ICS07.080

CCSC04

團體標準

T/XXXXXXX—XXXX

IPSC來源肝前體細胞制備及質(zhì)量鑒定規(guī)范

SpecificationforpreparationandqualityidentificationofIPSCderivedliver

precursorcells

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

中國國際經(jīng)濟技術(shù)合作促進會發(fā)布

T/XXXXXXX—XXXX

IPSC來源肝前體細胞制備及質(zhì)量鑒定規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了IPSC來源肝前體細胞的術(shù)語和定義、基本要求、制備過程、質(zhì)量鑒定。

本文件適用于IPSC來源肝前體細胞的制備與質(zhì)量鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標準

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB50073潔凈廠房設計規(guī)范

GB50346生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范

GB50591潔凈室施工及驗收規(guī)范

3術(shù)語和定義、縮略語

術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1.1

誘導多能干細胞inducedpluripotentstemcell；IPSC

由人體細胞經(jīng)重編程而獲得的具有自我更新能力和向三胚層細胞分化潛能的一種干細胞。

3.1.2

凍存cryopreservation

經(jīng)過程序降溫冷凍，并利用深低溫冷凍儲存技術(shù)，以減少細胞代謝活動，保存細胞生物學活性。

3.1.3

復蘇thawing

細胞從脫離生長狀態(tài)重新獲得生長活力的過程。

3.1.4

細胞活率cellviability

能夠增值、保持正常代謝活性的細胞占全部細胞的百分比。

縮略語

下列縮略語適用于本文件。

HAV：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

IPSC：誘導多能干細胞（InducedPluripotentStemCell）

4基本要求

場地與設施

1

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4.1.1IPSC來源肝前體細胞制備機構(gòu)選址應符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，空氣質(zhì)量標準應符

合GB3095標準分級二級標準。

4.1.2IPSC來源肝前體細胞制備機構(gòu)實驗室或廠房應由具有潔凈實驗室設計建設資質(zhì)的工程公司設

計與建造，并應符合GB19489、GB50073、GB50346和GB50591的規(guī)定。建設完成后，各功能區(qū)域的

潔凈級別應由專業(yè)機構(gòu)進行檢測并出具合格證明。

4.1.3干細胞制備功能區(qū)應按IPSC來源肝前體細胞制備工藝進行各區(qū)域設計，符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管

理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則》要求。干細胞制備機構(gòu)應配備獨立質(zhì)量檢測

實驗室，并符合GB19489和GB50346的規(guī)定。

設備和耗材

4.2.1IPSC來源肝前體細胞的制備機構(gòu)應優(yōu)先選用符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)

量控制及臨床前研究指導原則》要求，獲得國家資質(zhì)認證的設備、儀器、耗材和試劑。

4.2.2IPSC來源肝前體細胞的制備機構(gòu)應對設備、儀器、耗材和試劑供應商進行資質(zhì)審核認證，要求

供應商提供產(chǎn)品質(zhì)量報告和批次檢驗報告，并對耗材及試劑進行質(zhì)量抽檢，避免采購質(zhì)量不合格的產(chǎn)品。

4.2.3IPSC來源肝前體細胞的制備機構(gòu)設備和儀器正式使用前應做安裝確認(IQ)、運行確認（OQ）和

性能確認(PQ)，并定期進行第三方校準，不得使用有安全隱患的儀器操作樣本及細胞制品。

4.2.4IPSC來源肝前體細胞的制備機構(gòu)應對設備與儀器進行編號建檔，并建立標準操作流程(SOP)，

確保使用、運行、保養(yǎng)、維修記錄完整可追溯，對于關鍵工藝相關設備參數(shù)應進行實時監(jiān)測，及時對狀

態(tài)異常的設備進行校對和維修。

人員管理

4.3.1IPSC來源肝前體細胞制備機構(gòu)應分別設立干細胞制備負責人、質(zhì)量管理負責人和質(zhì)量授權(quán)人崗

位。由法人授權(quán)任命，任職資質(zhì)應符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研

究指導原則》要求，定期接受崗位專業(yè)培訓，制備技術(shù)負責人與質(zhì)量管理負責人、質(zhì)量授權(quán)人不得相互

兼任。

4.3.2IPSC來源肝前體細胞制備和質(zhì)控技術(shù)人員應具備的健康要求：HAV、HBV、HCV、HIV及梅毒的抗

體檢測應為陰性，并且(矯正)視力正常，無色盲、色弱。

4.3.3IPSC來源肝前體細胞制備和質(zhì)控技術(shù)人員應半年接受體檢一次，有呼吸道感染或發(fā)熱等疾病狀

態(tài)下不得進入潔凈操作區(qū)，需完全康復后方可恢復崗位操作。

4.3.4IPSC來源肝前體細胞制備和質(zhì)控技術(shù)人員上崗前應經(jīng)過專業(yè)培訓，內(nèi)容包括但不限于干細胞理

論與實踐、生命倫理、干細胞法律法規(guī)、GMP管理、GCP資質(zhì)、制劑基本知識、細胞培養(yǎng)基礎、生物安

全、儀器設備使用與維護方法、物料管理與清潔衛(wèi)生、崗位職責、操作規(guī)范等內(nèi)容。

5制備過程

樣本采集

5.1.1選擇適當?shù)某赡旮渭毎麃碓醋鳛槠鹗疾牧现苽銲PSC來源肝前體細胞。

5.1.2樣本的采集應在指定的取得《醫(yī)療機構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證》的醫(yī)療機構(gòu)進行。

5.1.3樣本采集應符合醫(yī)學倫理的相關要求，獲取其供者或法定代表人、監(jiān)護人的同意和授權(quán)，并簽

署知情同意書。

5.1.4應建立合適的供者篩選標準，至少應包括既往病史和家族病史的調(diào)查、傳染性疾病的結(jié)果、近

期旅行或居住史調(diào)查和當前健康狀況報告。供者篩選宜參考GB18467相關要求。

5.1.5樣本采集過程應采取措施保護供者的健康和安全，并通過無菌技術(shù)最大限度降低污染、感染和

病原傳播的風險。采集用的接觸采集物的試劑和物料應無菌、符合臨床安全標準，且在有效期內(nèi)使用。

細胞培養(yǎng)

5.2.1細胞培養(yǎng)基的選擇

2

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5.2.1.1細胞培養(yǎng)基的成分：細胞培養(yǎng)基的成分應包括適當?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)、生長因子、抗生素和其他必

要的添加劑，以支持細胞的健康生長。

5.2.1.2細胞培養(yǎng)基的pH值和溫度：細胞培養(yǎng)基的pH值應在適宜的范圍內(nèi)維持，并且培養(yǎng)溫度應符

合細胞來源的要求。

5.2.1.3培養(yǎng)基的質(zhì)量控制：應定期檢測和確保細胞培養(yǎng)基的質(zhì)量，包括檢查細胞培養(yǎng)基的污染情況。

5.2.2細胞培養(yǎng)條件

5.2.2.1培養(yǎng)皿：選擇適當類型和規(guī)格的培養(yǎng)皿，以支持細胞的黏附和生長。

5.2.2.2培養(yǎng)環(huán)境：維持適當?shù)募毎囵B(yǎng)環(huán)境，包括CO2濃度、濕度和氧氣濃度等。

5.2.2.3培養(yǎng)時間和傳代：定期更換培養(yǎng)基，并根據(jù)需要進行細胞傳代，以避免過度密度和細胞老化。

5.2.3細胞培養(yǎng)的記錄和文檔

5.2.3.1細胞培養(yǎng)記錄：詳細記錄每次細胞培養(yǎng)的信息，包括培養(yǎng)開始日期、細胞數(shù)量、培養(yǎng)基成分、

傳代信息等。

5.2.3.2細胞培養(yǎng)文檔：建立細胞培養(yǎng)的文檔記錄，包括培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法的詳細描

述。

5.2.3.3細胞培養(yǎng)的質(zhì)量控制：進行定期的細胞培養(yǎng)質(zhì)量控制，包括細胞健康狀態(tài)的評估、細胞的鑒

定和細胞培養(yǎng)的污染。

誘導因子選擇

5.3.1誘導因子的種類和特性

5.3.1.1多能性誘導因子：選擇適當?shù)亩嗄苄哉T導因子，如Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等，以確保細

胞能夠重編程為多能性干細胞。

5.3.1.2肝細胞分化誘導因子：在肝前體細胞誘導過程中，選擇適當?shù)母渭毎只T導因子，如HNF4

α、FOXA2、ALB等，以促進肝前體細胞向肝細胞的定向分化。

5.3.1.3誘導因子的濃度和添加時間：確定適宜的誘導因子濃度和添加時間，以最大程度地促進細胞

的轉(zhuǎn)化和分化，同時避免不必要的細胞應激。

5.3.2誘導因子的來源和純度

5.3.2.1誘導因子的來源：使用高質(zhì)量、來源可追溯的誘導因子，確保誘導因子不帶有潛在的細胞污

染或其他不良成分。

5.3.2.2誘導因子的純度：誘導因子應具有高純度，以減少不純物對細胞誘導和分化過程的干擾。

5.3.3誘導因子的質(zhì)量控制

5.3.3.1誘導因子的活性檢測：定期檢測誘導因子的活性，以確保其在細胞誘導過程中的有效性。

5.3.3.2誘導因子的質(zhì)量控制記錄：建立誘導因子的質(zhì)量控制記錄，包括批次信息、活性檢測結(jié)果和

使用情況。

細胞傳代

5.4.1傳代條件的確定

5.4.1.1傳代時間間隔：確定適宜的細胞傳代時間間隔，以維持細胞的健康狀態(tài)并避免過度密度。

5.4.1.2傳代液的配制：使用適當?shù)膫鞔簛矸蛛x和重新懸浮細胞，確保傳代液的成分和pH值適合細

胞的需求。

5.4.2傳代操作規(guī)程

5.4.2.1細胞分離：使用適當?shù)姆椒ê驮噭⒓毎麖呐囵B(yǎng)皿中分離，避免細胞聚集和損傷。

5.4.2.2細胞計數(shù)：在傳代過程中進行細胞計數(shù)，以確定傳代液中的細胞密度。

5.4.2.3傳代液的添加：將適量的傳代液添加到細胞中，確保細胞在傳代過程中獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)

和支持。

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5.4.2.4IPSC來源肝前體細胞傳代操作應嚴格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控

制及臨床前研究指導原則》要求，保證無外源微生物污染。

5.4.3細胞傳代記錄和文檔

5.4.3.1傳代記錄：記錄每次細胞傳代的信息，包括傳代日期、傳代液成分、細胞密度等。

5.4.3.2傳代文檔記錄：建立細胞傳代的文檔記錄，包括傳代操作規(guī)程、傳代液配方和傳代效果的評

估。

5.4.3.3傳代的質(zhì)量控制：進行定期的傳代質(zhì)量控制，包括檢查傳代后細胞的健康狀態(tài)和細胞數(shù)目。

細胞凍存

5.5.1IPSC來源肝前體細胞凍存操作應嚴格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細胞制劑質(zhì)量控制

及臨床前研究指導原則》要求，保證無外源微生物污染。

5.5.2經(jīng)制備數(shù)量達到凍存要求的IPSC來源肝前體細胞系可進行凍存操作，凍存細胞應加入適當?shù)?/p>

凍存保護液，遵循程序降溫原則，并在液氮中進行保存。

5.5.3凍存液成分應符合IPSC來源肝前體細胞分離與培養(yǎng)的基本要求，盡量采用國家已批準的臨床

級產(chǎn)品或藥品輔料，二甲基亞砜含量不得超過10%，如必須使用動物源性血清，應確保其無特定動物源

性病毒污染，嚴禁使用海綿狀腦病流行區(qū)來源的牛血清。

5.5.4凍存細胞應標明干細胞名稱、培養(yǎng)條件、代次、批次、操作人員、凍存日期等信息，并具有唯

一標識。

5.5.5液氮凍存應使用符合要求的液氮容器，氣相凍存，由專人負責，保證液氮充足，溫度恒定。

細胞復蘇

5.6.1將凍存管從冷凍罐中取出后，盡快放入37℃～42℃水浴鍋中，輕搖凍存管使其內(nèi)容物在3min

內(nèi)融化。用75%酒精擦拭凍存管外部后，將其移入無菌操作臺內(nèi)。

5.6.2將干細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基的離心管中進行離心，去除冷凍保護劑。離心后用完全培養(yǎng)基

重懸干細胞，并將細胞按密度接種于培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5.6.3復蘇后細胞的活率應不低于75%。復蘇后細胞的接種密度應適宜。

制劑制備

5.7.1復蘇檢測合格的工作庫細胞，按規(guī)定的接種密度進行接種、培養(yǎng)；融合度達到70%～90%時，按

規(guī)定的制劑類型制備成IPSC來源肝前體細胞制劑。

5.7.2按制劑質(zhì)量標準進行檢驗，檢驗合格后進行制劑放行。

6質(zhì)量鑒定

鑒定內(nèi)容

6.1.1細胞形態(tài)

應呈克隆團生長、克隆邊緣清晰、核質(zhì)比高、形態(tài)均一，克隆內(nèi)細胞與細胞之間接觸緊密。

6.1.2染色體核型

正常核型應為46，XY或46，XX。

6.1.3細胞存活率

未凍存細胞存活率≥90%，凍存復蘇后細胞存活率≥60%。

6.1.4細胞標志蛋白

細胞表面標志物SSEA3、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81中的任意兩個陽性率≥70.0%；細胞內(nèi)部標志

物OCT4陽性率≥70.0%、NANOG陽性率≥70.0%。

6.1.5畸胎瘤形成

4

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應具備在體內(nèi)形成具有三胚層結(jié)構(gòu)的畸胎瘤的能力。

6.1.6微生物

真菌、細菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP應為陰性。

檢驗方法

6.2.1細胞形態(tài)

體外二維培養(yǎng)條件下，使用倒置相差顯微觀察。

6.2.2染色體核型

按《中華人民共和國藥典》中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制”項檢測。

6.2.3細胞存活率

按附錄A進行檢測。

6.2.4細胞標志蛋白

按附錄B進行檢測。

6.2.5外源重編程基因

按附錄C進行檢測。

6.2.6畸胎瘤形成

按附錄D進行檢測。

6.2.7微生物

6.2.7.1真菌、細菌

按《中華人民共和國藥典》中“1101無菌檢查法”項檢測。

6.2.7.2支原體

按《中華人民共和國藥典》中“3301衣原體檢查法”項檢測。

6.2.7.3HIV

按WS293核酸法檢測。

6.2.7.4HBV

按WS299核酸法檢測。

6.2.7.5HCV

按WS213核酸法檢測。

6.2.7.6HTLV、EBV、HCMV

按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。

6.2.7.7TP

按WS273核酸法檢測。

6.2.7.8外源病毒因子檢測

按《中華人民共和國藥典》中“3302外源病毒因子檢查法”項檢測。

檢驗分類

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6.3.1批次質(zhì)量檢驗

IPSC來源肝前體細胞制備機構(gòu)應對同一生產(chǎn)周期、同一生產(chǎn)線、同一來源、同一代次、同一方法制

備出來的產(chǎn)品為一批，在同一批產(chǎn)品中隨機抽取3個最小包裝單元。制備機構(gòu)應對每批次產(chǎn)品進行質(zhì)量

檢驗，確保工藝和質(zhì)量穩(wěn)定合格。

6.3.2復核質(zhì)量檢驗

IPSC來源肝前體細胞制備機構(gòu)應對每一批次干細胞制劑單獨留樣保存，詳細記錄批號、代次、生產(chǎn)

日期、來源等信息。定期由國家或地方相關部門授權(quán)的專業(yè)細胞檢驗機構(gòu)或?qū)嶒炇疫M行IPSC來源肝前體

細胞制劑的質(zhì)量復核檢驗，并出具檢驗報告。復核質(zhì)量檢驗報告出具時間應在該批次IPSC來源肝前體細

胞制劑提出放行申請之前，并作為放行檢驗參考。

評價結(jié)論

6.4.1批次檢驗結(jié)果全部符合6.1的規(guī)定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則判為

不合格品。

6.4.2復核檢驗結(jié)果全部符合6.1的規(guī)定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則判為

不合格品。

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

細胞存活率檢測細胞計數(shù)法

A.1儀器和設備

A.1.1顯微鏡。

A.1.2血球計數(shù)板。

A.2試劑

除特別說明外，所用試劑均為分析純，檢測用水均為去離子水。

A.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。

A.2.2臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（A.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。

A.3檢測步驟

A.3.1細胞懸液制備

根據(jù)檢測需求，收集待檢測細胞，用磷酸鹽緩沖液(A.2.1)配制細胞懸液。

A.3.2細胞染色

按1：1的體積比將臺盼藍染液（A.2.2）與細胞懸液（A.3.1）混合均勻。

A.3.3細胞計數(shù)

將蓋玻片蓋在血球計數(shù)板（A.1.2）計數(shù)槽上，取10μL混合液（A.3.2）滴在一側(cè)計數(shù)室的蓋玻片

邊緣，另取10μL混合液，滴在另一側(cè)計數(shù)室的蓋玻片邊緣，使混合液充滿蓋玻片和計數(shù)板之間，靜置

30s，將計數(shù)板置顯微鏡（A.1.1）下對被染色的細胞和細胞總數(shù)分別進行計數(shù)。

按照步驟A.3.2～A.3.3再重復測定一個樣品。

A.3.4細胞存活率計算

細胞存活率按式（A.1）進行計算：

???

?=×100%··································································(A.1)

?

式中：

X——細胞存活率；

M——細胞總數(shù)；

S——染色的細胞數(shù)。

計算兩次計數(shù)細胞存活率結(jié)果的平均值，記為細胞平均存活率。

A.4精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

細胞標志蛋白檢測細胞流式分析

B.1儀器和設備

B.1.1流式細胞儀。

B.1.2水平離心機。

B.1.3電子天平。

B.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。

B.2.1氯化鈉（NaCl）：分析純。

B.2.2氯化鉀（KCl）：分析純。

B.2.3無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）：分析純。

B.2.4無水磷酸二氫鉀（K2HPO4）：分析純。

B.2.5多聚甲醛（PFA）：純度95%。

B.2.6氫氧化鈉（NaOH）：分析純。

B.2.7牛血清白蛋白(BSA)：純度≥98%。

B.2.8聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)。

B.2.9抗體。

B.2.10使用電子天平（B.1.3）稱量按照相應要求配制流式檢測所需的液體：洗滌液、固定液、封閉

通透液、抗體稀釋液。

B.3樣品制備和保存

B.3.1洗滌液和固定后的樣品于2℃～8℃保存。

B.3.2固定液放入分裝容器中，密封并標記，按照相關試劑使用說明保存。

B.3.3相關抗體按說明書保存。

B.4檢測步驟

B.4.1樣品準備和固定

收集單細胞，使用水平離心機（B.1.2）250g，離心3min。棄上清，加適量固定液冰上放置10min，

使用水平離心機（B.1.2）取適量洗滌液洗滌3次～5次，每次3min～5min。

B.4.2封閉和通透

用封閉通透液重懸細胞并把細胞分成兩等份，分別作為實驗組和同型對照抗體組，冰上孵育20min，

然后用洗滌液清洗一遍。

B.4.3抗體孵育

按照抗體說明書進行稀釋使用。

B.4.4過濾上機

用洗滌液重懸細胞，然后通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細胞儀（B.1.1）應用手冊上機檢

測。

B.4.5圈門設定原則

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首先根據(jù)顆粒度和透光性設門圈出目標細胞分群1，排除死細胞和其他雜細胞，然后根據(jù)同型對照

抗體組熒光強度，在分群1的基礎上畫出陽性細胞群2，排除沒有被熒光抗體標記的陰性細胞。同型對照

抗體組作為陰性對照。

B.5結(jié)果分析

得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。

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C

C

附錄C

（規(guī)范性）

外源重編程基因定量PCR法

C.1儀器和設備

定量PCR擴增儀。

C.2試劑

C.2.1商品化定量PCR擴增試劑盒。

C.2.2商品化基因組DNA提取試劑盒。

C.2.3目標基因PCR引物。

C.3檢測步驟

C.3.1提取樣品基因組DNA。按照試劑盒說明書進行。

C.3.2使用DNA定量標準品使用定量PCR擴增儀(C.1.1)進行定量PCR擴增，建立目標基因檢測標準曲

線。按照試劑盒說明書進行。

C.3.3使用樣品基因組DNA使用定量PCR擴增儀(C.1.1)進行定量PCR擴增，檢測目標基因濃度。按照試

劑盒說明書進行。

C.3.4參照標準曲線確定目標基因濃度。

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D

D

附錄D

（規(guī)范性）

分化潛能檢測畸胎瘤形成法

D.1儀器和設備

D.1.1血球計數(shù)板。

D.1.2顯微鏡。

D.1.3水平離心機。

D.1.4電子天平。

D.1.5包埋機。

D.1.6切片機。

D.1.7展片機。

D.1.8載玻片。

D.1.9蓋玻片。

D.1.10烘箱。

D.1.11通風櫥。

D.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。

D.2.1磷酸鹽緩沖液。

D.2.2消化酶。

D.2.34%臺盼藍染液。

D.2.4無水乙醇（C2H5OH）:分析純。

D.2.5二甲苯（C8H10）:分析純。

D.2.6石蠟（熔點60℃）。

D.2.74%多聚甲醛。

D.2.8蘇木素染液。

D.2.9伊紅染液。

D.2.10中性樹膠。

D.3檢測步驟

D.3.1細胞樣品的準備

D.3.1.1細胞消化

離心收集細胞于離心管中，用生理鹽水輕輕重懸細胞，避免形成氣泡或殘留細胞團塊。

D.3.1.2細胞計數(shù)

根據(jù)附錄A方法測定，計算細胞懸液活細胞濃度。

D.3.2細胞移植

用注射器將1×106～1×107個人誘導多能干細胞注射到6周齡～8周齡的免疫缺陷型小鼠皮下，或肌肉，

或睪丸白膜下的生精小管周隙，或腎背膜下等部位。

D.3.3畸胎瘤收樣及處理

D.3.3.1收樣

11

T/XXXXXXX—XXXX

人誘導多能干細胞注射約6周～10周后（確保畸胎瘤不超過荷載小鼠體重的15%）,對小鼠實施安樂

死。剝離受體小鼠上的畸胎瘤并進行切割（體積不大于5mm×5mm×2mm）,將畸胎瘤組織塊用4%多聚

甲醛進行4℃過夜固定。

D.3.3.2石蠟切片及HE染色

對上述固定好的樣本進行HE染色，鏡下觀察并拍照。

D.4結(jié)果分析

觀察到來源于3個胚層的組織，包括內(nèi)胚層來源的消化道上皮腺體樣組織、中胚層來源的軟骨組織，

以及外胚層來源神經(jīng)組織等，即證明所接種的人誘導多能干細胞具有體內(nèi)向3個胚層組織分化的多能

性。

12

T/XXXXXXX—XXXX

參考文獻

[1]干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則（試行）（國衛(wèi)辦科教發(fā)〔2015〕46號）

[2]WHO實驗室生物安全手冊(第三版)

[3]藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（衛(wèi)生部令第79號）

[4]中華人民共和國藥典（2020年版）

13

T/XXXXXXX—XXXX

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義、縮略語.................................................................1

4基本要求...........................................................................1

5制備過程...........................................................................2

6質(zhì)量鑒定...........................................................................4

附錄A（規(guī)范性）細胞存活率檢測細胞計數(shù)法............................................7

附錄B（規(guī)范性）細胞標志蛋白檢測細胞流式分析........................................8

附錄C（規(guī)范性）外源重編程基因定量PCR法..........................................10

附錄D（規(guī)范性）分化潛能檢測畸胎瘤形成法...........................................11

參考文獻.............................................................................13

I

T/XXXXXXX—XXXX

IPSC來源肝前體細胞制備及質(zhì)量鑒定規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了IPSC來源肝前體細胞的術(shù)語和定義、基本要求、制備過程、質(zhì)量鑒定。

本文件適用于IPSC來源肝前體細胞的制備與質(zhì)量鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標準

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB50073潔凈廠房設計規(guī)范

GB50346生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范

GB50591潔凈室施工及驗收規(guī)范

3術(shù)語和定義、縮略語

術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1.1

誘導多能干細胞inducedpluripotentstemcell；IPSC

由人體細胞經(jīng)重編程而獲得的具有自我更新能力和向三胚層細胞分化潛能的一種干細胞。

3.1.2

凍存cryopreservation

經(jīng)過程序降溫冷凍，并利用深低溫冷凍儲存技術(shù)，以減少細胞代謝活動，保存細胞生物學活性。

3.1.3

復蘇thawing

細胞從脫離生長狀態(tài)重新獲得生長活力的過程。

3.1.4

細胞活率cellviability

能夠增值、保持正常代謝活性的細胞占全部細胞的百分比。

縮略語

下列縮略語適用于本文件。

HAV：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

IPSC：誘導多能干細胞（InducedPluripotentStemCell）

4基本要求

場地與設施

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