GB/TXXXXX—XXXX

植物次生代謝產(chǎn)物有機酸的測定

1范圍

本標準規(guī)定了植物次生代謝產(chǎn)物有機酸的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定方法。

本標準適用于蔬菜、水果、中藥材、茶葉、煙草等樣品中酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、

檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、烏頭酸、α-酮戊二酸、己二酸、沒食子酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、丁香

酸、對香豆酸酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸、2,5-二羥基苯甲酸和3,4-二羥基苯甲酸的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3原理

試樣用50%甲醇水溶液加熱回流提取后，經(jīng)反相色譜柱分離，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定和確證，

內(nèi)標法定量。

4試劑或材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

4.1甲醇：色譜純。

4.2甲酸：色譜純。

4.30.1%甲酸水溶液：準確移取甲酸1.0mL于1L容量瓶中，用水定容至刻度。

4.450%甲醇水溶液：準確移取甲醇500.0mL于1L容量瓶中，用水定容至刻度。

4.5有機酸標準品：沒食子酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、酒石酸、奎

寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、烏頭酸、己二酸、α-酮戊二酸、對羥基苯

甲酸、肉桂酸、2,5-二羥基苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸和琥珀酸-2,2,3,3-d4，純度均≥98%。

4.6混合標準儲備液A（酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、烏頭

酸、α-酮戊二酸、沒食子酸混合標準儲備溶液）：分別準確稱取各有機酸標準品50.00mg于10mL容

量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻，配制成5000.0mg/L的有機酸單一標準儲備液，分別吸取適量

各有機酸單一標準儲備液于10mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，混勻，配制成100mg/L的混合

標準儲備液A，于0℃～4℃保存，有效期為3個月。

1

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4.7混合標準儲備液B（己二酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸酸、阿魏酸、對羥基

苯甲酸、肉桂酸、2,5-二羥基苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸混合標準儲備溶液）：分別準確稱取各有機酸

標準品50.00mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，配制成5000mg/L的有機酸單

一標準儲備液，分別吸取適量各有機酸單一標準儲備液于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，

混勻，配制成100mg/L的混合標準儲備液B，于0℃～4℃保存，有效期為3個月。

4.8內(nèi)標儲備液：準確稱取琥珀酸-2,2,3,3-d410.00mg于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并

定容至刻度，混勻，配制成濃度為100mg/L的內(nèi)標儲備液。

4.9內(nèi)標稀釋液Ⅰ：準確吸取內(nèi)標儲備液2.5mL于1L容量瓶中，用50%甲醇水溶液稀釋并定容至刻

度，混勻，即得濃度為250μg/L內(nèi)標稀釋液Ⅰ溶液。

4.10內(nèi)標稀釋液Ⅱ：準確吸取內(nèi)標儲備液1.0mL于100mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液稀釋并定

容至刻度，混勻，即得濃度為1mg/L內(nèi)標稀釋液Ⅱ溶液。

4.11混合系列標準工作溶液：分別準確移取不同體積混合標準儲備液A和混合標準儲備溶液B于10

mL容量瓶中，再準確加入2.5mL內(nèi)標稀釋液Ⅱ，用50%甲醇水溶液稀釋配制成不同濃度的系列標準

工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.120.22μm微孔尼龍濾膜。

5儀器設(shè)備

5.1液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源（ESI）。

5.2電子天平:感量為0.0001g和0.01mg。

5.3高速離心機：轉(zhuǎn)速不低于9500r/min。

5.4水果攪拌機。

5.5高速粉碎機。

5.6旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

6分析步驟

6.1樣品制備

將蔬菜、水果等新鮮樣品用水果攪拌機制成勻漿，制備好的試樣均分為兩份，裝入潔凈的盛樣容器

內(nèi)，密封并標明記號，于-18℃冷凍保存。

中藥材、茶葉、煙草等干制樣品研磨成細粉，樣品全部過425μm的標準網(wǎng)篩，混勻，制備好的試

樣均分為兩份，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并標明記號。

6.2試樣處理

6.2.1干樣前處理

準確稱取約1.5g（精確至0.001g）試樣于250mL圓底燒瓶中，精密加入50mL內(nèi)標稀釋液Ⅰ，

稱定重量，加熱回流2.5h，冷卻至室溫后用50%甲醇水溶液補足失重，混勻，取5mL提取液于10000

2

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r/min下離心5min，取上層清液適量過0.22μm尼龍濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。

6.2.2鮮樣前處理

準確稱取約10g（精確至0.001g）試樣于250mL圓底燒瓶中，加入5mL甲醇于40℃水浴減壓濃

縮至1mL左右，精密加入50mL內(nèi)標稀釋液Ⅰ，稱定重量，加熱回流0.5h，冷卻至室溫后用50%甲

醇水溶液補足失重，混勻，取5mL提取液于10000r/min下離心5min，取上層清液適量過0.22μm尼

龍濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。

6.3儀器參考條件

6.3.1液相色譜條件

a)色譜柱：ACQUITYUPLCHSST3柱，2.1mm×100mm，3μm，或同等性能的色譜柱。

b)流動相：流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序見表1：

c)流速：0.2mL/min。

d)柱溫：35℃。

e)進樣量：1μL。

表1梯度洗脫條件

時間/min流動相體積分數(shù)A/%流動相體積分數(shù)B/%

0955

6955

154060

20595

25595

25.1955

35955

6.3.2質(zhì)譜條件

f)離子源：電噴霧離子源（ESI源）；

g)掃描方式：負離子模式；

h)檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；

i)干燥氣、霧化氣、碰撞氣均為高純氮氣（純度≥99.998%）；使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)

譜靈敏度達到檢測要求，詳細條件參加附錄B。

j)噴霧電壓、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度，參考條件見附錄B中表B.1。

6.4液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定

6.4.1定性測定

在相同的實驗條件下，樣品溶液中被測物的色譜峰保留時間和標準工作溶液的一致（變化范圍在±

2.5%以內(nèi)），并且在扣除背景后的樣品溶液譜圖中，所選擇的離子對均出現(xiàn)，而且所選擇的離子對豐度

比和標準品離子對的相對豐度比偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測物。

3

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表2定性離子對相對豐度的最大允許偏差

相對離子豐度/%＞50＞20～50＞10～20≤10

允許的相對偏差/%±20±25±30±50

6.4.2定量測定

在儀器最佳工作條件下，將有機酸系列混合標準工作溶液依次進樣分析，以被測物和內(nèi)標物的定量

離子對峰面積為縱坐標，以被測物和內(nèi)標物的濃度比為橫坐標繪制標準工作曲線，用標準工作曲線對樣

品進行定量，應(yīng)使樣品溶液中各被測物的響應(yīng)值在儀器測定的線性范圍內(nèi)，如果含量超過標準工作曲線

范圍，應(yīng)稀釋到合適濃度后分析。在上述色譜條件下，22種有機酸混合標準工作溶液的多重反應(yīng)監(jiān)測色

譜圖見圖1。

圖1混合有機酸標準工作液多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖

6.5平行試驗

按以上步驟對同一試樣進行平行試驗測定。

7結(jié)果分析

試樣中有機酸的含量按下式計算：

cv

X=

m........................................(2)

式中：

X----試樣中被測組分含量，單位為豪克每千克（mg/kg）；

C----從標準工作曲線得到的被測組分溶液濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)；

V----試樣溶液體積，單位為毫升（mL）；

m----試樣的質(zhì)量，單位為克(g)。

計算結(jié)果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

8精密度

4

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在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

9其他

本方法測定23種有機酸的定量限見附錄A中表A.1。

5

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AA

附錄A

（資料性附錄）

有機酸信息及定量限

表A.1有機酸信息及定量限

定量限（mg/kg）

序號中文名稱英文名稱CAS號分子式分子量

干樣鮮樣

1酒石酸t(yī)artaricacid133-37-9C4H6O6150.091.330.20

2奎寧酸quinicacid77-95-2C7H12O6192.171.330.20

3蘋果酸malicacid636-61-3C4H6O5134.090.330.05

4莽草酸shikimicacid138-59-0C7H10O5174.161.330.20

5乳酸lacticacid50-21-5C3H6O390.085.000.75

6a-酮戊二酸2-ketoglutaricacid328-50-7C5H6O5146.101.330.20

7檸檬酸citricAcid5949-29-1C6H8O7·.H2O210.142.670.40

8富馬酸fumaricacid110-17-8C4H4O4116.071.330.20

9琥珀酸succinicAcid110-15-6C4H6O4118.090.330.05

10烏頭酸aconiticacid4023-65-8C6H6O6174.11166.725.0

11沒食子酸gallicacid5995-86-8C7H6O5·.H2O188.130.330.05

3,4-dihydroxybenzoic

123,4-二羥基苯甲酸99-50-3C7H6O4154.120.33

acid0.05

13己二酸adipicacid124-04-9C6H10O4146.140.660.10

p-hydroxybenzoic

14對羥基苯甲酸99-96-7C7H6O3138.120.33

acid0.05

2,5-dihydroxybenzoic

152,5-二羥基苯甲酸490-79-9C7H5O4154.120.33

acid0.05

16綠原酸chlorogenicacid327-97-9C16H18O9354.310.330.05

17咖啡酸caffeicacid331-39-5C9H8O4180.160.660.10

18香草酸vanillicacid121-34-6C8H8O4168.151.330.20

19丁香酸syringicacid530-57-4C9H10O5198.171.330.20

20對香豆酸p-coumaricacid501-98-4C9H8O3164.160.330.05

21阿魏酸ferulicacid1135-24-6C10H10O4194.180.660.10

22肉桂酸cinnamicacid140-10-3C9H8O2148.1610.001.50

Butanedioic

23琥珀酸-2,2,3,3-d414493-42-6C4H2D4O4122.11//

acid-2,2,3,3-d4

B

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CB

附錄B

（資料性附錄）

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜參數(shù)參考條件1）

參考質(zhì)譜條件如下：

a）掃描方式：負離子模式；

b）檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；

c）干燥氣（N2）溫度：290℃；

d）霧化氣（N2）壓力：30psi；

e）干燥氣流速：7.0L/min；

f）鞘氣溫度：350℃；

g）鞘氣流速：12.0L/min；

h）噴霧電壓：3500V；

i）定性離子對、定量離子對、碰撞能量、碎裂電壓見表B.1。

表B.122種有機酸的MRM質(zhì)譜分析參數(shù)

序號中文名稱保留時間（min）定量離子對定性離子對源內(nèi)碎裂電壓（V）碰撞能（V）

1酒石酸2.739149.0/87.1149.0/87.1；149.0/73.0755；10

2奎寧酸2.724191.1/85.1191.1/85.1；191.1/93.011017；17

3蘋果酸3.402132.9/115.0132.9/115.0；132.9/71.1701；7

4莽草酸3.454173.1/93.0173.1/93.0；173.1/137.06512；2

5乳酸4.11289.1/43.089.1/43.0；89.1/45.1652；2

6a-酮戊二酸3.939145.0/101.1145.0/101.1；145.0/57.1601；1

7檸檬酸5.492191.1/111.0191.1/111.0；191.1/87.0753；9

8富馬酸6.823114.9/71.1114.9/71.1；114.9/32.1501；5

9琥珀酸6.531116.9/73.1116.9/73.1；116.9/99.0653；1

10烏頭酸6.099173.0/85.1173.0/85.1；173.0/128.9553；1

11沒食子酸10.638169.0/125.0169.0/125.0；169.0/124.0957；21

123,4-二羥基苯甲酸17.024153.0/109.1153.0/109.1；153.0/108.0957；19

13己二酸15.521145.1/101.2145.1/101.2；145.1/83.2753；3

14對羥基苯甲酸16.934137.0/93.0137.0/93.0；137.0/65.0807；27

152,5-二羥基苯甲酸14.886153.0/109.0153.0/109.0；153.0/108.0805；17

16綠原酸16.551353.0/191.0353.0/191.0；353.0/85.011510；45

17咖啡酸17.539179.0/135.1179.0/135.1；179.0/134.0907；21

18香草酸17.519167.0/152.0167.0/152.0；167.0/108.01005；12

19丁香酸17.766197.0/182.0197.0/182.0；197.0/123.0855；17

20對香豆酸18.902163.0/119.0163.0/119.0；163.0/93.1807；31

21阿魏酸19.075193.1/134.0193.1/134.0；193.1/178.08510；5

22肉桂酸21.582147.0/103.0147.0/103.0；147.0/77.1552；17

23琥珀酸-2,2,3,3-d46.396121.0/77.0121.0/77.0；147.0/102.07510：10

1）非商業(yè)性聲明：附錄A所列參數(shù)是在Agilent6465質(zhì)譜儀上完成的，此處列出試驗用儀器型號僅是為了提供參

考，并不涉及商業(yè)目的，鼓勵標準使用者嘗試采用不同廠家或型號的儀器。

_________________________________

7

ICS07.080

點擊此處添加中國標準文獻分類號

中華人民共和國國家標準

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植物次生代謝產(chǎn)物有機酸的測定

Determinationoforganicacidsofplantsecondarymetabolites

點擊此處添加與國際標準一致性程度的標識

（征求意見稿）

（本稿完成日期：2019年02月10日）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

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植物次生代謝產(chǎn)物有機酸的測定

1范圍

本標準規(guī)定了植物次生代謝產(chǎn)物有機酸的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定方法。

本標準適用于蔬菜、水果、中藥材、茶葉、煙草等樣品中酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、

檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、烏頭酸、α-酮戊二酸、己二酸、沒食子酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、丁香

酸、對香豆酸酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸、2,5-二羥基苯甲酸和3,4-二羥基苯甲酸的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3原理

試樣用50%甲醇水溶液加熱回流提取后，經(jīng)反相色譜柱分離，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定和確證，

內(nèi)標法定量。

4試劑或材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

4.1甲醇：色譜純。

4.2甲酸：色譜純。

4.30.1%甲酸水溶液：準確移取甲酸1.0mL于1L容量瓶中，用水定容至刻度。

4.450%甲醇水溶液：準確移取甲醇500.0mL于1L容量瓶中，用水定容至刻度。

4.5有機酸標準品：沒食子酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、酒石酸、奎

寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、烏頭酸、己二酸、α-酮戊二酸、對羥基苯

甲酸、肉桂酸、2,5-二羥基苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸和琥珀酸-2,2,3,3-d4，純度均≥98%。

4.6混合標準儲備液A（酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、烏頭

酸、α-酮戊二酸、沒食子酸混合標準儲備溶液）：分別準確稱取各有機酸標準品50.00mg于10mL容

量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻，配制成5000.0mg/L的有機酸單一標準儲備液，分別吸取適量

各有機酸單一標準儲備液于10mL容量瓶中，用水稀釋并定容至