高溫（可變）

產(chǎn)物完整DNADNA片段

①需提供DNA復(fù)制的模板

②以四種脫氧核甘酸為原料

相同點

③都需要一定的緩沖溶液

④子鏈延伸的方向都是從5,端到3,端

特別提醒①DNA母鏈的3,端對應(yīng)著子鏈的5端，即DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫?/p>

的。

②解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵斷開，而DNA聚合酶與DNA連接酶都

可催化形成磷酸二酯鍵。

③DNA聚合酶是將單個核甘酸加到已有的單鏈片段的3,羥基上，需要模板，而

DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，不需要模板。

④在PCR反應(yīng)中，加入的四種脫氧核甘酸實際上是四種脫氧核甘三磷酸，既是

原料，也是能源。

⑤在PCR反應(yīng)中加入的Mg2+實際上是Taq聚合酶的激活劑。

二、PCR技術(shù)相關(guān)知識分析

LPCR原理：DNA熱變性的原理

雙鏈DNA（變隹（些。）>單鏈DNA

,退火（溫度緩慢降低）

2.PCR引物

(1)弓I物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA

互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補(bǔ)的

寡核甘酸鏈作引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

(2)引物3,端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避

免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。

(3)引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他序列無明顯同源性。

3.PCR擴(kuò)增的過程

(1)變性：當(dāng)溫度上升到94℃時，雙鏈DNA解旋為單鏈，如下圖:

3f5,

5'3'

94%：

,「

3???????????~55???????????-3

(2)退火：溫度下降至40?60℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條

單鏈DNA結(jié)合，如下圖：

.1.1.1.1.1.1..；/1115，5,111；..1..1.1.1.1.1.L.

引物I引物n

(3)延伸：當(dāng)溫度上升至72℃左右，溶液中的四種脫氧核甘酸在DNA聚合酶

的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈，如下圖：

1111111111r

引物i引物n

4.PCR擴(kuò)增數(shù)目的理論計算

理論上DNA擴(kuò)增呈指數(shù)增長，若只有一個DNA模板，則復(fù)制n次后有2n

個DNA；若一開始有m個DNA模板，則復(fù)制n次后有mx2n個DNA。實際操

作過程中，由于無關(guān)變量的影響，一般來說，實驗值要略小于理論值。從第二輪

循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為