分子生物學(xué)研究方法

PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用一.多聚酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaciton,PCR)（一）原理熱變性（94度）引物退火（55度）延伸（72度）DNA聚合酶dNTP變性退火引物經(jīng)25~30次循環(huán)，目的DNA增加166-7（二）。PCR反應(yīng)的主要成分和作用1。DNA聚合酶：PCR反應(yīng)使用的是耐熱DNA聚合酶。比如：TaqDNA聚合酶?？煞譃閮纱箢悾海?）具有校正功能的（有3‘5’核酸酶活性）比如：Vent,pfu,pwo等（2）不具有校正功能的（無3‘5’核酸酶活性）比如：一般的TaqDNA聚合酶2。引物（1）引物長度以15~30個(gè)bp為宜。引物過短會使特異性降低，過長時(shí)則成本增加，且也會降低特異性。（2）引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45~55%左右。（3）引物內(nèi)部不應(yīng)形成二級結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物之間尤其在3‘末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在。（4）引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)進(jìn)行輔助檢索分析。（5）引物3‘末端堿基：原則上要求引物3’末端與模板DNA一定要配對。另外引物3‘末端的末位堿基在很大程度上影響著TaqDNA聚合酶的延伸效率。研究表明，引物3‘末端堿基在錯(cuò)誤配對時(shí)，不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異。當(dāng)末位堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能引發(fā)鏈的合成。而末位堿基為T時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)效率大大降低。G,C居于中間，所以3‘末端的末位堿基最好選T,G,C而不選A.(6)引物5‘末端堿基：PCR反應(yīng)物5’末端堿基并沒有嚴(yán)格限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物程度足夠，其5‘末端堿基可以不與模板DNA匹配，而呈游離狀態(tài)。這樣引物設(shè)計(jì)時(shí)可以在5‘末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或其他短的序列?？梢约覣TG起始密碼，可以加錯(cuò)配堿基造成突變。3。PCR反應(yīng)緩沖液：組成50mMKCl10mMTris.Cl(pH8.4)1.5mMMgCl2Mg++是Taq酶活性所必需的金屬離子。Mg++濃度的高低能影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片斷的產(chǎn)率。1.5~2.0mMMg++是比較合適的。Mg++過量能增加非特異性擴(kuò)增并影響產(chǎn)率。4。底物dNTP濃度在PCR反應(yīng)中，dNTP濃度應(yīng)在20~200uM,dNTP濃度過高可加快反應(yīng)速度。同時(shí)，還可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和實(shí)驗(yàn)成本。反之，低濃度的dNTP會導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，但可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。此外，由于dNTP可能與Mg++結(jié)合，因此應(yīng)注意Mg++濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。（三）．怎樣提高PCR的特異性1．熱啟動（hot-start)

比如（1）將Taq酶與其它反應(yīng)體系通過石蠟分隔開

（2）利用Taq酶的單克隆抗體抑制其活性。2.Touchdown

先在高于退火溫度下進(jìn)行幾輪PCR循環(huán)，然后再在退火溫度下進(jìn)行大量擴(kuò)增。3.NestedPCR

先在要擴(kuò)增片斷的外側(cè)設(shè)計(jì)一對引物，進(jìn)行PCR，然后以此PCR產(chǎn)物為模板，再在內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)一對引物擴(kuò)增出我們所要的目的片斷。二PCR的應(yīng)用（一）未知DNA片斷的克隆

1，基因組DNA步移法1234