第三章基因工程第二節(jié)基因工程的基本操作程序1.基因工程的基本操作程序：(1)_________________________;(2)_________________________（核心）;(3)_________________________;(4)_________________________。（P76）一、目的基因的篩選與獲取1．目的基因的概念：在基因工程的設計和操作中，用于改變_______________或獲得_______________等的基因。（P76）2.根據不同的需要，目的基因是不同的，主要是指_______________。（P76）3.常見目的基因類型：_______________、__________、__________、__________和__________等相關的基因。實例：培養(yǎng)轉基因抗蟲棉用到的目的基因是_______________。（P76）4．篩選合適的目的基因較為有效的方法：從相關的__________和__________的基因中進行篩選。實例：在培育轉基因抗蟲棉之前，科學家不僅掌握了Bt基因的__________，也對Bt基因的表達產物——_______________有了較為深入的了解。（P76）5.認識基因結構和功能的技術方法：__________技術、__________數據庫（GenBank）、__________工具（如BLAST）等的應用，越來越多的基因的結構和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能。（P77）6.Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理是什么？（P77相關信息）_______________________________________________________________________________________________________________________。7.為什么Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生危害？（P77相關信息）_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。8.獲取目的基因的方法：__________、_______________、_______________。（P82）9.PCR的概念：PCR是_______________的縮寫，它是一項根據_______________的原理，在體外提供__________的各種組分與反應條件，對________________________________________________進行大量復制的技術。（P77）（1）全稱：____________________。（2）原理：____________________。（3）操作環(huán)境：______________________________。（4）目的：________________________________________。（5）優(yōu)點：_____________________________________________。10.PCR由__________等人于1985年發(fā)明，并于1993年獲得諾貝爾化學獎。（P77）11.條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結合的2種_____、四種_______________、______________________________。（P77）12.PCR的過程：目的基因DNA受熱變性后解為_____，_____與單鏈相應_____結合；然后以單鏈DNA為模板在（耐高溫的）__________作用下進行延伸，即將4種脫氧核苷酸加到_______________，如此重復循環(huán)多次。每次循環(huán)一般可以分為_____、_____、_____三步。（P77）(1)變性：溫度上升到90℃以上，目的基因DNA____________________。該過程中打開的是哪種化學鍵是__________。（P78）(2)復性：溫度下降到50℃左右時，__________通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。該過程堿基互補配對的一定是引物與模板鏈嗎？_____________________________________________________。（P78）(3)延伸：溫度上升到72℃左右時，溶液中_________________________在耐高溫的____________________的作用下加到引物的_____端合成子鏈。（P78）(4)重復循環(huán)多次。(5)結果：呈_____形式擴增（n次擴增循環(huán)后，DNA數量約為2n)。13.為什么呈指數形式擴增？________________________________________________________________________________________________________________________。14.DNA體內復制解旋條件為__________，PCR解旋條件為_______________.15.DNA體內復制合成DNA子鏈需要_______________催化，PCR合成DNA子鏈需要________________________________________催化。16.PCR的擴增緩沖液中一般含有_____作用為_______________。（P77相關信息）17.PCR中復制的原料實際為_____（_____、_____、_____、_____）除作為原料，還可以______________________________。因此，PCR反應體系中_____添加ATP。18.引物是一小段能DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的__________。（P77相關信息）*體內復制的引物為RNA單鏈，PCR中的引物一般為DNA單鏈。19.引物的作用：_____________________________________________。（P77）20.為什么需要引物？__________________________________________________________________________________________________________________________________21.兩種引物都結合在DNA模板鏈的_____端，脫氧核苷酸連接在引物的_____端進行延伸。22.DNA新鏈延伸的方向為_________________________。（P78圖）23.DNA復制需要一定的液體環(huán)境和pH，PCR中由_______________提供。24.PCR的產物通常采用____________________來鑒定。（P79）思考：用PCR可以擴增mRNA嗎？_________________________________________________________________。（1）逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNADNA雜交分子；（2）核酸酶H降解RNADNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；（3）以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA。引物（1）設計引物的依據是：________________________________________。（2）引物設計時既要考慮目的基因序列，又要考慮載體序列，原因是：_________________________________________________________________________。（3）使用的一對引物的序列相同嗎？____________________________________________________________。*兩種引物才能確保DNA的兩條鏈同時被擴增（4）引物設計的要求（或引物失效的原因）a._______________________________________________________。b._______________________________________________________。（5）每種引物內部不能發(fā)生局部堿基互補配對的原因：_______________。（6）兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補配對的原因：________________________________________________________________________________。（8）引物長度一般為__________個核苷酸，若引物長度過短，則______________________________________________________________________。PCR與體內DNA復制的比較：PCR技術DNA復制相同點原則條件DNA母鏈作為模板、引物、4種脫氧核苷酸為原料（實為dNTP）延伸方向新鏈都是從5’端向3’端延伸不同點解旋方式場所體內主要在細胞核延伸用酶DNA聚合酶溫度控制溫度，需要在不同溫度下進行（90℃以上變性、50℃左右復性、72℃左右延伸）體內溫和條件過程結果大量的DNA片段（目的基因）25.基因文庫分為兩類：__________和____________________。（P82）26.cDNA文庫比基因組文庫_____；cDNA文庫中的基因_____啟動子、終止子和內含子；基因組文庫中的基因_____啟動子、終止子和內含子。27.cDNA概念：某種生物發(fā)育的某個時期的_______________產生的多種互補DNA片段。28.形成cDNA的過程中需要__________酶。29.真核生物的cDNA為什么沒有內含子和啟動子？cDNA是由生物發(fā)育的_______________產生的DNA片段，啟動子位于________，不會轉錄形成mRNA的片段，而_____轉錄之后，會經后期加工，其對應的RNA序列會被剪切掉，因此在________________________________________，那么經過逆轉錄得到的DNA中，也就沒有相應的序列。30.為什么cDNA文庫中含有的基因數目比基因組文庫中的少？___________________________________________________________________________________________________________________。31.利用化學方法合成DNA需要儀器為__________；要求基因的核苷酸序列_____；該過程__________模板。二、基因表達載體的構建1.地位：基因表達載體的構建這一步是基因工程的_____工作。（P80）2.構建基因表達載體的目的：(1)使目的基因在受體細胞中_______________，并且可以__________給下一代。(2)使目的基因能夠_____和發(fā)揮作用。（P80）3.基因表達載體的組成：基因表達載體必須包括__________、__________、_____、__________等（若需要能完成自主復制，還應有__________）。4.啟動子：（P80）（1）本質：一段有特殊序列結構的_____片段。（2）位置：_____________________________________________。（3）功能：__________________________________________________。（4）特殊類型：____________________。（5）誘導型啟動子的特點：___________________________________。5.終止子：（P80）（1）本質：一段有特殊序列結構的_____片段。（2）位置：位于基因的_____。（3）功能：___________________________________。6.標記基因（1）作用：___________________________________。（2）常見類型___________________、____________________等7．基因表達載體的構建過程：首先用一定的__________切割載體，使它出現(xiàn)一個切口；然后用_____限制酶或_______________的限制酶切割目的基因的DNA片段（使之產生_______________）；再利用__________將目的基因片段拼接到載體的切口處。這樣就形成了一個_______________。（P80）8.切割載體和切割含有目的基因的DNA片段的限制酶為什么應為同種限制酶或能產生相同末端的限制酶？_____________________________________________。9.用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，一定會形成重組DNA分子嗎？________________________________________。10.用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，可能有幾種產物？自連（____________________、____________________）兩兩連接（_________________、_______________、____________________）。11.用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，形成的“載體目的基因”產物一定符合要求嗎？______________________________________________。12.如何避免上述問題？_____________________________________________。13.將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？_________________________________________________________________。14.由于不同轉基因產品所需要的_____基因不同，受體細胞又有_____、_____、微生物之分，因此基因表達載體的構建方法____________________的,將目的基因導入受體細胞的方法也不是完全相同的。三、將目的基因導入受體細胞1．目的基因導入受體細胞的方法(1)目的基因導入植物細胞（P80）①____________________Ⅰ.用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入_____中。Ⅱ.在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借_______________進入_____。=3\*ROMANIII.花粉管通道法的受體細胞：_____。=4\*ROMANIV.花粉管通道法的地位：________________________________________。②_______________（P81資料卡）轉化：目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內__________和_____的過程。Ⅰ.農桿菌的特點：農桿菌自然條件下侵染__________植物和_____植物，而對大多數_______________沒有侵染能力；農桿菌細胞內含有__________，當它侵染植物細胞后，能將__________上的__________（可轉移的DNA）轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的_______________上。（P81）Ⅱ.農桿菌轉化法的實驗思路（過程）：將目的基因插入Ti質粒的__________中，通過農桿菌的_____作用，就可以使目的基因進入植物細胞，（P81）并整合到受體細胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持_____和_____。=3\*ROMANIII.農桿菌轉化法的過程經過的兩次拼接、兩次導入：第一次拼接：____________________________________。第二次拼接：_____________________________________________________________________。第一次導入：____________________________________。第二次導入：____________________________________。=4\*ROMANIV.農桿菌轉化法的兩種具體操作a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片(即__________）與農桿菌共培養(yǎng)，然后篩選__________，并再__________；*受體細胞為__________。b.可以將花序直接_____在含有農桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)_____并獲得種子，再進行_____、_____等；*受體細胞為__________。(2)目的基因導入動物細胞時，受體細胞為__________.為什么選擇該細胞？____________________________________________________________。（P82）①常用方法：__________法。②將目的基因導入受精卵后，還要經過_______________、_______________才能夠獲得具有新性狀的動物。=3\*GB3③獲得的動物具有新性狀是因為產生了新基因嗎？_____。(3)目的基因導入微生物細胞時，常用__________作為受體細胞，其中以____________________最廣泛。（P82）①Ca2+處理法（感受態(tài)細胞法）的一般過程：先用_____處理大腸桿菌細胞，使細胞處于一種_____________________________________________的生理狀態(tài)，然后將___________________________________導入其中。②原核生物的優(yōu)點（為什么選擇原核生物作為受體細胞）。____________________________________________________________。=3\*GB3③Ca2+的作用：__________________________________________________。=4\*GB3④什么是感受態(tài)：__________________________________________________。=5\*GB3⑤以四環(huán)素抗性基因為標記基因，可以把表達載體導入具有四環(huán)素抗性的大腸桿菌中嗎？_____。思考：當真核生物的基因以原核生物作為受體細胞時：1.若無法獲得該蛋白，原因可能是什么？___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。2.以上情況如何解決？___________________________________________________________________________________________________。3.若可以獲得該蛋白，但是蛋白質無活性，原因可能是？_____________________________________________________________________________________。4.以上情況如何解決？_____________________________________________。四、目的基因的檢測與鑒定1.標記基因篩選呈陽性一定能確定目的基因導入受體細胞了嗎？____________________________________________________________。2.因此，針對目的基因僅僅通過標記基因篩選是不夠的，還需要進行____________________和______________________________。（P82）3.目的基因的檢測與鑒定的目的：（1）檢查目的基因進入受體細胞后，______________________________。（2）檢查_____________________________________________。（P82）4．分子水平檢測的內容：(1)通過___________________________________檢測受體細胞染色體DNA上是否插入了__________或檢測目的基因是否_______________。（P82）(2)從轉基因生物中提取蛋白質用相應的抗體進行____________________雜交，檢測目的基因是否翻譯成了__________。補充了解—抗原抗體雜交技術從轉基因棉花中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質。5．個體生物學水平鑒定的內容：_______________________________________________________________________________________________。轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物補充思考：以上幾種方法的順序是如何的？補充了解—分子雜交技術在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因插入成功或轉錄出mRNA。補充思考：如何利用PCR技術檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否轉錄出mRNA？（1）_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________；（2）_____________________________________________________________________________________________________________________________。探究：DNA片段擴增及電泳鑒定（P84）1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理（1）PCR利用了DNA的__________原理，通過__________來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控_____的儀器。（2）PCR擴增DNA片段還利用了_________________________的原理。（3）一次PCR一般要經歷_____次循環(huán)。2.DNA熱變性的難易程度跟DNA分子中具有_____個氫鍵的GC堿基對的比例有關，該比例越高，DNA熱穩(wěn)定性越高，越_____熱變性。3.一般在PCR實驗中引物的添加量_____實際所需量。原因：____________________________________________________________。能任意增大添加量嗎？_____。4.DNA片段電泳鑒定的原理：（P84）（1）DNA分子具有_______________，在一定的__________下，這些基團可以帶上_______________，在_____的作用下，這些__________會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是_____。（2）PCR的產物一般通過_________________________來鑒定。（3）在凝膠中DNA分子的遷移速率與__________、____________________________________________________________等有關；（4）凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為_____的_______下被檢測出來.5.按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分后，要進行_____越10s，目的是：___________________________________________________________________________。（P84）6.說出發(fā)揮以下作用的工具（1）自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增：__________。（2）實際進行PCR反應的場所：_______________。（3）向微量離心管轉移PCR配方中的液體：_______________。（P85）7.PCR時根據目的片段長度適當調整_____時間。8.預變性條件_______________。預變性目的_____________________________________________。（P85）9.配制瓊脂糖溶液：根據待分離DNA片段的_____，用_______________配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比__________的瓊脂糖溶液。（P85）10.DNA分子通過_______________進行染色。11.插入梳子的目的：_______________。（P85）12.電泳緩沖液加入電泳槽并沒過凝膠1mm應在加樣_____進行。（P85）13.對照組設置：______________________________