學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專(zhuān)精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專(zhuān)精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專(zhuān)精第一節(jié)基因工程的原理1．簡(jiǎn)述基因工程的誕生。2．簡(jiǎn)述基因工程的原理及技術(shù).3．嘗試DNA的提取與鑒定.一、基因工程的誕生1．限制性?xún)?nèi)切酶——“基因手術(shù)刀”（1）作用：能夠識(shí)別特定的脫氧核苷酸序列,并于特定位點(diǎn)上準(zhǔn)確地切割雙鏈DNA。（2）結(jié)果:形成DNA黏性末端。2．DNA連接酶—-“基因縫紉針”(1）作用:將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)，修復(fù)被限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)的切口，拼接成新的DNA分子.（2)種類(lèi)：T4DNA連接酶(把限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)的黏性末端的縫隙“縫合”起來(lái))。思考將人的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，大腸桿菌能夠生產(chǎn)人的胰島素，在基因操作中把人的基因與大腸桿菌的基因“縫合”起來(lái)的工具是什么？提示:DNA連接酶。二、基因工程的一般程序1．基因工程的概念基因工程是指按照人們的意愿，將一種生物的基因在體外剪切，并與特殊的運(yùn)載工具進(jìn)行重新組合，然后轉(zhuǎn)入另一種生物的體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并使之表達(dá)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的技術(shù)。2．基因工程的操作程序（1）DNA分子的提取。(2）目的基因的獲得.①直接分離法:最常用的方法是“鳥(niǎo)槍法”,又稱(chēng)“霰彈法”。用限制性?xún)?nèi)切酶（子彈）切割DNA，再用“核酸探針"（用放射性同位素或其他標(biāo)記物標(biāo)記的RNA單鏈）檢測(cè)出目的基因，再用PCR儀擴(kuò)增DNA,獲得大量的目的基因。②人工合成法：一種是反轉(zhuǎn)錄法。它是以目的基因的信使RNA為模板，借助反轉(zhuǎn)錄酶合成堿基互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA.另一種方法是化學(xué)合成法。即依照某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，通過(guò)密碼子推導(dǎo)出其堿基序列,然后直接合成目的基因。（3）重組載體的構(gòu)建。①載體的特點(diǎn):外源DNA的插入不影響載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的自我復(fù)制；有適宜的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn);具有某些標(biāo)記基因；載體應(yīng)對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害。②載體的種類(lèi)。a．質(zhì)粒：它是細(xì)菌中獨(dú)立于細(xì)菌DNA之外的小型環(huán)狀DNA分子。它含有一個(gè)至多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶切割位點(diǎn)，供外源基因插入其中,并帶有特殊的遺傳標(biāo)記基因，是基因工程中最常用的載體。b．噬菌體或其他一些病毒。（4）重組載體的導(dǎo)入和篩選。①轉(zhuǎn)化:將帶有目的基因的重組載體與相應(yīng)的受體細(xì)胞放在一起培養(yǎng)，通過(guò)一定的方式誘導(dǎo),它們會(huì)進(jìn)入受體細(xì)胞，這一過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)化.②轉(zhuǎn)化的方法:基因槍法（被子植物）、花粉管通道法、顯微注射法（動(dòng)物）。③篩選：利用選擇培養(yǎng)基把轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇出來(lái)。（5）目的基因的表達(dá)和鑒定：檢測(cè)轉(zhuǎn)化的生物有沒(méi)有顯示出目的基因控制的性狀。思考如何檢測(cè)抗蟲(chóng)棉中的毒蛋白基因是否表達(dá)？提示：讓棉鈴蟲(chóng)去食抗蟲(chóng)棉，若棉鈴蟲(chóng)食后死亡，說(shuō)明毒蛋白基因表達(dá)。三、基因工程的意義基因工程能夠打破生物種屬的界限,在分子水平上定向改變生物的遺傳特性。四、探究活動(dòng)：嘗試DNA的提取與鑒定1．實(shí)驗(yàn)原理（1）SDS能夠使蛋白質(zhì)變性,在研磨液中加入SDS可以使DNA與蛋白質(zhì)分離；EDTA是DNA酶的抑制劑,可以防止細(xì)胞破碎后DNA分子被降解。（2）DNA不溶于酒精溶液,但細(xì)胞中的許多其他物質(zhì)可以溶于酒精溶液。利用這一原理可以提取含雜質(zhì)較少的DNA。（3）DNA遇二苯胺（沸水浴）會(huì)染成藍(lán)色，故該試劑可以作為鑒定DNA的試劑。2．實(shí)驗(yàn)步驟（1）DNA的粗提?。翰牧蠝?zhǔn)備→研磨→過(guò)濾→離心→加冷酒精→提取DNA.（2）DNA的鑒定：提取的DNA＋物質(zhì)的量濃度為0.015mol/L的NaCl溶液5mL＋4mL二苯胺試劑藍(lán)色。1．基因工程的原理及其分析基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型或生物產(chǎn)品.（1）原理：按照人們的意愿，將一種生物的某種基因在體外剪切,并加以修飾改造，然后轉(zhuǎn)移到另一種生物的體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并使之表達(dá)產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì).（2）原理分析：基因工程的別名DNA重組技術(shù)和基因拼接技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對(duì)象基因操作水平DNA分子水平基本操作過(guò)程剪切→改造修飾和拼接→導(dǎo)入→表達(dá)結(jié)果定向改造生物性狀，獲得人類(lèi)需要的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品（1）基因拼接成功的原因：①DNA的空間結(jié)構(gòu)均為規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)；②DNA的基本組成單位都是脫氧核苷酸;③都遵循相同的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。（2）基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成功的原因：①基因是決定生物性狀的獨(dú)立遺傳單位;②幾乎所有的生物都共用一套遺傳密碼.2．限制性?xún)?nèi)切酶的作用分析（1）生理作用：在微生物體內(nèi)主要切割外源DNA,而對(duì)自身DNA不起作用，從而保護(hù)自身，免受外源DNA入侵.在基因工程中可用于切割目的基因和載體。（2）作用部位：兩個(gè)核苷酸之間形成的磷酸二酯鍵。（3）作用結(jié)果:產(chǎn)生互補(bǔ)的黏性末端或平末端.（4）作用特點(diǎn)：識(shí)別特定的核苷酸序列并在特定的位點(diǎn)上進(jìn)行切割.該酶識(shí)別的切割部位一般具有沿中軸線兩側(cè)反向?qū)ΨQ(chēng)重復(fù)序列,即一條鏈正向讀的堿基序列與另一條鏈反向讀的堿基序列完全一致。切割方式舉例如下:3．DNA連接酶與DNA聚合酶的區(qū)別DNA連接酶與DNA聚合酶作用的實(shí)質(zhì)都是形成磷酸二酯鍵，其區(qū)別表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:（1）作用對(duì)象不同.DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸連接到單鏈DNA分子片段中；DNA連接酶則是連接兩個(gè)雙鏈DNA片段。（2）是否需要模板。DNA聚合酶作用時(shí)以一條DNA鏈為模板,將單個(gè)脫氧核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶連接兩個(gè)DNA片段時(shí)，不需要模板DNA。(3）組成和性質(zhì)不同。兩者雖然都為蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但在分子結(jié)構(gòu)和組成上不同.①基因操作的工具酶包括限制性?xún)?nèi)切酶和DNA連接酶。②限制性?xún)?nèi)切酶的特點(diǎn)是能夠?qū)Ｒ蛔R(shí)別特定的核苷酸序列,有特定的酶切位點(diǎn)，切割酶切位點(diǎn)間的磷酸二酯鍵.切割DNA產(chǎn)生兩種末端,一種是互補(bǔ)的黏性末端，另一種是平末端。③DNA連接酶是連接DNA兩條主鏈上酶切位點(diǎn)間的磷酸二酯鍵的工具。4．基因工程中使用載體的目的和要求(1）在基因工程中使用載體的目的。①作為運(yùn)載工具，將目的基因運(yùn)送到受體細(xì)胞中去。②利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制和穩(wěn)定保存。(2)作為載體必須具備的條件。①對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，不影響受體細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。②具有自我復(fù)制能力，或整合到受體細(xì)胞DNA上隨受體細(xì)胞DNA的復(fù)制而同步復(fù)制.③具有一個(gè)至多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體中。④帶有遺傳標(biāo)記基因,以便重組后對(duì)其進(jìn)行篩選。⑤載體DNA分子大小適合，以便于提取和體外操作。(3）載體的種類(lèi)。常用載體為質(zhì)粒，除此之外，噬菌體、其他一些病毒也可作為基因工程中的載體.現(xiàn)在人們?nèi)栽诓粩鄬ふ倚碌妮d體，線粒體和葉綠體DNA呈環(huán)狀，也有可能作為載體。載體中供目的基因插入的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的位置應(yīng)在載體本身必需的重要基因之外,這樣才不至于因外源基因的插入而失活.5．DNA粗提取實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵及注意事項(xiàng)(1)在破碎細(xì)胞釋放DNA的過(guò)程中,若是血細(xì)胞，加水后必須充分?jǐn)嚢?，不?yīng)少于5min;若是菜花,則應(yīng)與研磨液混合，研磨時(shí)間不少于10min.(2）用冷酒精濃縮和沉淀DNA時(shí)，所用的是體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精，且必須經(jīng)過(guò)充分預(yù)冷后才能使用.（3）在用玻璃棒攪拌時(shí)，玻璃棒不能直接插入燒杯底部，并且攪拌要輕緩，以便獲得較完整的DNA分子.（4）由于玻璃表面帶電荷，DNA中的磷酸基也帶電荷而容易被吸附于玻璃表面,故實(shí)驗(yàn)中用塑料杯和試管可減少DNA損失。題型一基因工程的概念【例1】(2010·全國(guó)高考理綜Ⅱ改編)下列敘述符合基因工程概念的是()A．B淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合后的細(xì)胞中含有B淋巴細(xì)胞中的抗體基因B．將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒后導(dǎo)入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株C．用紫外線照射青霉菌，使其DNA發(fā)生改變,通過(guò)篩選獲得青霉素高產(chǎn)菌株D．自然界中天然存在的噬菌體自行感染細(xì)菌后其DNA整合到細(xì)菌DNA上解析：基因工程是指按照人們的意愿，將一種生物的基因在體外剪切，并與特殊的運(yùn)載工具進(jìn)行重新組合，然后轉(zhuǎn)入另一種生物的體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并使之表達(dá)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的技術(shù)。B淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，不屬于基因工程，用紫外線照射青霉菌，使其DNA發(fā)生改變，進(jìn)而篩選出青霉素高產(chǎn)菌株，屬于人工誘變;自然界中天然存在的噬菌體自行感染細(xì)菌后其DNA整合到細(xì)菌DNA上，并沒(méi)有進(jìn)行人為的加工,不屬于基因工程。答案：B反思領(lǐng)悟：基因工程能定向地改造生物的遺傳性狀。題型二基因操作的工具【例2】用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述不正確的是（)A．常用相同的限制性?xún)?nèi)切酶處理目的基因和質(zhì)粒B．DNA連接酶和RNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必需的工具酶C．可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測(cè)大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒D．導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達(dá)解析：要使大腸桿菌生產(chǎn)人的蛋白質(zhì)，就要通過(guò)基因工程的方法,把人的蛋白質(zhì)基因與載體（質(zhì)粒）結(jié)合形成重組DNA,然后導(dǎo)入大腸桿菌，人的蛋白質(zhì)基因在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)，合成人的蛋白質(zhì)。獲得人的蛋白質(zhì)基因，以及把人的蛋白質(zhì)基因與載體結(jié)合,都要用到“基因手術(shù)刀”——限制性?xún)?nèi)切酶，而且要用同一種限制性?xún)?nèi)切酶,這樣切出的黏性末端可以互補(bǔ)配對(duì).然后用DNA連接酶連接，形成重組DNA。所以基因工程的工具酶是限制性?xún)?nèi)切酶和DNA連接酶。作為載體的基本條件之一是必須有標(biāo)記基因（如抗生素基因)以便檢測(cè)和篩選含目的基因的大腸桿菌。導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因可能不表達(dá)。答案：B反思領(lǐng)悟：作為基因工程的載體必須具備的條件是:（1）能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制.（2)有多個(gè)酶切位點(diǎn)，以便與外源基因連接。（3)具有某些標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選。（4）能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)“友好借居”,不影響宿主細(xì)胞的生命活動(dòng)。題型三目的基因的獲取【例3】在已知某小片段基因堿基序列的情況下，獲得該基因的最佳方法是（)A．用mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成DNAB．以4種脫氧核苷酸為原料人工合成C．將供體DNA片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中,再進(jìn)一步篩選D．由蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測(cè)mRNA的核苷酸序列解析:現(xiàn)在已知的條件就是某小片段基因的堿基序列，所以可以用4種脫氧核苷酸為原料來(lái)人工合成該基因.答案：B反思領(lǐng)悟:合成目的基因的方法主要有直接分離法和人工合成法。最常用的直接分離法是“鳥(niǎo)槍法”；人工合成目的基因的方法主要有兩種：反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。1在基因工程中用到的限制性?xún)?nèi)切酶主要從原核生物中獲得，一種限制性?xún)?nèi)切酶只能識(shí)別雙鏈DNA某種特定核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子，這與酶的什么性質(zhì)相吻合(）A．高效性B．具有多樣性C．專(zhuān)一性D．催化活性受外界條件影響解析：一種限制性?xún)?nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子,這顯然和酶的專(zhuān)一性相吻合。答案:C2（2010·浙江高考理綜改編）在用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗除草劑的轉(zhuǎn)基因煙草過(guò)程中，下列操作錯(cuò)誤的是(）A．用限制性?xún)?nèi)切酶切割煙草花葉病毒的核酸B．用DNA連接酶連接經(jīng)切割的抗除草劑基因和載體C．將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞D．用含除草劑的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞解析:構(gòu)建抗除草劑的煙草要用限制性?xún)?nèi)切酶切割雜草中含抗除草劑基因的DNA與